CN111965269A - 一种超高效液相色谱法测定墓头回中齐墩果酸、熊果酸含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种超高效液相色谱法测定墓头回中齐墩果酸、熊果酸含量的方法，属于药物分析技术领域；本发明中以甲醇‑乙酸铵水溶液为流动相，采用超高效液相色谱法测定墓头回中齐墩果酸和熊果酸的含量，还能对该药材中有关物质进行有效分离与检测，此方法灵敏度高、分离效果好、快速简易，可用于墓头回药材的质量控制。

Description

一种超高效液相色谱法测定墓头回中齐墩果酸、熊果酸含量 的方法

技术领域

本发明属于药物分析技术领域，具体涉及一种超高效液相色谱法测定墓头回中齐墩果酸、熊果酸含量的方法。

背景技术

墓头回药材在《江苏省中药饮片炮制规范》（2002版）中有收载，质量标准涉及来源、炮制、成品性状、性味与归经、用法与用量、功能与主治、处方应付、贮藏几个方面。关于墓头回质量标准的指标相对较少，相关研究文献也相对较少。有研究发现墓头回药材中含有齐墩果酸和熊果酸，齐墩果酸和熊果酸互为同分异构体，为五环三萜类化合物，在自然界的植物中分布广泛，而且有很多的药理作用和生物活性。目前，将齐墩果酸和熊果酸作为代表物质用于墓头回药材的质量控制指标的研究较少。

中药是一个复杂的未知的体系，所含的化合物成分不仅仅种类繁多、数量不清楚，而且已知的化合物少、各化合物含量差异也很大。采用高效液相色谱技术来检测中药材标准，尽管对中药材的一些活性物质有一定认识，但并不全面。并且高效液相色谱法测定齐墩果酸和熊果酸的含量有着较多不足，如分离相对困难，检测速度慢，且药材提取液中物质众多，难以完全冲洗干净，造成色谱柱寿命大幅缩短。

发明内容

针对现有技术中存在的不足，本发明提供了一种超高效液相色谱法测定墓头回中齐墩果酸、熊果酸含量的方法。本发明中以甲醇-乙酸铵水溶液为流动相，采用超高效液相色谱法测定墓头回中齐墩果酸和熊果酸的含量，还能对该药材中有关物质进行有效分离与检测，此方法灵敏度高、分离效果好、快速简易，可用于墓头回药材的质量控制。

为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种超高效液相色谱法测定墓头回中齐墩果酸、熊果酸含量的方法，具体包括如下步骤：

（1）对照品溶液的配制：

分别称取一定量齐墩果酸和熊果酸，加甲醇溶解，分别配制成浓度为10 mg/mL的齐墩果酸和熊果酸对照品储备液；

量取一定量齐墩果酸和熊果酸对照品储备液，用甲醇稀释，摇匀，分别得到不同浓度的齐墩果酸和熊果酸标准溶液；

（2）样品溶液的配制：

将过4号筛（250μm±9.9μm,65目）的墓头回粉末与甲醇混合并超声溶解，过滤，然后蒸干滤液，加蒸馏水溶解，用水饱和正丁醇振摇提取3次，合并提取液；

将提取液蒸干后加入甲醇、盐酸，在80℃下加热回流水解4h，水解结束后冷却，加入蒸馏水溶解，用三氯甲烷提取3次，合并提取液，蒸干；

蒸干后的残渣加甲醇溶解，摇匀，过滤，取续滤液作为样品溶液；

（3）绘制标准曲线：

分别取不同浓度的齐墩果酸和熊果酸标准溶液，从低浓度到高浓度依次上超高效液相色谱仪进行定量测定，以浓度（c）为横坐标，以对应峰面积（A）为纵坐标，绘制标准曲线；

（4）测定样品溶液：

取样品溶液上超高效液相色谱仪进行定量测定，获得齐墩果酸和熊果酸的峰面积，根据标准曲线计算齐墩果酸和熊果酸的含量；

步骤（3）和（4）中，超高效液相色谱仪测定的色谱条件为：采用4.6×100 mm，2.6 μmphenomenex Kinetex色谱柱；以体积比为85：15的甲醇-乙酸铵水溶液为流动相，流速0.2-1.0 mL/min；紫外检测器检测，检测波长210 nm；柱温：30-40 ℃；进样量5-20 μL。。

进一步地，步骤（1）中，所述齐墩果酸和熊果酸对照品标准溶液的浓度均为5~1000μg/ml。

进一步地，步骤（2）中，所述墓头回粉末与甲醇的用量比为4g;20~100ml。

进一步地，步骤（2）中，所述蒸馏水用量为10ml；所述水饱和正丁醇用量为20ml。

进一步地，步骤（2）中，提取液蒸干后添加的甲醇和盐酸体积比为20：4。

进一步地，步骤（2）中，蒸干后的残渣加入甲醇溶解，并定容至10ml。

进一步地，所述流动相中乙酸铵水溶液中乙酸铵的质量分数为0.1-0.5 %。

进一步地，所述流动相中乙酸铵水溶液中乙酸铵的质量分数0.2%。

进一步地，所述流动相流速为0.5 mL/min；所述柱温为40℃；所述进样量为5μL。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

（1）本发明中，采用超高效液相色谱法来测定墓头回中齐墩果酸和熊果酸的含量。与高效液相色谱法相比，超高效液相色谱法拥有柱效更高，分离效率高、检测速度快、灵敏度高、可成为良好的质谱入口等优点。该方法能够准确测定墓头回中齐墩果酸和熊果酸的含量，对墓头回中的有关物质进行有效分离和检测，进而实现对墓头回质量的严格监控，可以确保墓头回的安全性和有效性。本发明通过对齐墩果酸和熊果酸甲醇溶液紫外吸收波长的测定，选取210nm作为本发明的吸收波长；与其他流动相相比，甲醇-乙酸铵水溶液为流动相能够将齐墩果酸和熊果酸进行良好的分离；当流速在0.2-1.0 mL/min范围内，进样量在5-20μL范围内时，齐墩果酸和熊果酸能够得到有效的分离，出峰时间稳定且峰形良好，易于进行含量的计算。

（2）专属性强，能够实现对墓头回药材中齐墩果酸和熊果酸的含量测定，且与其他物质间不存在相互干扰，实验过程所用的空白溶剂对齐墩果酸和熊果酸的检测也无干扰。

（3）灵敏度高，本发明中齐墩果酸和熊果酸检出限浓度分别为0.1007 μg/mL和0.1016 μg/mL，定量限分别为1.007 μg/mL和1.016 μg/mL。

（4）实用性强，可以用于墓头回药材中齐墩果酸和熊果酸含量测定及的批量处理，保证了检测结果良好的重现性。

（5）检测速度快，本发明选择了不同的色谱条件，提高了分离效率和准确率，分离分析时间大大缩短，可用于大量样本的分析，节约了时间和检测试剂，经济效益高。

附图说明

图1是墓头回样品与齐墩果酸、熊果酸对照品液相色谱图。

图2是齐墩果酸对照品标准曲线图。

图3是熊果酸对照品标准曲线图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。

实施例1：

（1）对照品溶液的配制：

分别精密称取齐墩果酸（中国食品药品检定研究院，110709-201607，含量以91.7％计，使用前不需干燥处理）和熊果酸（中国食品药品检定研究院，110742-201622，含量以94.7%计，使用前不需干燥处理）对照品约100 mg，置于10 ml的量瓶中，加适量甲醇稀释使溶解，并用其稀释至刻度，摇匀，分别制成浓度为10 mg/mL的齐墩果酸和熊果酸对照品储备液。

分别精密量取齐墩果酸和熊果酸对照品储备液5、10、20、50、100、500、1000 μL，分别置10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，以此分别作为齐墩果酸和熊果酸的标准溶液。

（2）样品溶液的配制：

取过4号筛（250μm±9.9μm,65目）的墓头回粉末约4 g，精密称定，加甲醇50 ml，超声处理60分钟，过滤，然后将滤液蒸干，残渣加水10 ml溶解，用20ml水饱和正丁醇提取3次，合并提取液；将提取液蒸干，残渣加甲醇20 ml，盐酸4 ml,加热回流水解4 h，放冷，加10 ml水，用20 ml三氯甲烷振摇提取3次，合并提取液；将得到的提取液蒸干，得到的残渣加甲醇溶解，转移至10 ml的量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，弃去初滤液，取续滤液，以此作为样品溶液，样品溶液中药材浓度为400mg/ml。

（3）绘制标准曲线：

分别取不同浓度的齐墩果酸和熊果酸标准溶液，从低浓度到高浓度依次上超高效液相色谱仪进行定量测定，色谱条件为采用4.6×100 mm，2.6 μm phenomenex Kinetex色谱柱；以体积比为85：15的甲醇-0.2%乙酸铵水溶液为流动相，流速0.5mL/min；紫外检测器检测，检测波长210 nm；柱温：40 ℃；进样量5 μL。以浓度（c）为横坐标，以对应峰面积（A）为纵坐标，绘制标准曲线。

表1. 线性回归方程

检测结果如表1所示，齐墩果酸在5.035～1007 μg/mL范围内，熊果酸在5.08～1016 μg/mL范围内，其浓度与峰面积呈良好的线性关系。

（4）测定样品溶液：

取样品溶液上超高效液相色谱仪进行定量测定，获得齐墩果酸和熊果酸的峰面积，根据标准曲线计算齐墩果酸和熊果酸的含量。计算得出齐墩果酸0.56mg/ml,熊果酸0.28mg/ml，即该墓头回药材中含有0.14%齐墩果酸，0.07%熊果酸。

实施例2：

与实施例1中步骤（1）~（4）基本相同，仅做如下改变：色谱条件为：采用4.6×100 mm，2.6 μm phenomenex Kinetex色谱柱；以体积比为85：15的甲醇-0.1%乙酸铵水溶液为流动相，流速0.2mL/min；紫外检测器检测，检测波长210 nm；柱温：30℃；进样量20μL。

实施例3：

与实施例1中步骤（1）~（4）基本相同，仅做如下改变：色谱条件为：采用4.6×100 mm，2.6 μm phenomenex Kinetex色谱柱；以体积比为85：15的甲醇-0.5%乙酸铵水溶液为流动相，流速1.0mL/min；紫外检测器检测，检测波长210 nm；柱温：35℃；进样量15μL。

实施例4：专属性试验

分别精密量取实施例1中齐墩果酸和熊果酸对照品储备溶液1 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，以此作为齐墩果酸和熊果酸对照品溶液，齐墩果酸和熊果酸对照品溶液浓度均为1mg/mL。

依次取齐墩果酸对照品溶液、熊果酸对照品溶液及实施例1步骤（2）中墓头回样品溶液，色谱条件为采用4.6×100 mm，2.6 μm phenomenex Kinetex色谱柱；以体积比为85：15的甲醇-0.2%乙酸铵水溶液为流动相，流速0.5mL/min；紫外检测器检测，检测波长210nm；柱温：40 ℃；进样量5 μL，分别进样分析，记录色谱图。图1为墓头回样品溶液与齐墩果酸、熊果酸对照品液相色谱图，试验结果显示，齐墩果酸和熊果酸对照品溶液和墓头回样品溶液主峰的峰形良好，保留时间齐墩果酸为11.9 min，熊果酸为12.5 min，且空白溶剂甲醇在齐墩果酸和熊果酸保留位置无干扰。

实施例5：精密度试验

取实施例4中齐墩果酸和熊果酸对照品溶液，色谱条件：采用4.6×100 mm，2.6 μmphenomenex Kinetex色谱柱；以体积比为85：15的甲醇-0.2%乙酸铵水溶液为流动相，流速0.5mL/min；紫外检测器检测，检测波长210 nm；柱温：40 ℃；进样量5 μL。在上述色谱条件下连续测定5次，记录峰面积。

表2. 精密度试验结果

表2为精密度测试的结果，从上表中可以看出，齐墩果酸峰面积的RSD为1.18%（n=5），熊果酸峰面积的RSD为0.12%（n=5）。结果表明，此方法系统精密度良好。

实施例6：重复性试验

取同一批号的墓头回样品（南通三越中药饮片有限公司，批号20150220）5份，按照实施例1步骤（2）中所述方法制备样品溶液，色谱条件：采用4.6×100 mm，2.6 μm phenomenexKinetex色谱柱；以体积比为85：15的甲醇-0.2%乙酸铵水溶液为流动相，流速0.5mL/min；紫外检测器检测，检测波长210 nm；柱温：40 ℃；进样量5 μL，分别进样检测，记录峰面积。将峰面积测定结果代入齐墩果酸和熊果酸标准曲线的回归方程，结果见表3。

表3. 重复性测定结果

表3为重复性测定结果表，从上表中可以看出，测得齐墩果酸的平均含量为0.045% ，RSD为1.48%（n=5），熊果酸的平均含量为0.026% ，RSD为1.04%（n=5）。因此，本发明所述超高效液相色谱法测定墓头回中齐墩果酸、熊果酸含量的方法具有良好的重复性。

实施例7：稳定性试验

取实施例1步骤（2）中制备的样品溶液，于室温下放置，分别在放置0、4、8、12、16、24、48h后，将其在色谱条件：采用4.6×100 mm，2.6 μm phenomenex Kinetex色谱柱；以体积比为85：15的甲醇-0.2%乙酸铵水溶液为流动相，流速0.5mL/min；紫外检测器检测，检测波长210nm；柱温：40 ℃；进样量5 μL，分别进样检测，记录峰面积。，

表4. 稳定性试验结果

表4为稳定性试验结果，从表4中可以看出，齐墩果酸峰面积的RSD为1.63%（n=7），熊果酸峰面积的RSD为1.53%（n=7），结果表明供试品溶液可在室温下48 h内保持稳定。

实施例8：加样回收率试验

称取已知齐墩果酸和熊果酸含量的墓头回药材样品（南通三越中药饮片有限公司，批号20150220）18份，每份约2 g，精密称定后，置50 mL量瓶中，前9份分别精密加入实施例4中制备的齐墩果酸对照品溶液0.77 ml、0.97 ml、1.17 ml，加甲醇稀释至刻度，摇匀，以此作为低、中、高三个浓度，每个浓度平行制备三份，后9份分别精密加入含熊果酸对照品溶液0.4 ml、0.5 ml、0.6 ml，加甲醇稀释至刻度，摇匀，加甲醇稀释至刻度，摇匀，以此作为低、中、高三个浓度，每个浓度平行制备三份。

按照实施例1中步骤（2）所述方法来制备样品溶液，然后在色谱条件：采用4.6×100 mm，2.6 μm phenomenex Kinetex色谱柱；以体积比为85：15的甲醇-0.2%乙酸铵水溶液为流动相，流速0.5mL/min；紫外检测器检测，检测波长210 nm；柱温：40 ℃；进样量5 μL，分别进样检测，记录峰面积。

表5. 加样回收率试验结果（n=9）

表5为加样回收率试验结果，从表5中可以看出，测得齐墩果酸组溶液的平均回收率为90.20%，RSD值为1.52%（n=9）；齐墩果酸组溶液的平均回收率为95.87%，RSD值为1.31%（n=9）。由此可知药材提取过程科学合理，保证了齐墩果酸和熊果酸成分被充分提取。

实施例9：准确性试验

分别精密量取齐墩果酸和熊果酸对照品储备液500 μL，置于10 mL量瓶中混匀，用甲醇稀释至刻度，摇匀，以此作为齐墩果酸和熊果酸的混合溶液，该溶液齐墩果酸和熊果酸浓度均为500 μg/ml。然后在色谱条件：采用4.6×100 mm，2.6 μm phenomenex Kinetex色谱柱；以体积比为85：15的甲醇-0.2%乙酸铵水溶液为流动相，流速0.5mL/min；紫外检测器检测，检测波长210 nm；柱温：40 ℃；进样量5 μL，进样检测，记录齐墩果酸和熊果酸的峰面积。将峰面积测定结果分别代入齐墩果酸和熊果酸标准曲线的回归方程，算得齐墩果酸和熊果酸含量。该混合溶液测定结果为齐墩果酸浓度为：495.43 μg/ml, 熊果酸浓度为：502.02μg/ml，与实际浓度十分接近，结果表明测定结果准确。

实施例10：实际样品的检测

分别取不同来源的墓头回11批，按照实施例1步骤（2）中所述方法制备样品溶液，在色谱条件：采用4.6×100 mm，2.6 μm phenomenex Kinetex色谱柱；以体积比为85：15的甲醇-0.2%乙酸铵水溶液为流动相，流速0.5mL/min；紫外检测器检测，检测波长210 nm；柱温：40℃；进样量5 μL，分别进样检测，记录齐墩果酸和熊果酸的峰面积。将峰面积测定结果分别代入齐墩果酸和熊果酸标准曲线的回归方程，算得齐墩果酸和熊果酸含量。

表6. 齐墩果酸、熊果酸含量测定结果（n=11）

编号	样品来源	样品批号	齐墩果酸（%）	熊果酸（%）
					1	东台市兴林中药饮片有限公司	20160630	0.14	0.07
2	苏州市天灵中药饮片有限公司	20180716	0.16	0.09
					3	张家港市绿色中药饮片有限公司	161102	0.30	0.06
4	泰州市高港中药饮片有限公司	20171110	0.09	0.05
					5	徐州医药股份有限公司中药饮片厂	20170430	0.11	0.11
6	江苏华洪药业科技有限公司	180506	0.11	0.08
					7	亳州市永刚饮片厂有限公司	150910	0.10	0.07
8	南通三越中药饮片有限公司	20150220	0.05	0.02
					9	亳州药市	20181021	0.04	0.02
10	亳州市华云中药饮片有限公司	20180820	0.12	0.08
					11	亳州药市	20181020	0.08	0.21

表6为不同来源的墓头回药材中齐墩果酸和熊果酸含量的测定结果，齐墩果酸和熊果酸含量越高，墓头回药材质量越好。建议以平均测定值的80％设限，规定墓头回药材含量测定齐墩果酸应不得少于0.1％，熊果酸应不得少于0.06％。

所述实施例为本发明的优选的实施方式，但本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员能够做出的任何显而易见的改进、替换或变型均属于本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种超高效液相色谱法测定墓头回中齐墩果酸、熊果酸含量的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）对照品溶液的配制：

分别称取一定量齐墩果酸和熊果酸，加甲醇溶解，分别配制成浓度为10 mg/mL的齐墩果酸和熊果酸对照品储备液；

量取一定量齐墩果酸和熊果酸对照品储备液，用甲醇稀释，摇匀，分别得到不同浓度的齐墩果酸和熊果酸标准溶液；

（2）样品溶液的配制：

将墓头回粉末萃取处理，然后加热回流后再次进行萃取处理得到样品溶液；

（3）绘制标准曲线：

分别取不同浓度的齐墩果酸和熊果酸标准溶液，从低浓度到高浓度依次上超高效液相色谱仪进行定量测定，以浓度（c）为横坐标，以对应峰面积（A）为纵坐标，绘制标准曲线；

（4）测定样品溶液：

取样品溶液上超高效液相色谱仪进行定量测定，获得齐墩果酸和熊果酸的峰面积，根据标准曲线计算齐墩果酸和熊果酸的含量；

步骤（3）和（4）中，超高效液相色谱仪测定的色谱条件为：采用4.6×100 mm，2.6 μmphenomenex Kinetex色谱柱；以体积比为85：15的甲醇-乙酸铵水溶液为流动相，流速0.2-1.0 mL/min；紫外检测器检测，检测波长210 nm；柱温：30-40 ℃；进样量5-20 μL。

2.根据权利要求1所述的超高效液相色谱法测定墓头回中齐墩果酸、熊果酸含量的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述齐墩果酸和熊果酸对照品标准溶液的浓度均为5~1000μg/ml。

3.根据权利要求1所述的超高效液相色谱法测定墓头回中齐墩果酸、熊果酸含量的方法，其特征在于，步骤（2）样品溶液配制的步骤为：

将过4号筛的墓头回粉末与甲醇混合并超声溶解，过滤，然后蒸干滤液，加蒸馏水溶解，用水饱和正丁醇振摇提取3次，合并提取液；

将提取液蒸干后加入甲醇、盐酸，在80℃下加热回流水解4h，水解结束后冷却，加入蒸馏水溶解，用三氯甲烷提取3次，合并提取液，蒸干；

蒸干后的残渣加甲醇溶解，摇匀，过滤，取续滤液作为样品溶液。

4.根据权利要求3所述的超高效液相色谱法测定墓头回中齐墩果酸、熊果酸含量的方法，其特征在于，所述墓头回粉末与甲醇的用量比为4g;20~100ml；所述蒸馏水用量为10ml；所述水饱和正丁醇用量为20ml；提取液蒸干后添加的甲醇和盐酸体积比为20：4；所述蒸干后的残渣加入甲醇溶解，并定容至10ml。

5. 根据权利要求1所述的超高效液相色谱法测定墓头回中齐墩果酸、熊果酸含量的方法，其特征在于，所述流动相中乙酸铵水溶液中乙酸铵的质量分数为0.1-0.5 %。

6.根据权利要求5所述的超高效液相色谱法测定墓头回中齐墩果酸、熊果酸含量的方法，其特征在于，所述流动相中乙酸铵水溶液中乙酸铵的质量分数0.2%。

7. 根据权利要求1所述的超高效液相色谱法测定墓头回中齐墩果酸、熊果酸含量的方法，其特征在于，所述流动相流速为0.5 mL/min。

8.根据权利要求1所述的超高效液相色谱法测定墓头回中齐墩果酸、熊果酸含量的方法，其特征在于，所述柱温为40℃。

9.根据权利要求1所述的超高效液相色谱法测定墓头回中齐墩果酸、熊果酸含量的方法，其特征在于，所述进样量为5μL。

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