CN116678978B - 川芎茶调散指纹图谱及化学成分含量测定方法的建立 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了川芎茶调散指纹图谱及化学成分含量测定方法的建立，步骤为：制备供试品溶液；制备对照品溶液；建立供试品的指纹图谱；建立对照品的色谱图；确定参照峰，并标定特征峰；对标定的特征峰进行定量分析。本发明提供的建立HPLC指纹图谱的方法可以同时测定升麻素苷、甘草苷、升麻素、5‑O‑甲基维斯阿米醇苷、洋川芎内酯I、亥茅酚苷、洋川芎内酯A和亥茅酚苷7种化学成分的含量，以达到仅能通过指纹图谱的手段定性和定量控制川芎茶调散的目的，所需时间短，效率高；获得的指纹图谱背景干净，各峰分离效果好，基线平稳，准确度良好，适于构建的川芎茶调散整方指纹图谱；定量方法精密度好、重复性强、稳定性高，加样回收率高，定量结果准确可靠。
Description
技术领域
本发明涉及川芎茶调散HPLC指纹图谱技术领域，尤其是涉及川芎茶调散指纹图谱及化学成分含量测定方法的建立。
背景技术
川芎茶调散为经典名方，来自《太平惠民合剂局方》，由川芎、羌活、细辛、白芷、荆芥、防风、薄荷、甘草八味饮片组成，为治风邪上犯，寒热头痛或头风疼痛之方，其成方制剂自《中国药典》1963年版开始收载并沿用至今。该方重用川芎为君，具有疏风止痛，活血通窍的作用；配以薄荷、荆芥疏风清利头目，羌活疏风解痉、白芷善于通窍止痛；细辛散寒，可治少阴经头痛，上述诸药均疏散各经风邪而止痛。
目前，对于川芎茶调散的研究多集中在临床应用以及不同剂型之间功效的比较，关于其质量标准的研究报道比较少见，公开报道中的检测指标均比较少，CN1739612A公开了用HPLC法以阿魏酸为指标对川芎茶调滴丸或微丸或微丸胶囊或胶囊或软胶囊进行含量测定，检测波长为295-355nm，不足以反映川芎茶调散的整体质量情况。指纹图谱能较为全面表征中药所含化学成分，现已成为中药质量全面控制的一种重要手段。梅基熊等于2012年对川芎茶调散颗粒进行了HPLC指纹图谱研究，以乙腈-0.05％甲酸溶液为流动相，梯度洗脱，检测波长为254nm，但其所建立的指纹图谱条件洗脱时间较长为135min，且检测指标少，只指认出了甘草酸铵。
发明内容
本发明的目的是提供川芎茶调散指纹图谱及化学成分含量测定方法的建立，以解决目前针对川芎茶调散整方的指纹图谱检测检测指标少、检测耗时长、整方成分定量少或无定量数据，不能较好反映川芎茶调散整体质量情况、缺乏整体疗效分析依据的问题。
为实现上述目的，本发明提供川芎茶调散指纹图谱及化学成分含量测定方法的建立，步骤如下：
S1、制备供试品溶液；
S2、制备对照品溶液；
S3、用高效液相色谱法建立供试品的指纹图谱；
S4、以步骤S3相同的方法建立对照品的色谱图；
S5、将步骤S3和S4获得的指纹图谱比对确定参照峰，并标定特征峰；
S6、对标定的特征峰进行定量分析。
优选的，所述步骤S1供试品溶液的制备方法为：
准确称取生川芎12g，白芷6g，羌活6g，细辛3g，防风4.5g，荆芥12g，薄荷24g以及甘草6g，加入10倍量水，浸泡25-35min后，武火煮沸，然后转文火煎煮18-25min，过滤得滤液I，向药渣中加入8倍量水，武火煮沸后，转文火煎煮10min，过滤，得滤液II，将滤液I和II合并，浓缩至100mL，准确量取10.0mL，13000r/min离心10min，取上清液，0.22μm滤头过滤即可。
优选的，所述步骤S2中对照品溶液为用甲醇溶解的升麻素苷、甘草苷、升麻素、5-O-甲基阿斯维米醇苷、洋川芎内酯I、亥茅酚苷、洋川芎内酯A的混合液，浓度分别为0.12、0.28、0.14、0.24、0.57、0.065、0.058mg/mL。
优选的，所述步骤S3中供试品指纹图谱的建立采用C18色谱柱，长度为25cm，粒径为5μm，内径为4.6mm；流动相为甲醇-乙腈-水，梯度洗脱，流速为0.7mL/min，柱温为30℃，检测波长为270-280nm，进样量为10μL。
优选的，所述流动相甲醇-乙腈的体积比为1:1，记为A，流动相水记为B，所述梯度洗脱程序为：0～6min，10％A；6～9min，10％～20％A；9～29min，20％～30％A；29～46min，30％～40％A；46～56min，40％～50％A；56～66min，50％～55％A；66～71min，55％～60％A；71～76min，60％～70％A；76～86min，70％～80％A；86～89min，80％～90％A；89～90min，90％A。
优选的，所述水为纯净水；所述指纹图谱为洗脱95min时记录的色谱图。
因此，本发明提供的川芎茶调散指纹图谱及化学成分含量测定方法的建立，其具体技术效果如下：
(1)应用本发明提供的流动相、洗脱条件、检测波长获得的指纹图谱背景干净，各峰分离效果好，基线平稳，精密度良好、重复性强、稳定性高，适于川芎茶调散整方指纹图谱的建立；并且大大减少了洗脱时间，可以显著提高检测效率；
(2)本发明提供的检测方法检测精密度良好、重复性强、稳定性高，加样回收率高，检测指标丰富，检测结果准确可靠，可对川芎茶调散的多种化学成分含量进行准确定量，对促进川芎茶调散整体质量的描述、评价以及该方的现代化具有重要意义，为后续该方的研究和新的应用奠定了基础。
下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
附图说明
图1是甲醇-水和乙腈-水流动相系统比较结果；
图2是乙腈与不同浓度酸流动相系统比较结果；
图3是本发明中建立的川芎茶调散的指纹图谱；
图4是本发明中对照品的色谱图；
图5是本发明定量时获得的各标准品的标准曲线图。
具体实施方式
以下通过附图和实施例对本发明的技术方案作进一步说明。
实施例中所用的饮片均购自北京本草方源药业有限公司，其中生川芎为伞形科植物川芎的干燥根茎，产地为四川，批号为20180526；羌活为伞形科植物羌活的干燥根茎，产地为四川，批号为20180307；白芷为伞形科植物白芷的干燥根，产地为四川，批号为20180308；细辛为马兜铃科植物北细辛的干燥根，产地为辽宁，批号为20180611；荆芥为唇形科植物荆芥的干燥地上部分，产地为河北，批号为20180330；防风为伞形科植物防风的干燥根，产地为内蒙古，批号为20180522；薄荷为唇形科植物薄荷的干燥地上部分，产地为江苏，批号为20180517；甘草为豆科植物甘草的干燥根茎，产地为甘肃，批号为20180615。
对照品均购自成都克洛玛生物有限公司，纯度为≥98％，其中升麻素苷的批号为CHB190103、甘草苷的批号为CHB140207、升麻素的批号为CHB190102、5-O-甲基维斯阿米醇苷的批号为CHB-J-065、洋川芎内酯I的批号为CHB180617、亥茅酚苷的批号为CHB-H-124、洋川芎内酯A的批号为CHB180615和亥茅酚苷的批号为CHB181130。
水为纯净水，购自杭州娃哈哈有限公司；甲醇和乙腈均购自赛默飞世尔科技中国有限公司，纯度为色谱纯。
高效液相色谱仪，由岛津公司生产，型号为LC-20A；超声波清洗器，由昆山市超声仪器有限公司生产，型号为KQ-300B；电子天平由上海精密科学仪器有限公司生产，型号为FA2204B；离心机由湖北赫西仪器装备有限公司生产，型号为TG16MW。
实施例一
制备川芎茶调散供试品溶液，方法为：
(1)准确称取生川芎12g，白芷6g，羌活6g，细辛3g，防风4.5g，荆芥12g，薄荷24g以及甘草6g，加入735mL纯净水，浸泡30min后，武火煮沸，然后转文火煎煮20min，过滤得滤液I，向药渣中加入588mL纯净水，武火煮沸后，转文火煎煮10min，过滤，得滤液II，将滤液I和II合并，浓缩至100mL。
(2)依上述方法制备10批生川芎配伍的川芎茶调散浓缩液，依次记作S1～S10。分别从10批浓缩液中准确量取10.0mL，13000r/min离心10min，取上清液，0.22μm滤头过滤即可。
实施例二
制备对照品溶液，方法如下：
精密称取0.12mg升麻素苷、0.28mg甘草苷、0.14mg升麻素、0.24mg5-O-甲基阿斯维米醇苷、0.57mg洋川芎内酯I、0.065mg亥茅酚苷、0.058mg洋川芎内酯A，置于棕色量瓶中，加入1mL甲醇制成对照品溶液，使溶液中升麻素苷的浓度为0.12mg/mL、甘草苷的浓度为0.28mg/mL、升麻素的浓度为014mg/mL、5-O-甲基阿斯维米醇苷的浓度为0.24mg/mL、洋川芎内酯I的浓度为0.57mg/mL、亥茅酚苷的浓度为0.065mg/mL、洋川芎内酯A的浓度为0.058mg/mL。
实施例三
色谱条件确定，方法如下：
色谱柱为C18色谱柱(4.6mm×250mm×5μm)，分别以甲醇-水和乙腈-水为流动相，以实施例一制备的S3溶液为供试品溶液，结果显示，乙腈-水的洗脱能力优于甲醇-水，见图1，但是从图1中可以看出乙腈-水的色谱峰存在拖尾现象，说明存在洗脱不完全的情况。
因为加酸可以改变峰拖尾的情况，所以以此实验结果为基础，向乙腈-水流动相中加入不同量的醋酸和0.5％磷酸酸，进行条件优化，结果出现了基线漂移的情况，见图2。
在供试品中通过调节甲醇乙腈的比例，可以将各个目标峰与其他相邻的色谱峰达到基线分离，最终确定以甲醇：乙腈(体积比1:1)：水为流动相，进行梯度洗脱时各个色谱峰的分离效果最好，且基线较平稳，以276nm为检测波长检测到的化合物种类多、质量好。
实施例四
建立生川芎配伍的川芎茶调散的HPLC指纹图谱
采用实施例三确定的最优色谱条件和洗脱程序分别建立实施例一制备的10批生川芎茶调散的指纹图谱，方法为：
准确吸取10μL实施例一制备的川芎茶调散供试品溶液，加入高效液相色谱仪中，以柱温30℃，甲醇-乙腈(1:1，A)-水(B)为流动相，洗脱条件为0～6min，10％A；6～9min，10％～20％A；9～29min，20％～30％A；29～46min，30％～40％A；46～56min，40％～50％A；56～66min，50％～55％A；66～71min，55％～60％A；71～76min，60％～70％A；76～86min，70％～80％A；86～89min，80％～90％A；89～90min，90％A。以276nm为检测波长进行结果检测，记录洗脱95min时的色谱图。
实施例五
建立对照品色谱图
精密量取升麻素苷、甘草苷、升麻素、5-O-甲基阿斯维米醇苷、洋川芎内酯I、亥茅酚苷、洋川芎内酯A混合对照品溶液10μL，以实施例四中的方法建立对照品的色谱图，结果如图4所示。
结果分析
(一)关于指纹图谱建立方法
(1)精密度分析
精密吸取1份实施例一制备的S3供试品平行溶液，按实施例四的色谱条件连续进样6次，记录各成分的色谱峰面积并计算RSD，结果见图3。由图3可以看出，共获得21个共有峰，经与对照品色谱图4比对，指认11号峰为5-O-甲基阿斯维米醇苷的色谱峰，由于该峰出峰时间居中，峰形好，设为参照峰，以参照峰11的相对峰面积为100％、相对保留时间Rt为1.00计，21个共有峰的相对保留时间、相对峰面积分别见表1和表2，由表1和2可以看出，21个共有峰的相对保留时间、相对峰面积的RSD分别为0.26％-2.77％、0.27％-2.84％，表明该方法精密度良好。
表1相对保留时间
| 峰号 | JMD-1 | JMD-2 | JMD-3 | JMD-4 | JMD-5 | JMD-6 | RSD |
| 1 | 0.1301 | 0.1289 | 0.1303 | 0.1391 | 0.1323 | 0.1331 | 2.77％ |
| 2 | 0.2293 | 0.2282 | 0.2289 | 0.2231 | 0.2323 | 0.2321 | 1.46％ |
| 3 | 0.3148 | 0.3144 | 0.3133 | 0.3149 | 0.3143 | 0.3169 | 0.38％ |
| 4 | 0.4394 | 0.4391 | 0.4331 | 0.4339 | 0.4401 | 0.4478 | 1.20％ |
| 5 | 0.6610 | 0.6623 | 0.6702 | 0.6712 | 0.6634 | 0.6821 | 1.19％ |
| 6 | 0.6732 | 0.6876 | 0.6709 | 0.6721 | 0.6732 | 0.6876 | 1.17％ |
| 7 | 0.6888 | 0.6831 | 0.6801 | 0.6934 | 0.6801 | 0.6983 | 1.09％ |
| 8 | 0.7636 | 0.7689 | 0.7765 | 0.7608 | 0.7731 | 0.7894 | 1.33％ |
| 9 | 0.8097 | 0.8083 | 0.7921 | 0.7732 | 0.7701 | 0.7797 | 2.20％ |
| 10 | 0.8818 | 0.8834 | 0.8994 | 0.8799 | 0.8804 | 0.8707 | 1.06％ |
| 11(s) | 1.0000 | 1.0000 | 1.0000 | 1.0000 | 1.0000 | 1.0000 | 0.00％ |
| 12 | 1.0577 | 1.0602 | 1.0578 | 1.0591 | 1.0649 | 1.0623 | 0.26％ |
| 13 | 1.1317 | 1.1327 | 1.1319 | 1.1304 | 1.1349 | 1.1399 | 0.30％ |
| 14 | 1.2806 | 1.2992 | 1.2834 | 1.2901 | 1.2936 | 1.3176 | 1.03％ |
| 15 | 1.3445 | 1.3531 | 1.3356 | 1.3491 | 1.3321 | 1.3699 | 1.01％ |
| 16 | 1.361 | 1.3782 | 1.3691 | 1.3682 | 1.3621 | 1.3987 | 1.02％ |
| 17 | 1.3881 | 1.3998 | 1.3612 | 1.3823 | 1.3799 | 1.3691 | 0.99％ |
| 18 | 1.4055 | 1.4231 | 1.4103 | 1.4488 | 1.4132 | 1.4323 | 1.14％ |
| 19 | 1.5211 | 1.5231 | 1.5111 | 1.5432 | 1.5061 | 1.5423 | 1.02％ |
| 20 | 1.7895 | 1.8323 | 1.7943 | 1.7832 | 1.7731 | 1.8201 | 1.26％ |
| 21 | 1.9044 | 1.9103 | 1.9131 | 1.9267 | 1.9331 | 1.9232 | 0.57％ |
表2相对峰面积
(2)稳定性分析
精密吸取1份S3供试品溶液，分别在0、2、4、8、12和24h按实施例四的色谱条件测定，以11号峰为参照峰，结果见表3和表4，由表3和4可以看出，测得21个共有峰的相对保留时间、相对峰面积的RSD分别为0.27％-1.39％、0.44％-2.66％，表明供品试液在室温放置24h内稳定性良好。
表3相对保留时间表
| 峰号 | 0h | 2h | 4h | 8h | 12h | 24h | RSD |
| 1 | 0.1303 | 0.1313 | 0.1322 | 0.1298 | 0.1321 | 0.1312 | 0.73％ |
| 2 | 0.2293 | 0.2313 | 0.2298 | 0.2319 | 0.2323 | 0.2297 | 0.55％ |
| 3 | 0.3291 | 0.3189 | 0.3232 | 0.3201 | 0.3192 | 0.3196 | 1.23％ |
| 4 | 0.4401 | 0.4399 | 0.4487 | 0.4351 | 0.4323 | 0.4332 | 1.39％ |
| 5 | 0.6632 | 0.6789 | 0.6613 | 0.6689 | 0.6658 | 0.6657 | 0.94％ |
| 6 | 0.6702 | 0.6719 | 0.6778 | 0.6713 | 0.6881 | 0.6723 | 1.01％ |
| 7 | 0.6893 | 0.6932 | 0.6911 | 0.6834 | 0.6823 | 0.6956 | 0.77％ |
| 8 | 0.7639 | 0.7765 | 0.7636 | 0.7894 | 0.7789 | 0.7633 | 1.39％ |
| 9 | 0.8034 | 0.8183 | 0.8143 | 0.8093 | 0.8162 | 0.8011 | 0.87％ |
| 10 | 0.8811 | 0.8994 | 0.8934 | 0.8804 | 0.8994 | 0.8972 | 0.99％ |
| 11(s) | 1.0000 | 1.0000 | 1.0000 | 1.0000 | 1.0000 | 1.0000 | 0.00％ |
| 12 | 1.0572 | 1.0512 | 1.0578 | 1.0522 | 1.0531 | 1.0563 | 0.27％ |
| 13 | 1.1303 | 1.1319 | 1.1317 | 1.1349 | 1.1341 | 1.1466 | 0.53％ |
| 14 | 1.2819 | 1.2901 | 1.2997 | 1.2834 | 1.2801 | 1.2856 | 0.56％ |
| 15 | 1.3399 | 1.3356 | 1.3798 | 1.3573 | 1.3681 | 1.3721 | 1.32％ |
| 16 | 1.3678 | 1.3982 | 1.3821 | 1.3913 | 1.3657 | 1.3662 | 1.02％ |
| 17 | 1.3802 | 1.3701 | 1.3892 | 1.3923 | 1.3981 | 1.3613 | 1.02％ |
| 18 | 1.4382 | 1.4398 | 1.4132 | 1.4169 | 1.4132 | 1.4243 | 0.85 |
| 19 | 1.5132 | 1.5432 | 1.5199 | 1.5268 | 1.5213 | 1.5311 | 0.68 |
| 20 | 1.8313 | 1.7834 | 1.7821 | 1.7902 | 1.7931 | 1.7945 | 1.01 |
| 21 | 1.9267 | 1.9131 | 1.9331 | 1.9502 | 1.9213 | 1.9312 | 0.65 |
表4相对峰面积
| 峰号 | 0h | 2h | 4h | 8h | 12h | 24h | RSD |
| 1 | 0.1132 | 0.1189 | 0.1157 | 0.1173 | 0.1156 | 0.1188 | 1.88％ |
| 2 | 0.1882 | 0.1826 | 0.1834 | 0.1889 | 0.1873 | 0.1857 | 1.39％ |
| 3 | 0.2471 | 0.2431 | 0.2443 | 0.2449 | 0.2458 | 0.2481 | 0.75％ |
| 4 | 0.6239 | 0.6183 | 0.6332 | 0.6319 | 0.6283 | 0.6357 | 1.03％ |
| 5 | 0.0944 | 0.0942 | 0.0952 | 0.0932 | 0.0948 | 0.0981 | 1.76％ |
| 6 | 0.1562 | 0.1534 | 0.1582 | 0.1577 | 0.1592 | 0.1533 | 1.60％ |
| 7 | 0.1132 | 0.1145 | 0.1154 | 0.1134 | 0.1162 | 0.1132 | 1.11％ |
| 8 | 0.1382 | 0.1378 | 0.1375 | 0.1366 | 0.1352 | 0.1378 | 0.81％ |
| 9 | 0.6934 | 0.6925 | 0.6932 | 0.6972 | 0.7132 | 0.7248 | 1.92％ |
| 10 | 0.0845 | 0.0865 | 0.0831 | 0.0844 | 0.0839 | 0.0851 | 1.36％ |
| 11(s) | 1.0000 | 1.0000 | 1.0000 | 1.0000 | 1.0000 | 1.0000 | 0.00％ |
| 12 | 1.3892 | 1.3891 | 1.3801 | 1.3759 | 1.3802 | 1.3899 | 0.44％ |
| 13 | 0.2193 | 0.2135 | 0.2112 | 0.2115 | 0.2178 | 0.2145 | 1.54％ |
| 14 | 0.0701 | 0.0723 | 0.0734 | 0.0703 | 0.0733 | 0.0711 | 2.04％ |
| 15 | 0.6021 | 0.6045 | 0.6098 | 0.6073 | 0.6033 | 0.6087 | 0.51％ |
| 16 | 0.0312 | 0.0314 | 0.0321 | 0.0319 | 0.0311 | 0.0314 | 1.26％ |
| 17 | 0.0278 | 0.0276 | 0.0278 | 0.0279 | 0.0268 | 0.0261 | 2.66％ |
| 18 | 0.0388 | 0.0389 | 0.0388 | 0.039 | 0.0381 | 0.0388 | 0.83％ |
| 19 | 0.0309 | 0.0301 | 0.0304 | 0.0307 | 0.0301 | 0.0303 | 1.07％ |
| 20 | 0.0778 | 0.0769 | 0.0771 | 0.0776 | 0.0768 | 0.0773 | 0.51％ |
| 21 | 0.0251 | 0.0247 | 0.0246 | 0.0243 | 0.0248 | 0.0246 | 1.07％ |
(3)重复性分析
精密吸取6份S3供试品平行溶液，按实施例六的色谱条件连续进样6次，以11号峰为参照峰，结果见表5和表6。由表5和6可以看出，测得21个共有峰的相对保留时间、相对峰面积的RSD分别为0.24％-1.57％、0.21％-2.88，表明该方法重复性良好。
表5相对保留时间
表6相对峰面积
| 峰号 | CFX-1 | CFX-2 | CFX-3 | CFX-4 | CFX-5 | CFX-6 | RSD |
| 1 | 0.1123 | 0.1172 | 0.1113 | 0.1178 | 0.1134 | 0.1105 | 2.70％ |
| 2 | 0.1876 | 0.1823 | 0.1893 | 0.1822 | 0.1875 | 0.1832 | 1.69％ |
| 3 | 0.2472 | 0.2447 | 0.2492 | 0.2488 | 0.2438 | 0.2465 | 0.88％ |
| 4 | 0.6281 | 0.6319 | 0.6334 | 0.6231 | 0.6372 | 0.6166 | 1.20％ |
| 5 | 0.0923 | 0.0924 | 0.0935 | 0.0946 | 0.0927 | 0.0926 | 0.95％ |
| 6 | 0.1579 | 0.1563 | 0.1529 | 0.1534 | 0.1576 | 0.1523 | 1.61％ |
| 7 | 0.1193 | 0.1103 | 0.1163 | 0.1134 | 0.1114 | 0.1139 | 2.88％ |
| 8 | 0.1388 | 0.1372 | 0.1367 | 0.1389 | 0.1362 | 0.1389 | 0.89％ |
| 9 | 0.6923 | 0.6982 | 0.7013 | 0.7098 | 0.6899 | 0.7023 | 1.03％ |
| 10 | 0.0833 | 0.0823 | 0.0821 | 0.0831 | 0.0827 | 0.0806 | 1.18％ |
| 11(s) | 1.0000 | 1.0000 | 1.0000 | 1.0000 | 1.0000 | 1.0000 | 0.00％ |
| 12 | 1.3822 | 1.3892 | 1.3856 | 1.3823 | 1.3876 | 1.3874 | 0.21％ |
| 13 | 0.2198 | 0.2167 | 0.2137 | 0.2185 | 0.2177 | 0.2183 | 0.97％ |
| 14 | 0.0722 | 0.0723 | 0.0719 | 0.0722 | 0.0732 | 0.0716 | 0.75％ |
| 15 | 0.6089 | 0.6011 | 0.6021 | 0.6033 | 0.6065 | 0.6013 | 0.52％ |
| 16 | 0.0317 | 0.0321 | 0.0318 | 0.0318 | 0.0319 | 0.032 | 0.46％ |
| 17 | 0.0271 | 0.0279 | 0.0267 | 0.0278 | 0.0278 | 0.0277 | 1.77％ |
| 18 | 0.0381 | 0.0389 | 0.0388 | 0.0384 | 0.0382 | 0.0387 | 0.86％ |
| 19 | 0.0304 | 0.0309 | 0.0311 | 0.0303 | 0.0318 | 0.0312 | 1.79％ |
| 20 | 0.0778 | 0.0789 | 0.0771 | 0.0768 | 0.0769 | 0.0761 | 1.25％ |
| 21 | 0.0244 | 0.0243 | 0.0248 | 0.0251 | 0.0248 | 0.0247 | 1.19％ |
(二)关于对照品谱图
图4中峰7为升麻素苷；峰9为甘草苷；峰10为升麻素；峰11为5-O-甲基阿斯维米醇苷；峰12为洋川芎内酯I；峰17为亥茅酚苷；峰20为洋川芎内酯A。由图可以看出，该图背景干净，没有杂质污染，基于此的测试准确可靠。
(三)关于含量测定
(1)线性范围考察
精密量取升麻素苷、甘草苷、升麻素、5-O-甲基阿斯维米醇苷、洋川芎内酯I、亥茅酚苷、洋川芎内酯A混合对照品溶液适量，加甲醇稀释配制成系列浓度的对照品溶液：升麻素苷浓度分别为120、96、72、48、24、9.6μg/mL，甘草苷浓度分别为280、224、168、112、56、22.4μg/mL，升麻素浓度分别为140、112、84、56、28、11.2μg/mL，5-O-甲基阿斯维米醇苷浓度分别为240、192、144、96、48、19.2μg/mL，洋川芎内酯I浓度分别为570、456、342、228、114、45.6μg/mL，亥茅酚苷浓度分别为65、52、39、26、13、5.2μg/mL，洋川芎内酯A浓度分别为58、46.4、34.8、23.2、11.6、4.64μg/mL。精密吸取各系列混合标准品溶液10μL进样，以峰面积为纵坐标，对照品浓度为横坐标，进行线性回归，绘制标准曲线(见图5)，计算出回归方程和线性范围。
结果显示回归方程分别为升麻素苷Y＝14390X+2772(r＝0.9999)，甘草苷Y＝21400X+169202(r＝0.9999)，升麻素Y＝19094X-5088.8(r＝0.9999)，5-O-甲基阿斯维米醇苷Y＝12342X-1990.6(r＝0.9997)，洋川芎内酯IY＝11921X-13314(r＝0.9997)，亥茅酚苷Y＝4681.3X-900.58(r＝0.9996)，洋川芎内酯AY＝7813.5X-1331.6(r＝0.9999)，分别在9.6～120μg/mL，22.4～280μg/mL；11.2～140μg/mL；19.2～240μg/mL；45.6～570μg/mL；5.2～65μg/mL；4.64～58μg/mL内与峰面积呈良好的线性关系，相关系数均在0.999以上。
(2)精密度分析
精密吸取1份S3供试品溶液，按实施例四的色谱条件连续进样6次，记录各成分的色谱峰面积并计算RSD。结果见表7，升麻素苷、甘草苷、升麻素、5-O-甲基阿斯维米醇苷、洋川芎内酯I、亥茅酚苷、洋川芎内酯A峰面积的RSD分别为1.57％、1.61％、1.54％、2.81％、1.32％、2.12％、2.64％，说明仪器的精密度良好。
表7川芎茶调散含量测定方法学结果
(3)稳定性分析
精密吸取1份S3供试品溶液，分别在0、2、4、8、12和24h按实施例四的色谱条件测定，记录各成分的色谱峰面积并计算RSD。结果升麻素苷、甘草苷、升麻素、5-O-甲基阿斯维米醇苷、洋川芎内酯I、亥茅酚苷、洋川芎内酯A峰面积的RSD分别为2.14％、1.60％、1.72％、1.56％、1.06％、2.65％、2.04％，说明供试品溶液在24h内稳定。
(4)重复性分析
精密吸取6份S3供试品平行溶液，按实施例四的色谱条件连续进样6次，记录各成分的色谱峰面积并计算RSD，结果见表7。结果表明，升麻素苷、甘草苷、升麻素、5-O-甲基阿斯维米醇苷、洋川芎内酯I、亥茅酚苷、洋川芎内酯A含量分别为0.0301mg/g，0.1127mg/g，0.0378mg/g，0.2957mg/g，0.3232mg/g，0.0330mg/g，0.0458mg/g；RSD分别为1.67％、2.17％、1.48％、2.24％、0.75％、1.75％、2.21％，说明该方法重复性良好。
(5)加样回收率分析
精密吸取6份S3供试品平行溶液，分别按1:1比例精密加入对照品溶液，分别按实施例四的色谱条件连续进样6次，计算各成分的加样回收率，结果见表7。结果，升麻素苷、甘草苷、升麻素、5-O-甲基阿斯维米醇苷、洋川芎内酯I、亥茅酚苷、洋川芎内酯A的平均加样回收率在97.91％～98.88％，RSD在0.94％～1.95％，说明该方法的准确度良好。
表7
(6)样品含量测定
取10批实施例一制备的供试品溶液，精密量取10μL注入液相色谱仪，记录色谱图，用外标一点法计算含量，含量Cx＝Cr*Ax/Ar，其中Cx为样品浓度；Cr为对照品浓度；Ax为样品峰面积；Ar为对照品峰面积，结果见表8。
表8含量计算结果
因此，本发明提供的川芎茶调散指纹图谱及化学成分含量测定方法的建立，提供的流动相、洗脱条件、检测波长获得的指纹图谱背景干净，各峰分离效果好，基线平稳，适于川芎茶调散整方指纹图谱的建立；检测方法检测精密度良好、重复性强、加样回收率高，稳定性高，检测指标丰富，检测结果准确可靠，可对川芎茶调散的多种化学成分含量进行定量，为川芎茶调散的后续研究奠定了基础。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其进行限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而这些修改或者等同替换亦不能使修改后的技术方案脱离本发明技术方案的精神和范围。
Claims (2)
1.川芎茶调散指纹图谱及化学成分含量测定方法的建立，其特征在于，步骤如下：
S1、制备供试品溶液，方法为：准确称取生川芎12 g，白芷6 g，羌活6 g，细辛3 g，防风4.5 g，荆芥12 g，薄荷24 g以及甘草6 g，加入10倍量水，浸泡25-35 min后，武火煮沸，然后转文火煎煮18-25 min，过滤得滤液I，向药渣中加入8倍量水，武火煮沸后，转文火煎煮10min，过滤，得滤液II，将滤液I和II合并，浓缩至100 mL，准确量取10.0 mL，13000 r/min离心10 min，取上清液，0.22 μm滤头过滤即可；
S2、制备对照品溶液，对照品溶液为用甲醇溶解的升麻素苷、甘草苷、升麻素、5-O-甲基阿斯维米醇苷、洋川芎内酯I、亥茅酚苷、洋川芎内酯A的混合液，浓度分别为0.12、0.28、0.14、0.24、0.57、0.065、0.058 mg/mL；
S3、用高效液相色谱法建立供试品的指纹图谱，采用C18色谱柱，长度为25 cm，粒径为5μm，内径为4.6 mm；流动相为甲醇-乙腈-水，梯度洗脱，流速为0.7 mL/min，柱温为30℃，检测波长为270-280 nm，进样量为10 μL；所述流动相甲醇-乙腈的体积比为1:1，记为A，流动相水记为B，所述梯度洗脱程序为：0~6 min，10%A；6~9 min，10%~20%A；9~29 min，20%~30%A；29~46 min，30%~40%A；46~56 min，40%~50%A；56~66 min，50%~55%A；66~71 min，55%~60%A；71~76 min，60%~70%A；76~86 min，70%~80%A；86~89 min，80%~90%A；89~90 min，90%A；
S4、以步骤S3相同的方法建立对照品的色谱图；
S5、将步骤S3和S4获得的指纹图谱比对确定参照峰，并标定特征峰；
S6、对标定的特征峰进行定量分析。
2.根据权利要求1所述的川芎茶调散指纹图谱及化学成分含量测定方法的建立，其特征在于：所述水为纯净水；所述指纹图谱为洗脱90 min时记录的色谱图。
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