CN112147243B - 一种同时测定清肺药物中多种活性成分的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了同时测定清肺药物中绿原酸、咖啡酸、对香豆酸、野黄芩苷、迷迭香酸、芹菜素含量的HPLC方法，以及检测贝母素甲、贝母素乙的方法，建立了药物活性成分的指纹图谱，保证了测量方法的精密度、稳定性、重复性、专属性、准确度。

Description

一种同时测定清肺药物中多种活性成分的检测方法
技术领域
本发明属于医药领域，涉及一种用于同时测定多种清肺药物活性成分的检测方法，以及对活性成分HPLC标准指纹图谱的建立方法。
背景技术
清肺方破茧于《景岳全书》，绵历甲子，1973年总结成中肺协定方，1976年开发为中肺合剂，原方由浙贝母、防己、白花蛇舌草、龙葵、重楼、半枝莲、白茅根、仙鹤草、夏枯草、天龙10味中药组成，主要用于肺癌、肺炎、放射性肺炎引起的咳嗽多痰、胸痛、咳血等。清肺方剂经过多年改良发展，衍生了多种针对不同症状的药物组合形式，2002年起对于清肺合剂的质量控制研究、药理药效研究、临床研究持续不断发展，取得了一定进展。
中药指纹图谱是指中药材或中药制剂经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示其化学特征的色谱图或光谱图。它能够直观描绘中药及其制剂中所含化学成分的种类与数量，进而对药物提取物或成方药品质量进行控制和评价，具备专属性强、稳定性好、重现性好的优点，因此中药指纹图谱已经成为目前国际上较为先进的中药质量控制手段。
CN101732552B公开了一种清肺化痰丸的检测方法，通过薄层色谱鉴别麻黄中的盐酸麻黄碱成分，以及桔梗、黄芩苷的含量测定方法；CN102008573B公开了一种清肺止咳平喘口服液的质量检测方法，对盐酸麻黄碱含量建立HPLC色谱分析方法。
然而对于清肺方剂中各种药物的活性成分的检测比较繁琐和单一，无法对相应方剂的质量进行全面控制监测。清肺方经过多次改良，药物成分比较复杂多样，有必要寻找一种同时可以检测其中多种成分的方法，有效控制生产过程特别是药物提取中的质量和含量。
发明内容
本发明目的是提供一种同时测定清肺药物中绿原酸、咖啡酸、对香豆酸、野黄芩苷、迷迭香酸、芹菜素含量的HPLC方法，保证了测量方法的精密度、稳定性、重复性、专属性、准确度。
为实现上述目的，提供的技术方案内容如下:
建立清肺药物组合物中活性成分HPLC标准指纹图谱，即活性成分为绿原酸、咖啡酸、对香豆酸、野黄芩苷、迷迭香酸和芹菜素的指纹图谱，用SB-C18色谱柱(4.6*150mm，5μm)，乙腈-0.3％甲酸体系，进行梯度洗脱，流动相A为0.3％质量百分比的甲酸，流动性B为乙腈，梯度洗脱(以B的体积百分比计)0-18min：8-12％B，18-25min：12％-14％B；25-27min：14％-16％B；27-40min：16％-16％B；40-75min：16％-35％B；检测波长：0-25min为310nm，25-75min为330nm；柱温：35℃；流速：1.0mL/min；进样量：10μl；分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，记录80min内的色谱图，使用指纹图谱软件对图谱进行处理，即得。
其中对照品制备步骤如下：精密称定咖啡酸、对香豆酸、野黄芩苷、迷迭香酸、芹菜素对照品适量，加甲醇溶解并稀释制得浓度分别为0.874mg/ml，1.18mg/ml，0.626mg/ml，0.571mg/ml，0.467mg/ml，0.238mg/ml的绿原酸、咖啡酸、对香豆酸、野黄芩苷、迷迭香酸、芹菜素对照品贮备液，4℃冰箱贮藏，备用。
供试品含有：龙葵，百合，夏枯草，浙贝母，重楼，制黄精，沙参，半枝莲和白花蛇舌草。供试品溶液的制备步骤如下：取浙贝12g，白花蛇舌草15g，龙葵15g，重楼5g，半枝莲15g，沙参12g，夏枯草8g，百合15g，制黄精15g，置于蒸馏瓶中，加入10倍量(1120ml) 的水，180℃恒温回流提取2小时，过滤得滤液，药渣加入10倍量水第二次180℃恒温回流 2小时，过滤得滤液，合并两次滤液旋转蒸发到体积为1120ml，即得。
浙贝母中贝母素甲、贝母素乙成分的检测方法，包括如下步骤：
S1色谱条件：色谱柱为Kromasil C18,流动相为乙腈-水-二乙胺(质量比70:30:0.03)，流速为0.7ml/min，柱温30℃，蒸发光检测器，漂移管温度：45℃，氮气流速1.5L/min,
S2：制备贝母素甲、贝母素乙的标准对照品，
S3供试液制备：将含有浙贝母的中药溶液80℃旋转蒸发至90ml，得每毫升含2.5g生药的浓缩药液，精密吸取浓缩药液10ml，置于烧瓶中，加入浓氨试液0.8ml浸润1.5小时，精密加入三氯甲烷40ml，置80℃水浴中加热回流1.5小时，静置放冷，用分液漏斗分液取下层清液，采用棉花滤过，精密量取续滤液25ml，置于蒸发皿中蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至2ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀即得；
S4测定:使用外标两点测定法,分别精密吸取对照品溶液10μl、20μl，供试品溶液10μl, 注入液相色谱仪，测定，用对数方程分别计算贝母素甲、贝母素乙的含量。
经测试仪器检测限，定量下限为贝母素甲10μg/ml，贝母素乙7.5μg/ml
其中含有浙贝母的中药溶液优选为如下方法制备的溶液：浙贝12g，白花蛇舌草15g，龙葵15g，重楼5g，半枝莲15g，沙参12g，夏枯草8g，百合15g，制黄精15g，置于蒸馏瓶中，加入10倍量(1120ml)的水，180℃恒温回流提取2小时，过滤得滤液，药渣加入10 倍量水第二次180℃恒温回流2小时，过滤得滤液，合并两次滤液旋转蒸发到体积为1120ml，即得。
本发明还包括如下技术方案，
一种清肺药物组合物的含量测定方法，该组合物中含有如下原料：龙葵，百合，夏枯草，浙贝母，重楼，制黄精，沙参，半枝莲和白花蛇舌草，其特征在于对药物中活性成分绿原酸、咖啡酸、对香豆酸、野黄芩苷、迷迭香酸、芹菜素同时进行检测，包括如下步骤：
S1.色谱条件：采用SB-C18色谱柱；流动相A为0.3％质量浓度的甲酸溶液，流动性B为乙腈，梯度洗脱，检测波长：0-25min为310nm，25-75min为330nm；柱温：35℃；流速：1.0mL/min；进样量：10μl；
S2.对照品溶液制备：精密称定咖啡酸、对香豆酸、野黄芩苷、迷迭香酸、芹菜素对照品适量，加甲醇溶解并稀释制得对照品溶液；
S3.供试品溶液制备：取龙葵，百合，夏枯草，浙贝母，重楼，制黄精，沙参，半枝莲和白花蛇舌草原料药，置于蒸馏瓶中，加水后恒温回流提取，过滤得滤液，滤渣加水第二次回流，过滤得滤液，合并两次滤液，旋转蒸发即得；
S4.测定：在色谱条件下，分别进对照品溶液、供试品溶液各10μl，以峰面积计算样品含量。
其中S1色谱条件中的梯度洗脱优选为(以B的体积百分比计)0-18min：8-12％B，18-25min：12％-14％B；25-27min：14％-16％B；27-40min：16％-16％B；40-75min：16％-35％B；
对照品制备步骤优选如下：精密称定咖啡酸、对香豆酸、野黄芩苷、迷迭香酸、芹菜素对照品适量，加甲醇溶解并稀释制得浓度分别为0.874mg/ml，1.18mg/ml，0.626 mg/ml，0.571mg/ml，0.467mg/ml，0.238mg/ml的绿原酸、咖啡酸、对香豆酸、野黄芩苷、迷迭香酸、芹菜素对照品贮备液，4℃冰箱贮藏，备用；
供试品溶液的制备包括：取浙贝12g，白花蛇舌草15g，龙葵15g，重楼5g，半枝莲15g，沙参12g，夏枯草8g，百合15g，制黄精15g，置于蒸馏瓶中，加入10倍量 (1120ml)的水，180℃恒温回流提取2小时，过滤得滤液，药渣加入10倍量水第二次180℃恒温回流2小时，过滤得滤液，合并两次滤液旋转蒸发到体积为1120ml，即得。
绿原酸、咖啡酸、对香豆酸在310nm处有最大吸收，野黄芩苷、迷迭香酸、芹菜素在330nm处有最大吸收；供试品各成分峰面积RSD均在4％之内。
本发明的有益效果是：
1)通过色谱条件(波长，色谱柱、流动性及流速)考察获取最佳结果，建立标准曲线，确定了最低检测限和定量下限进行考察，获得了较高的精密度、稳定性、专属性和准确度。
2)同时建立了多个中药活性成分的指纹图谱，可以同时检测清肺药物中多种有效成分，全面反映中药制剂的多指标质量水平。
3)可以用于在提取物质量控制，生产工艺改进，成品药物含量检测等多个领域，使用范围广泛。
附图说明
图1：混合标准品的全波长扫描图
图2：样品的HPLC指纹图谱
图3：混合标准品的HPLC指纹图谱
图4：标准曲线的建立
具体实施方式
通过下述实施例及实验对本发明进行进一步说明
其中主要实验试剂如下：
绿原酸对照品(北京北方伟业计量技术研究院，批号：110753)
咖啡酸对照品(北京北方伟业计量技术研究院，批号：110885)
野黄芩苷对照品(北京北方伟业计量技术研究院，批号：110842)
迷迭香酸对照品(北京北方伟业计量技术研究院，批号：111871)
芹菜素对照品(北京北方伟业计量技术研究院，批号：111901)
4-香豆酸对照品(北京北方伟业计量技术研究院，批号：112037)
贝母素甲对照品(北京北方伟业计量技术研究院，批号：110750)
贝母素乙对照品(北京北方伟业计量技术研究院，批号：110751)
甲醇(色谱纯，浙江临海市浙东特种试剂厂)
乙腈(色谱纯，浙江临海市浙东特种试剂厂)
甲酸(美国安可化学科技公司)
中药材均购自杭州华东中药饮片有限公司。
实施例1：建立绿原酸、咖啡酸、对香豆酸、野黄芩苷、迷迭香酸、芹菜素的含量测定方法(活性成分为绿原酸、咖啡酸、对香豆酸、野黄芩苷、迷迭香酸和芹菜素的指纹图谱)
1.1对照品贮备液的制备
精密称取绿原酸、咖啡酸对照品分别为4.37、5.90mg分别置于5ml量瓶中；精密称取对香豆酸、野黄芩苷、迷迭香酸、芹菜素对照品分别为6.26、5.71、4.67、2.38mg，分别置于10ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得浓度分别为0.874mg/ml，1.18mg/ml，0.626mg/ml，0.571mg/ml，0.467mg/ml，0.238mg/ml的绿原酸、咖啡酸、香豆酸、野黄芩苷、迷迭香酸、芹菜素对照品贮备液。4℃冰箱贮藏，备用。
1.2供试品溶液的制备
量取浙贝12g，白花蛇舌草15g，龙葵15g，重楼5g，半枝莲15g，沙参12g，夏枯草8g，百合15g，炙黄精15g，置于蒸馏瓶中，加入10倍量(1120ml)的水，180℃恒温回流提取2小时，过滤得滤液，药渣加入10倍量水第二次180℃恒温回流2小时，过滤得滤液，合并两次滤液旋转蒸发到体积为1120ml，即得。
1.3色谱条件的确定
1.3.1最佳波长的选择
采用二极管阵列检测器对绿原酸、咖啡酸、对香豆酸、野黄芩苷、迷迭香酸、芹菜素进行全波长扫描，对不同波长的吸收值进行比较。通过对绿原酸、咖啡酸、对香豆酸、野黄芩苷、迷迭香酸、芹菜素色谱峰的光谱扫描，绿原酸、咖啡酸、对香豆酸约在310nm处有最大吸收，野黄芩苷、迷迭香酸、芹菜素在330nm处有最大吸收。故选择绿原酸、咖啡酸、对香豆酸以310nm作为检查波长，野黄芩苷、迷迭香酸、芹菜素以330nm作为检测波长，各成分全波长扫描光谱图参见图1。
1.3.2色谱柱、流动相及流速、柱温的选择，比较多种色谱柱、流动相体系。经反复摸索，对比试验，采用SB-C18柱，乙腈-0.3％甲酸体系，进行梯度洗脱。得出色谱峰峰形好、分离度高。根据实际情况选择合适的流速和柱温，柱温：35℃；流速：1.0mL/min；进样量： 10μl。
1.3.3梯度洗脱设置的考察
摸查梯度洗脱的设置，以实现六个目标峰达到基线分离。流动相：0.3％甲酸溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脱(以B的体积百分比为0-18min：8％-12％；18-25min：12％-14％；25-27min： 14％-16％；27-40min：16％-16％；40-75min：16％-35％)；检测波长：0-25min为310nm，25-75 min为330nm。该色谱条件下样品与对照品的指纹图谱分别见图2、图3，其中从1到6 标注的峰依次为绿原酸、咖啡酸、对香豆酸、野黄芩苷、迷迭香酸、芹菜素的指示峰。
1.4方法学考察
1.4.1标准曲线的建立
分别精密吸取绿原酸、咖啡酸、香豆酸、野黄芩苷、迷迭香酸、芹菜素对照品贮备液1 ml，混匀，作为混合标准品溶液1。分别精密吸取混合标准品溶液1和超纯水各3ml，混匀，作为混合标准品溶液2，依次向下等倍逐步稀释得到混合标准品溶液3、4、5、6、7。将混合标准品溶液1-7按色谱条件连续进样测定，记录峰面积。以对照品溶液的浓度(mg/L)为纵坐标，峰面积(A)为横坐标，绘制标准曲线。结果表明，绿原酸在2.28-145.70ml/l，呈良好的线性关系。如表1、2，和图4所示。
表1标准曲线的建立
Figure BDA0002650408940000061
表2标准曲线的建立
Figure BDA0002650408940000062
1.4.2最低检测限和定量下线的考察
取混合标准品溶液7，继续向下等倍逐步稀释，按色谱条件连续进样测定，记录峰面积。当信噪音比为10：1时，定为各物质的定量限(LOQ)；当信噪比为3：1时，定为各物质的检测限(LOD)。绿原酸、咖啡酸、香豆酸、野黄芩苷、迷迭香酸、芹菜素的检测限、定量限如表3。
表3检测限、定量限结果
Figure BDA0002650408940000071
1.4.3精密度试验考察
取同一份供试品溶液适量，连续进样6次，记录峰面积，结果显示各成分峰面积RSD在3％之内。如表4。
表4精密度试验考察结果
Figure BDA0002650408940000072
1.4.4稳定性试验考察
取同一份供试品溶液适量，分别于0、2、4、8、16、24h进样测定，记录峰面积。结果显示各成分峰面积RSD均在4％之内，说明本样品在24小时内稳定。如表5。
表5稳定性试验考察结果
Figure BDA0002650408940000073
Figure BDA0002650408940000081
1.4.5重复性试验考察
平行制备6份供试品溶液，分别进样测定，记录峰面积。测定其含量，结果显示各成分峰面积RSD均在4％之类。说明本方法重复性良好。如表6.
表6重复性试验考察结果
Figure BDA0002650408940000082
1.4.6加样回收率考察
分别精密吸取绿原酸、咖啡酸、香豆酸、野黄芩苷、迷迭香酸、芹菜素对照品贮备液适量于10ml容量瓶，定容，分别制备三份绿原酸、咖啡酸、香豆酸、野黄芩苷、迷迭香酸、芹菜素含量约为供试品80％、100％、120％的混合标准品溶液。取9份已知含量的供试品溶液，三份一组分成三组，分别加入80％、100％、120％的混合标准品溶液，进样，计算回收率。结果表明回收率范围在95％-105％之间，说明本供试品制备方法准确性较高。如表7所示。
表7加样回收率考察结果
Figure BDA0002650408940000083
Figure BDA0002650408940000091
Figure BDA0002650408940000101
实施例2.贝母素甲、贝母素乙含量测定方法
色谱条件：色谱柱：Kromasil C18，流动相：乙腈-水-二乙胺(70:30:0.03)，流速：0.7ml/min，柱温：30℃，蒸发光检测器，漂移管温度：45℃，氮气流速1.5L/min。外标两点测定法：分别精密吸取对照品溶液10μl、20μl，供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定。用对数方程分别计算贝母素甲、贝母素乙的含量。供试液制备：将1.2中的供试品溶液80℃旋转蒸发至90ml，得每毫升含2.5g生药的浓缩药液，精密吸取浓缩药液10ml，置于烧瓶中，加入浓氨试液0.8ml浸润1.5小时，精密加入三氯甲烷40ml，置80℃水浴中加热回流1.5小时，静置放冷，用分液漏斗分液取下层清液，采用棉花滤过，精密量取续滤液25ml，置于蒸发皿中蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至2ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀即得。经测试仪器检测限，定量下限为贝母素甲10μg/ml，贝母素乙7.5μg/ml。
3、结果分析
由上述结果可见，本发明检测方法具有较好的精密度、稳定性、重复性、专属性、准确度，梯度洗脱模式可以成功分离所有有效成分，较高的柱温也有利于分离。取得的指纹图谱峰型好，线漂移小。
上述具体实施例并不构成对本发明的保护范围的限定，本领域技术人员可以根据上述说明对本发明进行各种变化和应用。

Claims (6)

1.一种清肺药物组合物的含量测定方法，该组合物中含有如下药物：龙葵，百合，夏枯草，浙贝母，重楼，制黄精，沙参，半枝莲和白花蛇舌草，其特征在于对药物中活性成分绿原酸、咖啡酸、对香豆酸、野黄芩苷、迷迭香酸、芹菜素同时进行检测，包括如下步骤：
S1.色谱条件：采用SB-C18色谱柱；流动相A为0.3%质量浓度的甲酸溶液，流动相 B为乙腈，梯度洗脱，检测波长：0-25 min为310 nm，25-75 min为330 nm；柱温：35℃；流速：1.0mL/min；进样量：10 μl；
S2.对照品溶液制备：精密称定咖啡酸、对香豆酸、野黄芩苷、迷迭香酸、芹菜素对照品适量，加甲醇溶解并稀释制得对照品溶液；
S3.供试品溶液制备：取龙葵，百合，夏枯草，浙贝母，重楼，制黄精，沙参，半枝莲和白花蛇舌草原料药，置于蒸馏瓶中，加水后恒温回流提取，过滤得滤液，滤渣加水第二次回流，过滤得滤液，合并两次滤液，旋转蒸发即得；
S4.测定：在色谱条件下，分别进对照品溶液、供试品溶液各10μl，以峰面积计算样品含量;
S1色谱条件中的梯度洗脱以B的体积百分比计为0-18min：8-12%B，18-25 min：12%-14%B；25-27 min：14%-16%B；27-40 min：16%-16%B；40-75 min：16%-35%B。
2.权利要求1所述的测定方法，其特征在于对照品制备步骤如下：精密称定咖啡酸、对香豆酸、野黄芩苷、迷迭香酸、芹菜素对照品适量，加甲醇溶解并稀释制得浓度分别为0.874mg/ml，1.18 mg/ml，0.626 mg/ml，0.571 mg/ml，0.467 mg/ml，0.238 mg/ml的绿原酸、咖啡酸、对香豆酸、野黄芩苷、迷迭香酸、芹菜素对照品贮备液，4℃冰箱贮藏，备用。
3.权利要求1所述的测定方法，其特征在于供试品溶液的制备包括：取浙贝12 g，白花蛇舌草15 g，龙葵15 g，重楼5 g，半枝莲15 g，沙参12 g，夏枯草8 g，百合15 g，制黄精15g，置于蒸馏瓶中，加入10倍量1120ml的水，180℃恒温回流提取2小时，过滤得滤液，药渣加入10倍量水第二次180℃恒温回流2小时，过滤得滤液，合并两次滤液旋转蒸发到体积为1120ml，即得。
4.权利要求1所述的测定方法，其特征在于绿原酸、咖啡酸、对香豆酸在310 nm处有最大吸收，野黄芩苷、迷迭香酸、芹菜素在330 nm处有最大吸收；供试品各成分峰面积RSD均在4%之内。
5.清肺药物组合物中活性成分HPLC标准指纹图谱的建立方法，其特征在于建立活性成分为绿原酸、咖啡酸、对香豆酸、野黄芩苷、迷迭香酸和芹菜素的指纹图谱，用SB-C18色谱柱，4.6*150 mm，5 μm，乙腈-0.3%甲酸体系，进行梯度洗脱，流动相A为0.3%质量百分比的甲酸，流动相 B为乙腈，以B的体积百分比计梯度洗脱0-18min：8-12%B，18-25 min：12%-14%B；25-27 min：14%-16%B；27-40 min：16%-16%B；40-75 min：16%-35%B；检测波长：0-25 min为310 nm，25-75 min为330 nm；柱温：35℃；流速：1.0 mL/min；进样量：10 μl；分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，记录80min内的色谱图，使用指纹图谱软件对图谱进行处理，即得；
供试品含有：龙葵，百合，夏枯草，浙贝母，重楼，制黄精，沙参，半枝莲和白花蛇舌草；供试品溶液的制备步骤如下：取浙贝12 g，白花蛇舌草15 g，龙葵15 g，重楼5 g，半枝莲15 g，沙参12 g，夏枯草8 g，百合15 g，制黄精15 g，置于蒸馏瓶中，加入10倍量1120ml的水，180℃恒温回流提取2小时，过滤得滤液，药渣加入10倍量水第二次180℃恒温回流2小时，过滤得滤液，合并两次滤液旋转蒸发到体积为1120ml，即得。
6.权利要求5所述的方法，其特征在于对照品制备步骤如下：精密称定咖啡酸、对香豆酸、野黄芩苷、迷迭香酸、芹菜素对照品适量，加甲醇溶解并稀释制得浓度分别为0.874 mg/ml，1.18 mg/ml，0.626 mg/ml，0.571 mg/ml，0.467 mg/ml，0.238 mg/ml的绿原酸、咖啡酸、对香豆酸、野黄芩苷、迷迭香酸、芹菜素对照品贮备液，4℃冰箱贮藏，备用。
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