CN111089930B - 一种辛夷配方颗粒uplc特征图谱构建方法及其成分含量测定 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种辛夷配方颗粒UPLC特征图谱构建方法及其成分含量测定，所述的辛夷配方颗UPLC特征图谱的建立方法包含如下步骤：（1）精密称取辛夷配方颗粒，制备得到辛夷配方颗粒供试品溶液；（2）将辛夷配方颗粒供试品溶液采用超高效液相色谱仪分析，得到辛夷配方颗粒UPLC特征图谱。本发明构建的辛夷配方颗粒的特征图谱，充分展示了辛夷配方颗粒的化学成分特征，本发明构建的特征图谱全面的反应样品的特征峰信息，且方法稳定，精密度高，重现性较好；本发明从UPLC特征图谱、木兰脂素含量测定、木兰花碱含量测定三个角度控制辛夷配方颗粒的质量，能够更加有效的评价辛夷配方颗粒的质量。
Description
技术领域
本发明涉及中药材检测技术领域，具体公开了一种辛夷配方颗粒UPLC特征图谱构建方法及其成分含量测定。
背景技术
辛夷为木兰科植物望春花、玉兰或武当玉兰的干燥花蕾，具有散风寒，通鼻窍的作用，用于治疗风寒头痛，鼻塞流涕，鼻鼽，鼻渊，始载于《神农本草经》，列为上品，历代本草均有收载。现代化学和药理学研究表明，辛夷主含挥发油，木脂素，黄酮，生物碱等有效成分，具有抗炎、抗过敏、降压、兴奋子宫等药理作用，临床上多用于治疗鼻炎及鼻窦炎。
传统中药饮片临床使用以汤剂为主，汤剂的活性成分是中药临床有效性的物质基础，辛夷配方颗粒以水为溶剂，经现代工业提取、浓缩、干燥、制粒而制成，作为新的饮片形式代替传统饮片供临床辨证论治、随证加减、配方使用。目前辛夷配方颗粒的质量控制模式仍延续传统的化学药品的控制思路，多以木兰脂素为定量指标，然而以木兰脂素为代表的木脂素类有效成分极性较小，水溶性差，因此，该类化学成分从饮片到配方颗粒的转移率并不高，单独测定木兰脂素等木脂素类成分，对辛夷配方颗粒的生产工艺的质量控制略显不足。另外，单一的化学成分定量分析难以全面反映配方颗粒的内在质量，且亦缺乏专属性，中药色谱指纹/特征图谱能够提供更为全面、丰富的定量和半定量信息。传统的高效液相色谱（HPLC）指纹/特征图谱因柱效低、色谱分离能力有限，分析时间长的缺点，已经难以适应中药复杂体系的研究。超高效液相色谱法（UPLC）因分辨率高、分离能力强、分析时间大大缩短，在中药指纹/特征图谱的建立方面优势明显。
发明内容
本发明的目的在于提供一种辛夷配方颗粒UPLC特征图谱的构建方法及其成分含量测定，本发明从多角度控制辛夷配方颗粒的质量，该方法专属性强，分析时间短，能够有效提升辛夷配方颗粒的质量控制水平。
本发明所要解决的上述技术问题，通过如下技术方案予以实现：
一种辛夷配方颗粒的UPLC特征图谱的构建方法，其包含如下步骤：
（1）精密称取辛夷配方颗粒粉末，制备得到辛夷配方颗粒供试品溶液；
（2）将辛夷配方颗粒供试品溶液采用超高效液相色谱仪分析，得到辛夷配方颗粒UPLC特征图谱。
作为一种优选方案，所述超高效液相色谱仪分析的色谱条件为：采用规格为2.1mm×100mm，1.9μm的YMC Triart C18色谱柱，柱温28~32℃，以乙腈为流动相A，以体积分数0.07%~0.14%的磷酸水溶液为流动相B进行梯度洗脱，流速为0.28~0.32 ml/min，检测波长为200~260nm，进样量为0.5~1.5μl。
作为一种最优选方案，所述超高效液相色谱仪分析的色谱条件为：采用规格为2.1mm×100mm，1.9μm的YMC Triart C18色谱柱，柱温30℃，以乙腈为流动相A，以体积分数0.1%的磷酸水溶液为流动相B进行梯度洗脱，流速为0.3 ml/min，检测波长为230nm，进样量为1μl。
作为一种优选方案，所述梯度洗脱条件为：0~15min，流动相A的体积分数变化为10%~15%，流动相B的体积分数变化为90%~85%；15~25min，流动相A的体积分数变化为15%~38%，流动相B的体积分数变化为85%~62%；25~35min，流动相A的体积分数变化为38%~44%，流动相B的体积分数变化为62%~56%；35~39min，流动相A的体积分数变化为44%~100%，流动相B的体积分数变化为56%~0%；39~40min，流动相A的体积分数为100%，流动相B的体积分数变化为0%。
作为一种优选方案，所述的供试品溶液通过包含如下步骤的方法制备得到：取辛夷配方颗粒，研细，取0.1~0.3g，精密称定，置具容器中，精密加入70%~90%甲醇20~30ml，称定重量，超声处理20~40分钟，放冷，再称定重量，用70%~90%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
作为一种最优选方案，所述的供试品溶液通过包含如下步骤的方法制备得到：取辛夷配方颗粒，研细，取0.2g，精密称定，置具容器中，精密加入80%甲醇25ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用80%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
本发明还提供了一种辛夷配方颗粒成分含量测定方法，包括如下步骤：
（1）分别吸取对照品溶液和待测辛夷配方颗粒样品溶液注入超高效液相色谱仪，测定相应峰面积。
（2）通过外标法计算，即得。
作为一种优选方案，所述待测辛夷配方颗粒样品溶液的制备方法为：取辛夷配方颗粒，研细，取0.1~0.3g，精密称定，置具容器中，精密加入70%~90%甲醇20~30ml，称定重量，超声处理20~40分钟，放冷，再称定重量，用70%~90%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
作为一种最优选方案，所述待测辛夷配方颗粒样品溶液的制备方法为：取辛夷配方颗粒，研细，取0.2g，精密称定，置具容器中，精密加入80%甲醇25ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用80%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
作为一种优选方案，所述检测成分为木兰脂素，所述对照品溶液的制备方法为：取木兰脂素对照品，精密称定，加甲醇制成每1ml含45~65μg的溶液，即得。
作为一种最优选方案，所述检测成分为木兰脂素，所述对照品溶液的制备方法为：取木兰脂素对照品，精密称定，加甲醇制成每1ml含55μg的溶液，即得。
作为一种优选方案，所述的超高效液相色谱仪分析的色谱条件为：采用规格为2.1mm×100mm，1.9μm的YMC Triart C18色谱柱，柱温28~32℃，流速为0.28~0.32 ml/min，检测波长为250~300nm，进样量为0.5~1.5μl，以乙腈为流动相A，以0.07%~0.14%的磷酸水溶液为流动相B进行洗脱，洗脱条件为：流动相A的体积分数为38%~46%，流动相B的体积分数为54%~62%。
作为一种最优选方案，所述的超高效液相色谱仪分析的色谱条件为：采用规格为2.1mm×100mm，1.9μm的YMC Triart C18色谱柱，柱温30℃，流速为0.3ml/min，检测波长为278nm，进样量为1μl，以乙腈为流动相A，以0.1%的磷酸水溶液为流动相B进行洗脱，洗脱条件为：流动相A的体积分数为42%，流动相B的体积分数为58%。
作为一种优选方案，所述检测成分为木兰花碱，所述对照品溶液的制备方法为：取木兰花碱对照品，精密称定，加甲醇制成每1ml含80~120μg的溶液，即得。
作为一种最优选方案，所述检测成分为木兰花碱，所述对照品溶液的制备方法为：取木兰花碱对照品，精密称定，加甲醇制成每1ml含100μg的溶液，即得。
作为一种优选方案，所述的超高效液相色谱仪分析的色谱条件为：采用规格为2.1mm×100mm，1.8μm的Waters HSS T3色谱柱，柱温28~32℃，流速为0.28~0.32 ml/min，检测波长为250~300nm，进样量为0.5~1.5μl，以乙腈为流动相A，以0.05%~0.15%磷酸二氢钠水溶液为流动相B，洗脱条件为：流动相A的体积分数为8%~14%，流动相B的体积分数为86%~92%。
作为一种最优选方案，所述的超高效液相色谱仪分析的色谱条件为：采用规格为2.1mm×100mm，1.8μm的Waters HSS T3色谱柱，柱温30℃，流速为0.3 ml/min，检测波长为268nm，进样量为1μl，以乙腈为流动相A，以0.1%磷酸二氢钠水溶液为流动相B，洗脱条件为：流动相A的体积分数为11%，流动相B的体积分数为89%。
有益效果：（1）本发明采用UPLC法建立辛夷配方颗粒的特征图谱，实现对辛夷配方颗粒中有效成分的定量和定性分析；（2）本发明构建的辛夷配方颗粒的特征图谱，充分展示了辛夷配方颗粒的化学成分特征，本发明构建的特征图谱全面的反应样品的特征峰信息，且方法稳定，精密度高，重现性较好；（3）本发明从UPLC特征图谱、木兰脂素含量测定、木兰花碱含量测定三个角度控制辛夷配方颗粒的质量，能够更加有效的评价辛夷配方颗粒的质量。
附图说明
图1为 10批辛夷配方颗粒共有特征峰的标识图；
图2 为辛夷对照药材特征图谱；
图3 为辛夷配方颗粒特征图谱特征峰的指认图；
图4 为辛夷配方颗粒对照特征图谱；
图5为辛夷配方颗粒特征图谱专属性考察图；
图6为辛夷配方颗粒木兰脂素含量测定专属性考察图；
图7为辛夷配方颗粒含量测定峰纯度考察图；
图8为木兰脂素标准曲线图；
图9辛夷配方颗粒木兰花碱含量测定专属性考察图
图10为辛夷配方颗粒木兰花碱含量测定峰纯度考察图；
图11木兰花碱标准曲线图。
图中标记：2（S1）：木兰花碱参照峰；5（S2）：木兰脂素参照峰。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
辛夷配方颗粒特征图谱的构建
1.主要仪器、试剂与试药
1.1主要仪器：Waters H-Class超高效液相色谱仪（沃特世公司）；YMC Triart C18（100mmx2.1mm，1.9μm）色谱柱， ME204E万分之一分析天平（梅特勒-托利多公司）；XP26百万分之一分析天平（梅特勒-托利多公司）；JJ600电子天平（常熟市双杰测试仪器厂）；KQ500D数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；HWS28型恒温水浴锅（上海一恒科技有限公司）；Milli-Q Direct超纯水系统（默克股份有限公司）。
1.2主要试剂：乙醇（西陇科学有限公司，分析纯）；甲醇（西陇科学有限公司，分析纯）；磷酸（天津市科密欧化学试剂有限公司，色谱纯）；乙腈（默克股份有限公司，色谱纯）；水为超纯水（实验室自制）。
1.3主要试药：木兰脂素（中国食品药品检定研究院，含量：96.5%）；木兰花碱（四川维克奇生物科技有限公司，含量：98.0%）；松脂素二甲醚（伊普赛诺，含量：100.0%）；辛夷对照药材（中国食品药品检定研究院）；10批辛夷配方颗粒（批号：CG1~CG10）。
2.试验方法
2.1辛夷配方颗粒的制备方法为：取辛夷饮片6000g，加水煎煮，收集挥发油，用β-环糊精包合，挥发油与β-环糊精比例为1:8，备用，滤过，滤液浓缩成清膏，加入挥发油包合物50g，喷雾干燥，再加入麦芽糖精150g、二氧化硅20g，混匀，制粒，即得。
2.2超高效液相色谱仪分析的色谱条件为：采用规格为2.1mm×100mm，1.9μm的YMCTriart C18色谱柱，柱温30℃，以乙腈为流动相A，以体积分数0.1%的磷酸水溶液为流动相B进行梯度洗脱，流速为0.3 ml/min，检测波长为230nm，进样量为1μl。
2.3梯度洗脱条件为：0~15min，流动相A的体积分数变化为10%~15%，流动相B的体积分数变化为90%~85%；15~25min，流动相A的体积分数变化为15%~38%，流动相B的体积分数变化为85%~62%；25~35min，流动相A的体积分数变化为38%~44%，流动相B的体积分数变化为62%~56%；35~39min，流动相A的体积分数变化为44%~100%，流动相B的体积分数变化为56%~0%；39~40min，流动相A的体积分数为100%，流动相B的体积分数变化为0%。
2.4参照物溶液的制备：取辛夷对照药材0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加50%乙醇50ml，称定重量，超声处理45分钟，放冷，再称定重量，用50%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得对照药材参照物溶液，取木兰脂素和木兰花碱对照品，加甲醇制成每1ml含木兰脂素50μg、木兰花碱100μg的混合对照品作为对照品参照物溶液。
2.5供试品溶液的制备：取辛夷配方颗粒，研细，取0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇25ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用80%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
3.辛夷配方颗粒特征图谱共有特征峰的确定
3.1取10批辛夷配方颗粒样品，按供试品溶液制备方法，制备供试品溶液，取辛夷对照药材，按对照药材参照物溶液制备方法，制备对照药材参照物溶液，在规定色谱条件下，进样测定，使用《中药色谱指纹图谱相似度评价软件》对10批辛夷配方颗粒特征图谱进行共有峰标识，确定分离度较好，色谱峰纯度较高、与辛夷配方颗粒药效相关且与辛夷对照药材特征峰数目一致的7个共有峰为辛夷配方颗粒特征图谱的特征峰，如图1所示，辛夷对照药材特征图谱见图2。
4.特征峰的指认
4.1超高效液相色谱仪分析的色谱条件为：采用规格为2.1mm×100mm，1.9μm的YMCTriart C18色谱柱，柱温30℃，以乙腈为流动相A，以体积分数0.1%的磷酸水溶液为流动相B进行梯度洗脱，流速为0.3 ml/min，检测波长为230nm，进样量为1μl。
4.2梯度洗脱条件为：0~15min，流动相A的体积分数变化为10%~15%，流动相B的体积分数变化为90%~85%；15~25min，流动相A的体积分数变化为15%~38%，流动相B的体积分数变化为85%~62%；25~35min，流动相A的体积分数变化为38%~44%，流动相B的体积分数变化为62%~56%；35~39min，流动相A的体积分数变化为44%~100%，流动相B的体积分数变化为56%~0%；39~40min，流动相A的体积分数为100%，流动相B的体积分数变化为0%。
4.3对照品溶液制备：取木兰脂素对照品，精密称定，加甲醇制成每1ml含55μg的溶液，即得；取木兰花碱对照品，精密称定，加甲醇制成每1ml含100μg的溶液，即得；取松脂素二甲醚对照品，精密度称定，加甲醇制成每1ml含100μg的溶液。
4.4供试品溶液的制备：取辛夷配方颗粒，研细，取0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇25ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用80%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
4.5样品测定：分别取木兰脂素、木兰花碱、松脂素二甲醚对照品溶液及辛夷配方颗粒供试品溶液各1μl，注入超高效液相色谱仪，测定，实验结果见图3所示，在辛夷标准汤剂特征图谱中能找到与木兰花碱、木兰脂素、松脂素二甲醚保留时间一致的特征峰。
5.辛夷配方颗粒UPLC特征图谱标准的确定
5.1样品的测定
按照辛夷配方颗粒UPLC特征图谱测定方法，测定10批辛夷配方颗粒的特征图谱，与木兰花碱参照物相应的峰为S1峰，与木兰脂素参照物相应的峰为S2峰，计算特征峰1与参照峰S1的相对保留时间和相对峰面积，计算特征峰3、4、6和7与参照峰S2的相对保留时间和相对峰面积，结果见表1、表2。
表1 10批辛夷配方颗粒特征图谱相对保留时间
表2 10批辛夷配方颗粒特征图谱相对峰面积
结果显示，与木兰花碱参照物峰相对应的峰为S1峰，计算峰1与S1峰的相对保留时间和相对峰面积，10批辛夷配方颗粒特征峰1的相对保留时间RSD值为0.32%，相对峰面积RSD值为9.36%；与木兰脂素参照物峰相对应的峰为S2峰，计算峰3、4、6、7与S2峰的相对保留时间和相对峰面积，其相对保留时间RSD值在0.05~0.12%范围内，相对峰面积RSD值在11.20%~17.83%范围内；说明不同批次的辛夷配方颗粒各特征峰的相对保留时间比较稳定，相对峰面积批与批之间有较大的差异。为严格控制辛夷配方颗粒的质量，为辛夷配方颗粒的生产工艺提供更全面的质量控制参数，对辛夷配方颗粒特征图谱各特征峰的相对峰面积设定限量标准十分必要，根据10批辛夷配方颗粒特征峰1、3、4、6、7的相对峰面积测定结果，考虑10批大生产样品的代表性，取各特征峰相对峰面积的最低、最高值，规定5个特征峰的相对峰面积范围，即：以兰花碱参照物峰相对应的峰为S1峰，计算特征峰1与S1峰的相对峰面积，峰1的相对峰面积范围在0.138~0.177，以木兰脂素参照物峰相对应的峰为S2峰，计算特征峰3、4、6、7与S2峰的相对峰面积，峰3的相对峰面积范围为0.229~0.343，峰4的相对峰面积范围为0.516~0.698，峰6的相对峰面积范围为0.122~0.214，峰7的相对峰面积范围为0.180~0.258。
5.2相似度评价
将上述10批辛夷配方颗粒特征图谱cdf格式导入“中药色谱特征图谱相似度评价系统”（2012版）软件中，以批号为CG1样品的特征图谱为参照图谱，以2和5号峰为Mark峰进行保留时间校正，并进行全峰匹配，以平均数法生成辛夷配方颗粒对照特征图谱，见图4。分别计算各样品特征图谱与对照特征图谱的相似度，见表3。
表3 10批辛夷配方颗粒相似度评价表
结果显示，10批样品特征图谱相似度均在0.95以上，相似度较高，说明10批辛夷配方颗粒质量差异不大，为严格控制大生产辛夷配方颗粒的质量，根据10批样品的测定结果，规定按中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算，辛夷配方颗粒供试品特征图谱与对照特征图谱的相似度应不得低于0.95。
5.3辛夷配方颗粒UPLC特征图谱标准
根据10批辛夷配方颗粒样品的研究结果，最终确定辛夷配方颗粒特征图谱标准为：供试品色谱中应呈现7个特征峰，并应与对照药材参照物色谱中的7个特征峰保留时间相对应，其中两个峰应分别与相应的对照品参照物峰保留时间相对应，与木兰花碱参照物相应的峰为S1峰，计算峰1与S1峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10%范围之内；规定值为：0.76（峰1），计算峰1与S1的相对峰面积，规定峰1的相对峰面积范围为0.138~0.177，与木兰脂素参照物相应的峰为S2峰，计算峰3~峰7与S2峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10%范围之内；规定值为：0.69（峰3）、0.98（峰4）、1.03（峰6）、1.05（峰7），计算峰3~峰7与S峰3的相对峰面积，其相对峰面积应在规定范围内，规定范围为0.229~0.343（峰3）、0.516~0.698（峰4）、0.122~0.214（6）、0.180~0.258（峰7）；按中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算，辛夷配方颗粒供试品特征图谱与对照品特征图谱的相似度应不得低于0.95。
6.辛夷配方颗粒特征图谱方法学验证
6.1专属性考察
根据辛夷制备工艺研究中的成型工艺生产试验结果，辛夷配方颗粒中所添加的辅料为麦芽糊精、二氧化硅及包合挥发油所用的β-环糊精。本次实验考察缺辛夷的阴性样品对辛夷配方颗粒特征图谱的影响，取缺辛夷的阴性样品按规定的供试品制备方法制备阴性样品溶液。取辛夷配方颗粒特征图谱供试品溶液、阴性样品溶液、参照物溶液，按规定的色谱条件进样分析，记录色谱图，结果见图5。
结果显示，通过专属性实验结果表明该分析方法能正确检测所指认的特征峰，不受提取溶剂和辅料的干扰。
6.2精密度考察
取辛夷配方颗粒（批号CG9），研细，取0.2g，按规定供试品溶液制备方法制备供试品溶液，在规定色谱条件下进样分析，连续进样6次，以2号峰木兰花碱峰为参照峰S1，以5号峰木兰脂素峰为参照峰S2，计算峰1与参照峰S1的相对保留时间和相对峰面积，计算峰3~7与参照峰S2的相对保留时间和相对峰面积，并计算RSD值。实验结果见表4和表5。
表4 辛夷配方颗粒特征图谱精密度考察结果（相对保留时间）
表5 辛夷配方颗粒特征图谱精密度考察结果（相对峰面积）
实验结果显示，在精密度考察中，同一份供试品溶液，连续进样6次，各特征峰的相对保留时间RSD在0.04%~0.18%范围内，相对峰面积RSD在0.10%~0.69%范围内，相对保留时间和相对峰面积RSD值均小于2.0%，表明仪器精密度良好。
6.3重复性考察
取辛夷配方颗粒（批号CG9），研细，取0.2g，平行6份，制备6份供试品溶液，在规定色谱条件进样分析，以2号峰木兰花碱峰为参照峰S1，以5号峰木兰脂素峰为参照峰S2，计算峰1与参照峰S1的相对保留时间和相对峰面积，计算峰3~峰7与参照峰S2的相对保留时间和相对峰面积，并计算RSD值。实验结果见表6和表7。
表6 辛夷配方颗粒特征图谱重复性考察结果（相对保留时间）
表7 辛夷配方颗粒特征图谱重复性考察结果（相对峰面积）
实验结果显示，同一批次样品，重复测定6次，各特征峰的相对保留时间RSD在0.06%~0.25%范围内，相对峰面积RSD在0.14%~0.63%范围内，相对保留时间和相对峰面积RSD值均小于2.0%，表明该方法重复性良好。
6.4稳定性考察
取辛夷配方颗粒（批号CG9），研细，取0.2g，制备供试品溶液，在规定色谱条件下分别在0小时、2小时、4小时、6小时、8小时、10小时、12小时进样分析，以2号峰木兰花碱峰为参照峰S1，以5号峰木兰脂素峰为参照峰S2，计算峰1与参照峰S1的相对保留时间和相对峰面积，计算峰3~7与参照峰S2的相对保留时间和相对峰面积，并计算RSD值。实验结果见表8和表9。
表8 辛夷配方颗粒特征图谱稳定性考察结果（相对保留时间）
表9 辛夷配方颗粒特征图谱稳定性考察结果（相对峰面积）
实验结果显示，同一份供试品溶液在12小时内多次进样测定，各特征峰的相对保留时间RSD在0.07%~0.24%范围内，各特征峰的相对峰面积RSD在0.20%~0.51%范围内，对保留时间和相对峰面积RSD值均小于2.0%，表明供试品溶液在12小时内相对稳定性良好。
实施例2
辛夷配方颗粒成分含量测定方法，包括如下步骤：
（1）分别吸取对照品溶液和待测辛夷配方颗粒样品溶液注入超高效液相色谱仪，测定相应峰面积。
（2）通过外标法计算，即得。
所述检测成分为木兰脂素。
1. 仪器、试剂与试药
1.1主要仪器：Waters超高效液相色谱仪（沃特世公司）；Thermo 超高效液相色谱仪（赛默飞世尔科技有限公司），YMC Triart C18（2.1×100mm，1.9μm）柱，Waters AcquityHSS T3 C18（2.1×100mm，1.8μm）柱，Waters Acquity BEH C18（2.1×100mm，1.7μm）色谱柱，万分之一天平（ME204E，梅特勒-托利多公司），十万分之一天平（ABT220-5DM，广州得翔科技有限公司），百万分之一天平（XP26，梅特勒-托利多公司），电子天平（JJ600，常熟市双杰测试仪器厂）；数控超声波清洗器（KQ500D，昆山市超声仪器有限公司）；恒温水浴锅（HWS28型，上海一恒科技有限公司）；超纯水系统（Milli-Q Direct，默克股份有限公司）。
1.2主要试剂
乙醇（西陇科学有限公司，分析纯）、甲醇（西陇科学有限公司，分析纯）；磷酸（天津市科密欧化学试剂有限公司，色谱纯）、乙腈（默克股份有限公司，色谱纯）、水为超纯水（实验室自制）。
1.3主要试药
木兰脂素对照品（含量96.5%，中国食品药品检定研究院）；辛夷配方颗粒（批号：CG1~CG10；来源：广东一方制药有限公司）。
2.色谱条件
采用规格为2.1mm×100mm，1.9μm的YMC Triart C18色谱柱，柱温30℃，流速为0.3ml/min，检测波长为278nm，进样量为1μl，以乙腈为流动相A，以0.1%的磷酸水溶液为流动相B进行洗脱，洗脱条件为：流动相A的体积分数为42%，流动相B的体积分数为58%。
3.对照品溶液的制备
取木兰脂素对照品，精密称定，加甲醇制成每1ml含55μg的溶液，即得。
4.供试品溶液的制备
4.1提取溶剂考察
取辛夷配方颗粒（CG9），研细，取0.2g，精密称定，平行6组，每组2份，置具塞锥形瓶中，分别精密加入甲醇、80%甲醇、50%甲醇、30%甲醇、乙醇、50%乙醇25ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，分别用相应溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，在规定的色谱条件测定，实验结果见表10。
表10 辛夷配方颗粒木兰脂素含量测定不同提取溶剂考察
结果显示：甲醇和80%甲醇的提取效率最高，两者无明显区别，因此，选择80%甲醇为提取溶剂，与特征图谱项下供试品溶液制备方法保持一致。
4.2提取方式考察
取辛夷配方颗粒（CG9），研细，取0.2g，精密称定，平行2组，每组2份，置具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇25ml，称定重量，分别超声处理30分钟、加热回流30分钟，放冷，再称定重量，用80%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，按规定色谱条件下测定，实验结果见表11。
表11辛夷配方颗粒木兰脂素含量测定不同提取方式考察
实验结果表明，超声和回流提取效果相当，从耗能与实验操作简便考虑，选择超声处理。
4.3溶剂用量考察
取辛夷（配方颗粒（CG9），研细，取0.2g，精密称定，平行3组，每组2份，置具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇15ml、25ml、50ml，称定重量，分别超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用80%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，在规定色谱条件测定，实验结果见表12。
表12 辛夷配方颗粒木兰脂素含量测定溶剂用量的考察
实验结果表明：不同提取溶剂用量对辛夷配方颗粒含量测定影响不大，考虑实验室环境影响，为充分提取，将提取溶剂用量定为25ml。
4.4提取时间考察
取辛夷配方颗粒（CG9），研细，取0.2g，精密称定，平行3组，每组2份，置具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇25ml，称定重量，分别超声处理15分钟、30分钟和45分钟，放冷，再称定重量，用80%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，在规定色谱条件下测定，实验结果见表13。
表13辛夷配方颗粒木兰脂素含量测定提取时间的考察
实验结果表明：不同提取时间对辛夷配方颗粒含量测定影响不大，15分钟已能提取完全，考虑到实验环境影响，为保证充分提取，将超声时间定为30分钟。
4.5供试品溶液制备方法的确定
取辛夷配方颗粒，研细，取0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇25ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用80%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
5.方法学验证
5.1专属性考察
辛夷配方颗粒中所添加的辅料为芽糊精、二氧化硅及包合挥发油所用的β-环糊精。本次实验考察缺辛夷的阴性样品对辛夷配方颗粒木兰脂素含量测定的影响。取缺辛夷的阴性样品按供试品制备方法制备阴性样品溶液。取辛夷配方颗粒（CG9）供试品溶液、阴性溶液与木兰脂素对照品溶液注入液相色谱仪，按规定的色谱条件下测定，结果见图6。
结果显示，阴性色谱图中在与木兰脂素相应的保留时间处没有色谱峰，说明辅料及溶剂对木兰脂素的测定无干扰，以本法测定辛夷配方颗粒中木兰脂素的含量具有专属性。
5.2峰纯度考察
取辛夷配方颗粒（CG9）制备供试品溶液、木兰脂素对照品溶液，取得供试品溶液、木兰脂素对照品溶液各1μl，注入液相色谱仪，在规定的色谱条件下以DAD检测器进行190nm~400nm扫描检测，计算峰纯度。结果见图7。
结果显示，样品中木兰脂素峰未检测到杂质峰，纯度因子在计算出的阈值限值内，说明在该色谱条件下，木兰脂素峰纯度符合定量要求。
5.3精密度考察
精密吸取浓度为54.39μg/ml的对照品溶液，在规定的色谱条件重复进样6次，计算木兰脂素峰面积RSD值，测定结果见表14。
表14 辛夷配方颗粒木兰脂素含测精密度考察结果（n=6）
结果显示，同一份对照品溶液连续进样6针，峰面积的RSD为0.68%，说明仪器精密度良好。
5.4线性关系考察
精密称取木兰脂素对照品19.462mg，置于10ml量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，制成每1ml含1878.083μg的对照品母液。
分别精密移取上述对照品母液5ml、2ml、1ml、0.5ml、0.1ml置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，制成每1ml含939.042μg、375.617μg、187.808μg、93.904μg、18.781μg的对照品溶液。分别精密吸取上述6个不同浓度的对照品溶液1μl，在规定的色谱条件进样分析，记录色谱峰面积。以峰面积为纵坐标（y），对照品浓度为横坐标（x），绘制标准曲线，结果见表15，标准曲线见图8。
表15 辛夷配方颗粒木兰脂素含量测定线性考察结果
5.5稳定性考察
取辛夷配方颗粒（CG9），研细，取0.2g，精密称定，制备供试品溶液，在规定的色谱条件分别在0、2、4、6、8、10、12小时进样，计算不同时间点木兰脂素峰面积RSD值，测定结果见表16。
表16 辛夷配方颗粒木兰脂素含量测定稳定性考察结果
结果显示，同一份供试品溶液在不同时间点进样，木兰脂素峰面积RSD为0.36%，说明供试品溶液在12小时内稳定性良好。
5.6重复性考察
取辛夷配方颗粒（CG9），研细，取0.2g，精密称定，平行6份，制备6份供试品溶液，在规定的色谱条件进行测定，计算木兰脂素含量及RSD值，测定结果见表17。
表17 辛夷配方颗粒木兰脂素含量测定重复性考察结果
结果显示，同一批样品，连续测定6次，木兰脂素含量均值为23.68mg/g，6次测定RSD值为0.27%，说明该方法重复性良好。
5.7准确度试验
精密称定木兰脂素对照品24.576mg，置20ml量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，作为对照品加样母液，取12个具塞锥形瓶，分为4组，每组3份，其中3组作为加样组，分别按照对照品与样品木兰花碱含量比值分别为0.5:1，1:1，1.5:1的比例加入浓度为1185.792μg/ml的木兰脂素对照品溶液1ml、2ml、3ml，氮气吹干，另一组不加对照品作为样品测定组，取辛夷配方颗粒（CG9），研细，取0.1g，平行12份，精密称定，置于上述锥形瓶中，分别精密加入80%甲醇25ml，称定重量，超声处理（功率300W，频率40kHz）30分钟，放冷，再称定重量，用80%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。在规定的色谱条件进样测定，计算木兰脂素的含量和加样回收率，结果见表18。
表18 辛夷配方颗粒木兰脂素含量测定加样回收率考察结果
结果显示，木兰脂素的加样回收率范围为95.20%~98.31%，平均回收率为96.52%，RSD为0.85%，表明该方法准确性良好。
5.8中间精密度考察
选择不同的测定时间、不同的高效液相色谱仪、不同实验人员（人员2），取辛夷配方颗粒（CG9），研细，取0.2g，平行6份，精密称定，制备6份供试品溶液，在规定的色谱条件进样测定，计算木兰脂素含量及RSD值，结果见表19。
表19 辛夷配方颗粒木兰脂素含量测定中间精密度考察结果
实验结果显示，不同分析人员在不同日期和不同色谱仪下操作，辛夷配方颗粒木兰脂素含量测定值RSD小于2.0%，说明该分析方法中间精密度良好。
5.9耐用性考察
5.9.1不同色谱柱考察
比较不同色谱柱对辛夷配方颗粒木兰脂素含量测定的影响，本次考察了4种色谱柱。
取辛夷配方颗粒（CG9），研细，取0.2g，精密称定，制备供试品溶液，色谱条件除了色谱柱分别为YMC Triart C18（2.1×100mm，1.9μm）柱，Waters Acquity HSS T3 C18（2.1×100mm，1.8μm）柱，Waters Acquity BEH C18（2.1×100mm，1.7μm）柱，其它色谱条件不变，实验结果见表20。
表20 辛夷配方颗粒木兰脂素含量测定不同色谱柱耐用性考察结果
实验结果：比较不同色谱柱的分离效果及含量值，各色谱柱分离效果良好，含量RSD为1.20%，表明该分析方法在不同色谱柱下分析耐用性较好。
5.9.2不同柱温考察
比较柱温分别为28℃、30℃和32℃对辛夷配方颗粒木兰脂素含量测定的影响。
取辛夷配方颗粒（批号：CG9），研细，取0.2g，精密称定，制备供试品溶液，除柱温分别为28℃、30℃和32℃，其他条件色谱条件均不变，分别进样测定，计算不同柱温下木兰脂素的含量，实验结果见表21。
表21 辛夷配方颗粒木兰脂素含量测定不同柱温耐用性考察结果
结果显示，比较三种不同柱温
的辛夷配方颗粒的含量值，含量RSD为0.80%，表明该分析方法在柱温
范围内耐用性良好。
5.9.3不同
考察
比较流速分别为0.28ml/min、0.30ml/min和0.32ml/min对辛夷配方颗粒木兰脂素含量测定的影响。
取辛夷配方颗粒（批号：CG9），研细，取0.2g，精密称定，制备供试品溶液，除柱温分别为28℃、30℃和32℃，其余色谱条件均同，分别进样测定，测定不同流速下木兰脂素含量，实验结果见表22。
表22 辛夷配方颗粒木兰脂素含量测定不同流速耐用性考察结果
实验结果显示，三种不同流速
下，辛夷配方颗粒木兰脂素含量测定值RSD为0.57%，表明该分析方法在流速
范围内耐用性良好。
5.10样品测定
测定结果见表23 。
表23 10批辛夷配方颗粒木兰脂素含量测定结果表
根据10批辛夷配方颗粒木兰脂素的含量测定结果，以均值的70%为限度标准，辛夷配方颗粒木兰脂素的含量应不低于16.96mg/g，即每克配方颗粒含木兰脂素（C23H28O7）应不低于16.96mg。
实施例3
辛夷配方颗粒成分含量测定方法，包括如下步骤：
（1）分别吸取对照品溶液和待测辛夷配方颗粒样品溶液注入超高效液相色谱仪，测定相应峰面积。
（2）通过外标法计算，即得。
所述检测成分为木兰花碱。
1、仪器、试剂与试药
1.1主要仪器：Thermo vanquish UPLC超高效液相色谱仪（赛默飞世尔科技有限公司），Waters Acquity HSS T3（柱长为100mm，内径为2.1mm，粒径为1.8μm）色谱柱，WatersCortecs T3(柱长为100mm，内径为2.1mm，粒径为1.6μm)色谱柱，Waters ACQUITY UPLC BEHC18(柱长为100mm，内径为2.1mm，粒径为1.7μm)色谱柱，万分之一天平（ME204E，梅特勒-托利多公司），百万分之一天平（XP26，梅特勒-托利多公司），电子天平（JJ600，常熟市双杰测试仪器厂）；数控超声波清洗器（KQ500D，昆山市超声仪器有限公司）；恒温水浴锅（HWS28型，上海一恒科技有限公司）；超纯水系统（Milli-Q Direct，默克股份有限公司）。
1.2主要试剂：乙醇（西陇科学有限公司，分析纯）、甲醇（西陇科学有限公司，分析纯）；磷酸二氢钠（天津市科密欧化学试剂有限公司，分析纯），乙腈（默克股份有限公司，色谱纯）、水为实验室自制超纯水。
1.3试药：木兰花碱对照品（含量98.0%，四川维克奇生物科技有限公司）；辛夷配方颗粒（批号：CG1~CG10；来源：广东一方制药有限公司）。
2.色谱条件：采用规格为2.1mm×100mm，1.8μm的Waters HSS T3色谱柱，柱温30℃，流速为0.3 ml/min，检测波长为268nm，进样量为1μl，以乙腈为流动相A，以0.1%磷酸二氢钠水溶液为流动相B，洗脱条件为：流动相A的体积分数为11%，流动相B的体积分数为89%。
3. 对照品溶液的制备：取木兰花碱对照品，精密称定，加甲醇制成每1ml含100μg的溶液，即得。
4. 供试品溶液的制备
4.1提取溶剂的考察
取辛夷配方颗粒（批号：CG9），研细，取0.2g，精密称定，精密称定，平行6组，每组2份，置具塞锥形瓶中，分别精密加入甲醇、80%甲醇、50%甲醇、30%甲醇、乙醇、50%乙醇25ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，分别用相应溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，注入液相色谱仪，测定，实验结果见表24。
表24辛夷配方颗粒木兰花碱含量测定不同提取溶剂考察
实验结果表明：甲醇和80%甲醇的提取效率最高，两者无明显区别，因此，选择80%的甲醇为提取溶剂，和标准汤剂保持一致。
4.2提取方式考察
取辛夷配方颗粒（批号：CG9），研细，取0.2g，精密称定，平行2组，每组2份，置具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇25ml，称定重量，分别超声处理30分钟、加热回流30分钟，放冷，再称定重量，用80%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，在规定的色谱条件下测定，实验结果见表25。
表25 辛夷配方颗粒木兰花碱含量测定不同提取方式测定结果
实验结果表明，超声和回流提取效果相当，从耗能与实验操作简便考虑，选择超声提取。
4.3溶剂用量考察
取辛夷配方颗粒（批号：CG9），研细，取0.2g，精密称定，平行3组，每组2份，置具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇15ml、25ml、50ml，称定重量，分别超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用80%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，在规定色谱条件下测定，实验结果见表26。
表26 辛夷配方颗粒木兰花碱含量测定溶剂用量考察
实验结果表明：不同提取溶剂用量对辛夷配方颗粒木兰花碱含量测定影响不大，考虑实验室环境影响，为充分提取，将提取溶剂用量定为25ml。
4.4提取时间考察
取辛夷配方颗粒（批号：CG9），研细，取0.2g，精密称定，平行3组，每组2份，置具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇25ml，称定重量，分别超声处理15分钟、30分钟和45分钟，放冷，再称定重量，用80%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，在规定的色谱条件下测定，实验结果见表27。
表27辛夷配方颗粒木兰花碱含量测定不同提取时间考察
实验结果表明：不同提取时间对辛夷配方颗粒含量测定影响不大，15分钟已能提取完全，考虑到实验环境影响，为保证充分提取，将超声时间定为30分钟。
4.5供试品溶液制备方法的确定
取辛夷配方颗粒，研细，取0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇25ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用80%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
5.方法学验证
5.1专属性考察
辛夷配方颗粒中所添加的辅料为芽糊精、二氧化硅及包合挥发油所用的β-环糊精。本次实验考察缺辛夷的阴性样品对辛夷配方颗粒木兰花碱含量测定的影响。取缺辛夷的阴性样品按供试品制备方法制备阴性样品溶液。取辛夷配方颗粒（CG9）供试品溶液、阴性溶液与木兰花碱对照品溶液注入液相色谱仪，在规定色谱条件下测定，结果见图9。
实验结果表明：阴性色谱图中在与木兰脂素相应的保留时间处没有色谱峰，说明辅料及溶剂对木兰花碱的测定无干扰，以本法测定辛夷配方颗粒中木兰花碱的含量具有专属性。
5.2峰纯度考察
取辛夷配方颗粒（CG9）供试品溶液、木兰花碱对照品溶液各1μl，注入液相色谱仪，在规定色谱条件下以DAD检测器进行190nm~400nm扫描检测，计算峰纯度。结果见图10。
实验结果表明，样品中木兰花碱峰未检测到杂质峰，纯度因子在计算出的阈值限值内，说明在该色谱条件下，木兰花碱峰纯度符合定量要求。
5.3精密度考察
精密吸取浓度为104.92μg/ml的木兰花碱对照品溶液，在规定色谱条件下重复进样6次，计算木兰花碱峰面积RSD值，测定结果见表28。
表28 辛夷配方颗粒木兰花碱含量测定精密度考察结果（n=6）
结果显示，同一份对照品溶液连续进样6针，木兰花碱峰面积RSD值为2.60%，说明仪器精密度良好。
5.4线性关系考察
精密称取木兰花碱对照品20.356mg，置于10ml量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，制成每1ml含1994.888μg的对照品母液。
分别精密移取上述对照品母液5ml、2ml、1ml、0.5ml、0.1ml置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，制成每1ml含997.444μg、398.978μg、199.489μg、99.744μg、19.949μg的对照品溶液。分别精密吸取上述6个不同浓度的对照品溶液1μl，在规定色谱条件下进样分析，记录色谱峰面积。以峰面积为纵坐标（y），对照品浓度为横坐标（x），绘制标准曲线，结果见表29，标准曲线见图11。
表29 辛夷配方颗粒木兰花碱含量测定线性考察结果
结果显示，木兰花碱的回归方程为：y =11.899x +17.288，其相关系数r=0.9999，表明木兰花碱在浓度19.949μg/ml~1994.888μg/ml的范围内，浓度与峰面积线性关系良好。
5.5稳定性考察
取辛夷配方颗粒（CG9），研细，取0.2g，精密称定，制备供试品溶液，在规定色谱条件下分别在0、2、4、6、8、10、12、24小时进样，计算不同时间点木兰花碱峰面积RSD值，测定结果见表30。
表30 辛夷配方颗粒木兰花碱含量测定稳定性考察结果
5.6重复性考察
取辛夷配方颗粒（CG9），研细，取0.2g，精密称定，平行6份，制备6份供试品溶液，在规定色谱条件下进行测定，计算木兰花碱含量及RSD值，测定结果见表31。
表31 辛夷配方颗粒木兰花碱含量测定重复性考察结果
5.7精确度试验
精密称定木兰花碱对照品27.719mg，置20ml量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，作为对照品加样母液，取10个锥形瓶，分为4组，前3组每组3份，分别按照对照品与样品木兰花碱含量比值为0.5:1，1:1，1.5:1的比例加入浓度为1358.231μg/ml的木兰花碱对照品加样母液1ml、2ml、3ml，氮气吹干，另一组不加对照品作为样品测定组，取辛夷配方颗粒（CG9），研细，取0.1g，平行10份，精密称定，置于上述锥形瓶中，分别精密加入80%甲醇25ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用80%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。在规定色谱条件下进样测定，计算木兰花碱的含量和加样回收率，结果见表32。
表32辛夷配方颗粒木兰花碱含量测定加样回收率考察结果
5.8中间精密度考察
选择不同的测定时间、不同的高效液相色谱仪、不同实验人员（人员2），取辛夷配方颗粒（CG9），研细，取0.2g，平行6份，精密称定，制备6份供试品溶液，在规定色谱条件下进样测定，计算木兰花碱含量及RSD值，结果见表33。
表33 辛夷配方颗粒木兰花碱含量测定中间精密度考察结果
5.9准确度试验
5.9.1不同色谱柱考察
比较不同色谱柱对辛夷配方颗粒木兰花碱含量测定的影响，本次考察3种色谱柱，分别是Waters HSS T3（柱长为100mm，内径为2.1mm，粒径为1.8μm）柱，Waters Cortecs T3(柱长为100mm，内径为2.1mm，粒径为1.6μm)柱，Waters ACQUITY UPLC BEH C18(柱长为100mm，内径为2.1mm，粒径为1.7μm)柱。
取辛夷配方颗粒（CG9），研细，取0.2g，精密称定，制备供试品溶液，除色谱柱分别采用上述三种不同类型的色谱柱外，其余色谱条件均同，分析测定木兰花碱的含量，实验结果见下表34。
表34 辛夷配方颗粒木兰花碱含量测定不同色谱柱耐用性考察结果
实验结果显示，采用上述3种不同的色谱柱，木兰花碱分离度均大于1.5，符合定量要求，3种不同的色谱测得木兰花碱含量RSD值为0.09%，表明该分析方法对不同的色谱柱耐用性良好。
5.9.2不同柱温考察
比较柱温分别为28℃、30℃和32℃对辛夷配方颗粒木兰花碱含量测定的影响。
取辛夷配方颗粒（CG9），研细，取0.2g，精密称定，制备供试品溶液，除柱温分别为28℃、30℃和32℃外，其余色谱条件均同，分析测定不同柱温下木兰花碱的含量，实验结果见表35。
表35 辛夷配方颗粒木兰花碱含量测定不同柱温耐用性考察结果
实验结果显示，在不同的柱温下测定，木兰花碱的含量RSD值为2.30%，说明该方法对柱温的较小变动耐用性良好。
5.9.3不同流速考察
比较流速分别为0.28ml/min、0.30ml/min和0.32ml/min对辛夷配方颗粒木兰花碱含量测定的影响。
取辛夷配方颗粒（CG9），研细，取0.2g，精密称定，制备供试品溶液，除流速分别为0.28ml/min、0.30ml/min和0.32ml/min，其他色谱条件均同，分析测定不同流速下木兰花碱的含量，实验结果见表36。
表36 辛夷配方颗粒木兰花碱含量测定不同流速耐用性考察结果
实验结果显示，三种不同流速
下，辛夷配方颗粒木兰花碱含量测定值RSD为2.34%，表明该分析方法在流速
范围内耐用性良好。
5.9.4不同流动相比例考察
比较3种不同流动相比例，分别是：乙腈-0.1mol/L磷酸二氢钠溶液（12:88），乙腈-0.1mol/L磷酸二氢钠溶液（11:89），乙腈-0.1mol/L磷酸二氢钠溶液（10:90）对辛夷配方颗粒木兰花碱含量测定的影响。
取辛夷配方颗粒（批号CG9），研细，取0.2g，精密称定制备供试品溶液，除乙腈-0.1mol/L磷酸二氢钠溶液的比例分别为12:88，11:89和10:90外，其余色谱条件均同，分析测定不同流动相比例下辛配方颗粒木兰花碱的含量。实验结果见表37。
表37 辛夷配方颗粒木兰花碱含量测定不同流动相比例耐用性考察结果
实验结果显示，采用3种不同比例的流动相进行分析测定，木兰花碱的含量RSD值为2.99%，表明该方法对流动相的较小变动耐用性良好。
5.10样品测定
测定结果见表38。
表38 10批辛夷配方颗粒木兰花碱含量测定结果表
根据10批辛夷配方颗粒木兰花碱的含量测定结果，以均值的70%为限度标准，辛夷配方颗粒木兰花碱的含量应不低于18.86mg/g，即每克配方颗粒含木兰花碱（C20H24NO4）应不低于18.86mg。
实施例4
辛夷配方颗粒特征图谱的测定
检测样品为广东一方制药有限公司，批号CG9。
1.色谱条件：采用规格为2.1mm×100mm，1.9μm的 YMC Triart C18色谱柱，以乙腈为流动相A，0.1%磷酸水溶液为流动相B；按表39的规定进行梯度洗脱，流速为每分钟0.3ml，检测波长为230nm，柱温为30℃。
表39 梯度洗脱表
2.参照物溶液的制备：取辛夷对照药材0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加50%乙醇50ml，称定重量，超声处理45分钟，放冷，再称定重量，用50%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得对照药材参照物溶液；取木兰脂素和木兰花碱对照品，加甲醇制成每1ml含木兰脂素50μg、木兰花碱100μg的混合对照品作为对照品参照物溶液。
3.供试品溶液的制备：取辛夷配方颗粒，研细，取0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇25ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用80%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
4.测定法：分别精密吸取参照物溶液、供试品溶液各1μl，注入超高效液相色谱仪测定，以木兰花碱参照物峰相对应的峰为S1峰，计算峰1与S1峰的相对保留时间和相对峰面积，以木兰脂素参照物峰相对应的峰为S2峰，计算峰3、4、6、7与S2峰的相对保留时间和相对峰面积。
5.测定结果：各特征峰的相对保留时间和相对峰面积测定结果见表40，该批次辛夷配方颗粒特征图谱各特征峰的相对保留时间和相对峰面积均在标准规定的范围内，说明该批次颗粒质量符合规定。
表40辛夷配方颗粒各特征峰的相对保留时间和相对峰面积测定结果
实施例5
辛夷配方颗粒木兰脂素的含量测定
检测样品为广东一方制药有限公司，批号CG9。
1.色谱条件：采用规格为2.1mm×100mm，1.9μm的YMC Triart C18色谱柱，柱温30℃，流速为0.3 ml/min，检测波长为278nm，进样量为1μl，以乙腈为流动相A，以0.1%的磷酸水溶液为流动相B进行梯度洗脱，梯度洗脱条件为：流动相A的体积分数为42%，流动相B的体积分数为58%。
2.对照品溶液的制备：木兰脂素对照品溶液1：精密称定木兰脂素对照品2.505mg，置20ml量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，精密移取4.5ml置10ml的量瓶中，用甲醇稀释并定容至刻度，摇匀，即得每1ml含54.39μg的溶液；木兰脂素对照品溶液2：精密称定木兰脂素对照品2.195mg，置20ml量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，精密移取5ml置10ml的量瓶中，用甲醇稀释并定容至刻度，摇匀，即得每1ml含52.95μg的溶液。
3.供试品溶液的制备：取辛夷配方颗粒，研细，取0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇25ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用80%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
4.测定法：分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液各1μl，注入超高效液相色谱仪测定。
5.测定结果：批号为CG9的辛夷配方颗粒木兰脂素含量测定结果见表41，木兰脂素的含量在规定的限度内，说明该批次颗粒质量合格。
表41辛夷配方颗粒木兰脂素含量测定结果
实施例6
辛夷配方颗粒木兰花碱的含量测定
检测样品为广东一方制药有限公司，批号CG9。
1.色谱条件：采用规格为2.1mm×100mm，1.8μm的Waters HSS T3色谱柱，柱温30℃，流速为0.3 ml/min，检测波长为268nm，进样量为1μl，以乙腈为流动相A，以0.1%的磷酸二氢钠水溶液为流动相B进行梯度洗脱，梯度洗脱条件为：流动相A的体积分数为11%，流动相B的体积分数为89%。
2.对照品溶液的制备：木兰花碱对照品溶液1：精密称定木兰花碱对照品3.059mg，置20ml量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，精密移取7ml置10ml量瓶中，加甲醇稀释并定容至刻度，得每1ml含104.92μg的溶液；木兰花碱对照品溶液2：精密称定木兰花碱对照品2.544mg，置20ml量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，精密移取8ml置10ml量瓶中，加甲醇稀释并定容至刻度，得每1ml含99.72μg的溶液。
3.供试品溶液的制备：取辛夷配方颗粒，研细，取0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇25ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用80%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
4.测定法：分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液各1μl，注入超高效液相色谱仪测定。
5.测定结果：批号为CG9的辛夷配方颗粒木兰花碱的含量测定结果见表42，木兰花碱的含量在规定的限度内，说明该批次颗粒质量合格。
表42 辛夷配方颗粒木兰花碱的含量测定结果
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明的范围内。本发明要求的保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。
Claims (2)
1.一种辛夷配方颗粒UPLC特征图谱的构建方法，其特征在于，包含如下步骤：
（1）精密称取辛夷配方颗粒粉末，制备得到辛夷配方颗粒供试品溶液；
（2）将辛夷配方颗粒供试品溶液采用超高效液相色谱仪分析，得到辛夷配方颗粒UPLC特征图谱；
所述超高效液相色谱仪分析的色谱条件为：采用规格为2.1mm×100mm，1.9μm的YMCTriart C18色谱柱，柱温28~32℃，以乙腈为流动相A，以体积分数0.07%~0.14%的磷酸水溶液为流动相B进行梯度洗脱，流速为0.28~0.32ml/min，检测波长为200~260nm，进样量为0.5~1.5μl；
所述梯度洗脱条件为：0~15min，流动相A的体积分数变化为10%~15%，流动相B的体积分数变化为90%~85%；15~25min，流动相A的体积分数变化为15%~38%，流动相B的体积分数变化为85%~62%；25~35min，流动相A的体积分数变化为38%~44%，流动相B的体积分数变化为62%~56%；35~39min，流动相A的体积分数变化为44%~100%，流动相B的体积分数变化为56%~0%；39~40min，流动相A的体积分数为100%，流动相B的体积分数变化为0%。
2.根据权利要求1所述的辛夷配方颗粒UPLC特征图谱的构建方法，其特征在于，所述的供试品溶液通过包含如下步骤的方法制备得到：取辛夷配方颗粒，研细，取0.1~0.3g，精密称定，置塞具容器中，精密加入70%~90%甲醇20~30ml，称定重量，超声处理20~40分钟，放冷，再称定重量，用70%~90%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
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Denomination of invention: A method for constructing UPLC characteristic maps of Xinyi formula granules and determining their component content Effective date of registration: 20231225 Granted publication date: 20220412 Pledgee: Bank of China Limited by Share Ltd. Foshan branch Pledgor: GUANGDONG YIFANG PHARMACEUTICAL Co.,Ltd. Registration number: Y2023980073969 |