CN114184719B - 一种保元汤的双波长指纹图谱建立方法及其标准指纹图谱 - Google Patents
一种保元汤的双波长指纹图谱建立方法及其标准指纹图谱 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种保元汤的双波长指纹图谱建立方法:根据保元汤处方制备保元汤煎液;取保元汤煎液,制成供试品溶液;精确称取人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、甘草苷、甘草酸铵、6‑姜辣素对照品,配成混合对照品溶液;将供试品溶液注入高效液相色谱仪测定,得到的指纹谱图;其中高效液相色谱仪检测波长为200‑205nm和250‑260nm;流动相A:100%乙腈,流动相B:体积分数为0.05‑0.2%的磷酸水溶液。本发明提供的双波长指纹图谱方法可有效地表征保元汤五味药中的主要化学成分,为保元汤的全面质量控制提供了有效的检测方法。
Description
技术领域
本发明属于中药检测及质量控制技术领域,具体涉及一种保元汤的双波长指纹图谱建立方法及及其标准指纹图谱。
背景技术
2018年4月13日国家中医管理局公布了《古代经典名方目录(第一批)》,最早源自《博爱心鉴》(明·魏直),由《兰室秘藏》(金·李东垣)黄芪汤衍化而来,并收录于《简明医彀》(明·孙志宏)中,原方记载:“人参(一钱)、黄芪(二钱)、甘草(五分)、肉桂(二分)、又加生姜一片”,煎煮方法:“每剂水二钟,煎八分,渣用水钟半,煎七分”。
保元汤主治功效为治元气虚弱,精神倦怠,肌肉柔慢,饮食少进,面青白,睡卧宁静,及有杂证,皆属虚弱,宜服;其药理作用主要有对免疫系统、血液系统、心血管系统作用及抗氧化作用等;现代临床主要应用于治疗冠心病、慢性肾功能衰竭、肾炎、再生障碍性贫血、慢性乙型肝炎及术后感染等。
经典名方的开发是目前中医药行业发展的研究热点,以古代医籍中记载的制作方法为主要依据,利用现代制作方法还原古方从而制成现代中药方剂;经典名方的《申报资料》中规定应研究全面反映对应实物质量信息的内容,特别是建立多味中药复方各成分的指纹图谱信息及指纹图谱方法,对经典名方质量控制及质量可传递性具有十分重要的意义。
公开号为CN 110907580 A的专利中采用HPLC仅检测了保元汤人参中人参皂苷Rg1、Re、Rb1三个成分的特征图谱,公开号为CN 112903882 A的专利中用HPLC仅检测了保元汤人参、黄芪和甘草中的指纹图谱。然而中药复方保元汤中成分复杂、化合物性质差异大,每种成分的紫外吸收特征各异,单波长的指纹图谱检测方法难以全面、有效地反应复方中的多成分类型信息,由上可见,亟需一种可全面检测保元汤主要成分的双波长指纹图谱检测方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是,针对现有技术中无简单快速的指纹图谱方法全面控制保元汤质量。
本发明的技术方案是,一种保元汤的双波长指纹图谱建立方法,包括以下步骤:
(1)根据保元汤处方制备保元汤煎液;
(2)取保元汤煎液,制成供试品溶液;
(3)精确称取人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、甘草苷、甘草酸铵、6-姜辣素对照品,配成混合对照品溶液;
(4)将供试品溶液和混合对照品溶液注入高效液相色谱仪测定,得到保元汤指纹图谱;其中高效液相色谱仪检测波长为200-205nm和250-260nm;流动相A:100%乙腈,流动相B:体积分数为0.05-0.2%的磷酸水溶液。
优选地,步骤(4)中,色谱条件为:
采用梯度洗脱:0~5min,14%~17%乙腈,86%~83%磷酸水溶液;
5~12min,17%~19%乙腈,83%~81%磷酸水溶液;
12~59min,19%~25%乙腈,81%~75%磷酸水溶液;
59~75min,25%~30%乙腈,75%~70%磷酸水溶液;
75~120min,30%~47%乙腈,70%~53%磷酸水溶液;
流速:1.0mL/min;柱温:25℃;进样量10μL。
优选地,步骤(4)中,高效液相色谱仪的检测波长为203nm和254nm。
优选地,步骤(1)中,保元汤煎液的制备方法如下:将一份保元汤的处方药材用水煎煮两次,一煎:加水300mL,煎至120mL,过滤;二煎:加水225mL,煎至105mL,过滤,合并两次煎液225mL备用。
优选地,步骤(2)中,供试品溶液的制备方法为取少量保元汤煎液,离心,取上清液加在固相萃取柱上,用水和甲醇水溶液洗脱弃去;收集纯甲醇的洗脱液,蒸干,加甲醇定容,即得。
优选地,步骤(2)中,量取保元汤煎液50ml,然后4000r/min离心10min,量取10mL上清液,加在C18固相萃取小柱上,吸附后,用双蒸水10mL洗脱,弃去,体积分数为15%的甲醇水溶液10mL洗脱,弃去,最后用纯甲醇20mL洗脱并收集,蒸干,加甲醇定容至5mL容量瓶中,摇匀,过滤,即得。
优选地,保元汤原料药材包括:人参、黄芪、甘草、肉桂和生姜。
通常,所述保元汤的一份处方重量分别为:人参3.73g,黄芪7.46g,甘草1.86g,肉桂0.75g,生姜3g。
本发明还提供根据上述的保元汤的双波长指纹图谱建立方法建立标准指纹图谱,按照上述的保元汤的双波长指纹图谱建立方法对不同产地的10-20个批次的保元汤药材进行测定,得到不同产地10-20批次保元汤煎液的指纹图谱,导入2012版“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”确定保元汤的指纹图谱的共有峰,这些共有峰构成了保元汤的指纹特征,可作为保元汤的标准指纹图谱。
本发明在保元汤指纹图谱双波长检测中,参考《中国药典》,保元汤中各味药材所含的主要成分包括人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、甘草苷、甘草酸铵、桂皮醛、6-姜辣素等,由于各成分的极性、性质不同,对pH的敏感程度亦不同,本发明的申请人经过多次研究和反复的试验最终总结出:人参皂苷Re响应值较小,易受阴性干扰;黄芪甲苷紫外吸收弱,需使用ELSD检测器检测;桂皮醛具有挥发性不易准确定性鉴别。
本发明的申请人通过研究和上述的因素考量,最终确定人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1主要发生末端吸收适于选择波长203nm,且生姜中的6-姜辣素在该波长下灵敏度高分离度好,故人参和生姜选择波长203nm进行检测;黄芪和甘草中的毛蕊异黄酮葡萄糖苷、甘草苷、甘草酸铵在波长254nm下无阴性干扰、灵敏度高、响应值大、分离度较好,故黄芪和甘草选择波长254nm进行检测。
本发明的保元汤的双波长指纹图谱建立方法中,保元汤供试品指纹图谱共有峰有18个,峰1、10和13来自黄芪,峰2、3、4、5、7、9、12、15、17来自甘草、8、14和16来自人参,峰18来自生姜,6号峰是黄芪和甘草共有,11号峰是人参和甘草共有,由上可见甘草对保元汤指纹图谱作出很大贡献。
本发明的保元汤的双波长指纹图谱建立方法中,在双波长下,与混合对照品指纹图谱对比能够明确指认出6个色谱峰;254nm下共有14个峰,可指认出3个峰,分别是1号峰毛蕊异黄酮葡萄糖苷,3号峰甘草苷,17号峰甘草酸铵;203nm下共10个峰,可指认出3个色谱峰,分别是8号峰人参皂苷Rg1,14号峰人参皂苷Rb1和18号峰6-姜辣素;该指认出的6个峰分别与对照品峰保留时间一致,分别来自保元汤中人参、黄芪、甘草和生姜四味药。
本发明提供的一种双波长的检测方法,优选采用十八烷基键合硅胶色谱柱,流动相为100%乙腈和体积分数为0.1%磷酸水溶液,经过多次实验摸索出的梯度洗脱程序,进样量、流速和柱温等色谱条件,得到简单、快速地检测各指标性成分的色谱峰,且能全面地反映保元汤化学成分的种类和数量,实现经典名方保元汤的质量控制。
本发明的有益效果是,利用本发明的保元汤的双波长指纹图谱建立方法,所得到两种波长下的色谱图中,峰的数量较多且峰信息对应,基线平稳、灵敏度高、分离度好,可全面、稳定、有效和快速地实现保元汤中各单味药的质量控制。
附图说明
图1为本发明实施例中提供的254nm下保元汤指纹图谱。
图2为本发明实施例中提供的203nm下保元汤指纹图谱。
图3为本发明实施例中提供的254nm下混合对照品指纹图谱。
图4为本发明实施例中提供的203nm下混合对照品指纹图谱。
图5为本发明实施例中提供的254nm下15批保元汤HPLC指纹叠加图谱。
图6为本发明实施例中提供的203nm下15批保元汤HPLC指纹叠加图谱。
具体实施方式
为了更好的解释本发明,以便于理解,下面结合附图,通过具体实施方式,对本发明作详细描述。
为了更好的理解上述技术方案,下面将参照附图更详细地描述本发明的示例性实施例。虽然附图中显示了本发明的示例性实施例,然而应当理解,可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反,提供这些实施例是为了能够更清楚、透彻地理解本发明,并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
实施例:
一、保元汤煎液的制备方法:
称取保元汤的一份处方重量:人参3.73g,黄芪7.46g,甘草1.86g,肉桂0.75g,生姜3g。
以上五味,一煎加水300mL,浸泡30min,置于陶罐,电磁炉加热,先武火(1800W)煮沸,再文火(800W)保持微沸,煎至120mL,用2层200目尼龙布过滤;二煎加水225mL,武火(1800W)煮沸,再文火(800W)煎至105mL,合并两次煎液225mL备用。
二、保元汤指纹图谱的测定:
1、仪器与试药
(1)仪器:Agilent1260型高效液相色谱仪,美国Agilent公司;C18色谱柱(250×4.6mm,5μm),英国Advanced Chromatography Technologies Ltd;Sartorius BT224S电子天平(万分之一),北京赛多利斯天平有限公司;Sartorius BT25S电子天平(十万分之一),德国赛多利斯公司;HH-4数显恒温水浴锅,邦西仪器科技(上海)有限公司;洁康超声波清洗机,东莞市洁康超声波设备有限公司;GZX-9130MB数显鼓风干燥箱,上海博讯实业有限公司。
(2)试药:对照品:人参皂苷Rg1(批号110703-201832,中国食品药品检定研究院,含量:92.4%)、人参皂苷Rb1(批号110704-201827,中国食品药品检定研究院,含量:91.2%)、毛蕊异黄酮葡萄糖苷(批号111920-201606,中国食品药品检定研究院,含量:97.6%)、甘草苷(批号111610-201607,中国食品药品检定研究院,含量:93.1%)、甘草酸铵(批号110731-201720,中国食品药品检定研究院,含量:96.2%)、6-姜辣素(批号111833-201806,中国食品药品检定研究院,含量:99.9%)。
(3)试剂:双蒸水、甲醇、乙腈、磷酸。
2、供试品溶液的制备
取保元汤煎液50mL,离心(4000r/min)10min;精密量取上清液10mL,加在C18固相萃取小柱上,吸附后,用双蒸水10mL洗脱,弃去,15%甲醇水溶液10mL洗脱,弃去;最后20mL纯甲醇洗脱并收集,蒸干,加甲醇定容至5mL容量瓶中,摇匀过滤,即得。
3、混合对照品溶液的配制
分别精密称取毛蕊异黄酮葡萄糖苷、甘草苷、甘草酸铵、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、6-姜辣素对照品,于同一5mL容量瓶中,加甲醇溶解,稀释至刻度,摇匀;制成混合对照品溶液,浓度分别为:毛蕊异黄酮葡萄糖苷66μg/mL、甘草苷356μg/mL、甘草酸铵580μg/mL、人参皂苷Rg1 354μg/mL、人参皂苷Rb1 332μg/mL、6-姜辣素223.2μg/mL。
4、高效液相的色谱条件
色谱柱为菲罗门C18柱(250×4.6mm,5μm)色谱柱;流动相:100%乙腈、0.1%磷酸水溶液;梯度洗脱:0~5min,14%~17%乙腈,86%~83%磷酸水溶液;5~12min,17%~19%乙腈,83%~81%磷酸水溶液;12~59min,19%~25%乙腈,81%~75%磷酸水溶液;59~75min,25%~30%乙腈,75%~70%磷酸水溶液;75~120min,30%~47%乙腈,70%~53%磷酸水溶液;流速:1.0mL/min;检测波长203nm和254nm;柱温:25℃;进样量10μL。
5、测定法:精密吸取保元汤供试品溶液和混合对照品溶液10μL注入液相色谱仪测定,结果见图1和图2;
由图1可以看出,供试品在254nm波长下共有14个峰,通过对照品比对,可指认出3个峰,分别是:毛蕊异黄酮葡萄糖苷(1号峰)、甘草苷(3号峰)和甘草酸铵(17号峰);由图2可以看出,供试品在203nm波长下共有10个峰,通过对照品比对,可指认出3个峰,分别是:人参皂苷Rg1(8号峰)、人参皂苷Rb1(14号峰)、6-姜辣素(18号峰)。
三、保元汤指纹图谱共有峰的指认(N=15)
选取不同产地的15个批次的药材(见下表1)制备成供试品溶液并测定(制备方法、测试条件和方法同前述二项中的供试品溶液的制备、高效液相的色谱条件和测定法),将以上不同产地15批次保元汤煎液的液相色谱图数据转换成AIA.格式后,导入2012版“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”,以1号供试品(标记为S1)为参照图谱,时间宽度设为0.1min,经过多点校正和全谱峰匹配,采用中位数法生成对照图谱(标记为R),供试品的指纹图谱与对照指纹图谱的相似度不得低于0.90,15批保元汤供试品溶液特征图谱与其生成的对照特征图谱的相似度结果见表2(254nm)和表3(203nm);15批指纹图谱叠加图见图5(254nm)和图6(203nm),R为对照图谱,S1-S15分别为15批保元汤的指纹图谱。
表1 15批次保元汤处方组合表
表2 254nm下15批保元汤样品的相似度计算结果
表3 203nm下15批保元汤指纹图谱相似度结果
由此可以看出,本发明提出的以203nm和254nm为双波长,选择源自不同产地多批次(N=15)的药材建立保元汤煎液的共有模式图谱,得到共有峰18个,且各批保元汤的指纹图谱相似度均在0.90以上,说明该方法可行性较好,每一批保元汤选择的共有峰稳定性好、特征性强,这些共有峰构成了保元汤的指纹特征,可作为保元汤的标准指纹图谱。
以上所述,本发明具有代表性,可直观快速地表征保元汤中各成分的色谱峰信息,且能全面地反映保元汤化学成分的种类和数量,实现保元汤的质量控制,对保元汤的开发具有重要意义。
四、保元汤指纹图谱的方法学考察
根据前述三项中的共有峰,选择分离度、稳定性较好的10号峰为参照峰,按中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算各特征峰与参照峰的相对保留时间和相对保留峰面积的RSD值。
(1)精密度考察
根据前述一项的方法制备一份保元汤供试品溶液,按前述二项中色谱条件连续进样6次,记录色谱图。计算相对保留时间和相对保留峰面积的RSD值,结果如表4-7所示。
表4保元汤254nm相对保留时间
表5保元汤203nm相对保留时间
表6保元汤254nm相对保留峰面积
表7保元汤203nm相对保留峰面积
由表中的结果可知,各色谱峰的相对保留时间RSD均小于0.22%和相对保留峰面积的RSD均小于2.00%,表明仪器精密度良好。
(2)重复性考察
根据前述一项中取同一批次保元汤药材,平行制备成6份保元汤供试品溶液,按二项中色谱条件连续进样6次,记录色谱图。计算相对保留时间和相对保留峰面积的RSD值,见表8-11所示。
表8保元汤254nm相对保留时间
表9保元汤203nm相对保留时间
表10保元汤254nm相对保留峰面积
表11保元汤203nm相对保留峰面积
由上述结果可知,各色谱峰的相对保留时间RSD均小于0.26%和相对保留峰面积的RSD均小于3.29%,表明方法重复性良好。
(3)稳定性考察
根据前述一项方法制备一份保元汤供试品溶液,按前述二项中色谱条件,分别于制备后第0、6、10、14、20、24h进样,记录色谱图。计算相对保留时间和相对保留峰面积的RSD值,见表12-15所示。
表12保元汤254nm相对保留时间
表13保元汤203nm相对保留时间
表14保元汤254nm相对保留峰面积
表15保元汤203nm相对保留峰面积
由上述结果可以看出,各色谱峰的相对保留时间的RSD均小于0.44%和相对保留峰面积的RSD均小于2.76%,表明方法稳定性良好。
最后应说明的是:以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其限制;尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明,本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (5)
1.一种保元汤的双波长指纹图谱建立方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)根据保元汤处方制备保元汤煎液;
(2)取保元汤煎液,制成供试品溶液;供试品溶液的制备方法为:量取保元汤煎液50ml,然后4000r/min离心10min,量取10mL上清液,加在C 18 固相萃取小柱上,吸附后,用双蒸水10mL洗脱,弃去,体积分数为15%的甲醇水溶液10mL洗脱,弃去,最后用纯甲醇20mL洗脱并收集,蒸干,加甲醇定容至5mL容量瓶中,摇匀,过滤,即得;
(3)精确称取人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、甘草苷、甘草酸铵、6-姜辣素对照品,配成混合对照品溶液;
(4)将供试品溶液和混合对照品溶液注入高效液相色谱仪测定,得到保元汤指纹图谱;其中高效液相色谱仪检测波长为200-205nm和250-260nm;流动相A:100%乙腈,流动相B:体积分数为0.05-0.2%的磷酸水溶液,色谱条件为:
采用梯度洗脱:0~5min,14%~17%乙腈,86%~83%磷酸水溶液;
5~12min,17%~19%乙腈,83%~81%磷酸水溶液;
12~59min,19%~25%乙腈,81%~75%磷酸水溶液;
59~75min,25%~30%乙腈,75%~70%磷酸水溶液;
75~120min,30%~47%乙腈,70%~53%磷酸水溶液;
流速:1.0mL/min;柱温:25℃;进样量10μL。
2.根据权利要求1所述的保元汤的双波长指纹图谱建立方法,其特征在于:步骤(4)中,高效液相色谱仪的检测波长为203nm和254nm。
3.根据权利要求1或2所述的保元汤的双波长指纹图谱建立方法,其特征在于:步骤(1)中,保元汤煎液的制备方法如下:将一份保元汤的处方药材用水煎煮两次,一煎:加水300mL,煎至120mL,过滤;二煎:加水225mL,煎至105mL,过滤,合并两次煎液225mL备用。
4.根据权利要求3所述的保元汤的双波长指纹图谱建立方法,其特征在于:保元汤原料药材包括:人参、黄芪、甘草、肉桂和生姜。
5.根据权利要求1所述的保元汤的双波长指纹图谱建立方法建立标准指纹图谱,其特征在于,按照所述的保元汤的双波长指纹图谱建立方法对不同产地的10-20个批次的保元汤药材进行测定,得到不同产地10-20批次保元汤煎液的指纹图谱,导入2012版“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”确定保元汤的指纹图谱的共有峰,这些共有峰构成了保元汤的指纹特征,可作为保元汤的标准指纹图谱。
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- 2021-12-13 CN CN202111514128.6A patent/CN114184719B/zh active Active
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