CN113899835A - 一种同时检测保元汤制剂中多种指标性成分的方法 - Google Patents

Abstract

一种同时检测保元汤制剂中多种指标性成分的方法，将保元汤制剂制备成供试品溶液；精密称取人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、甘草苷、甘草酸铵、桂皮醛、6‑姜辣素，配成一系列不同浓度的混合对照品溶液；用高效液相色谱对所述的供试品溶液和混合对照品溶液进行检测，得到对应的指标性成分的定量检测用标准曲线；通过定量检测用标准曲线计算供试品溶液中各种指标性成分的浓度。本发明的保元汤制剂中多种指标性成分含量测定方法专属性好，精密度、稳定性和重复性高，可全面、稳定和快速地实现保元汤中各单味药的指标性成分质量控制。

Description

一种同时检测保元汤制剂中多种指标性成分的方法

技术领域

本发明涉及药物分析检测技术领域，尤其涉及一种同时检测保元汤制剂中多种指标性成分的方法。

背景技术

2018年4月13日国家中医药管理局公布了《古代经典名方目录（第一批）》，其中保元汤最早源自《博爱心鉴》（明۰魏直），由《兰室秘藏》（金۰李东垣）黄芪汤衍化而来，并收录于《简明医毂》（明۰孙志宏）中，原方记载：“人参（一钱）、黄芪（二钱）、甘草（五分）、肉桂（二分）、又加生姜一片”，煎煮方法：“每剂水二钟，煎八分，渣用水钟半，煎七分”。

保元汤主治功效为治元气虚弱，其症状表现为，精神倦怠，肌肉柔慢，饮食少进，面青㿠白，睡卧宁静，及有杂证，皆属虚弱，宜服。其药理作用主要针对免疫系统、血液系统、心血管系统作用及抗氧化作用等；现代临床主要应用于治疗冠心病、慢性肾功能衰竭和肾炎、再生障碍性贫血、慢性乙型肝炎及术后感染等。

经典名方的开发是目前中医药行业发展的研究热点，以古代医籍中记载的制备方法为主要依据，利用现代制作方法还原古方，从而制作成现代中药方剂。而方中各味药之间的化学成分差异较大，特别是指标性成分的含量测定及方法学验证需要进一步深入探究。公开号为CN 111443142 A中的专利文献中采用4个不同阶段的波长控制保元汤制剂中的四味药的含量测定，众所周知，多味中药复方性质差异较大，多指标性成分采用多波长检测较复杂，不够直观清晰，急需一种简单可行的方法同时测定保元汤中多种指标性成分的方法。

发明内容

（一）要解决的技术问题

鉴于现有技术的上述缺点、不足，本发明提供一种同时检测保元汤制剂中多种指标性成分的方法，为后续经典名方保元汤的开发提供参考。

（二）技术方案

为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：

一种同时检测保元汤制剂中多种指标性成分的方法，包括以下步骤：

（1）将保元汤制剂制备成供试品溶液；

（2）精密称取人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、甘草苷、甘草酸铵、桂皮醛、6-姜辣素，配成一系列不同浓度的混合对照品溶液；

（3）用高效液相色谱对所述的供试品溶液和混合对照品溶液进行检测，得到对应的指标性成分的定量检测用标准曲线；

其中，高效液相色谱检测的条件包括：检测波长分别为200-205nm和250-260nm；流动相A：乙腈，流动相B：体积分数为0.05-0.2%的磷酸水溶液；

（4）通过定量检测用标准曲线计算供试品溶液中各种指标性成分的浓度。

优选的，所述检测波长分别为203nm和254nm。

优选的，步骤（3）中，高效液相色谱采用梯度洗脱，具体程序如下：

0~14min，17%~19%流动相A，83%~81%流动相B；

14~37min，19%~23%流动相A，81%~77%流动相B；

37~60min，23%~30%流动相A，77%~70%流动相B；

60~95min，30%~44%流动相A，70%~56%流动相B。按照该浓度梯度洗脱顺序，可以提高各成分之间的分离度和检测灵敏度，稳定性好，精密度高。

优选的，步骤（3）中，高效液相色谱采用十八烷基键合硅胶色谱柱；色谱柱的规格为250×4.6mm，填料直径为5μm。

优选的，步骤（3）中，高效液相色谱的条件还包括：流动相流速为1.0mL/min；柱温：25℃；进样量10μL。

优选的，所述的保元汤制剂的成分包括人参、黄芪、甘草、肉桂和生姜。通常，所述的保元汤的一份处方重量分别为：人参3.73g，黄芪7.46g，甘草1.86g，肉桂0.75g，生姜3g。

优选的，步骤（1）中，供试品溶液的制备方法如下：将保元汤药材用水煎煮两次，得到煎液，取少量煎液离心，将上清液加在固相萃取柱上，用水和甲醇水溶液分别洗脱，弃去，最后用纯甲醇洗脱，收集纯甲醇的洗脱液，蒸干，加甲醇定容。

优选的，步骤（2）中，混合对照品中各物质浓度分别为：毛蕊异黄酮葡萄糖苷 40-90μg/mL、甘草苷 300-400μg/mL、人参皂苷Rg1 300-400μg/mL、人参皂苷Re 260-380μg/mL、桂皮醛 400-500μg/mL、人参皂苷Rb1 260-400μg/mL、甘草酸铵 500-700μg/mL、6-姜辣素180-260μg/mL。

优选的，混合对照品中各物质浓度分别为：毛蕊异黄酮葡萄糖苷 66μg/mL、甘草苷356μg/mL、人参皂苷Rg1 354μg/mL、人参皂苷Re 320μg/mL、桂皮醛 441μg/mL、人参皂苷Rb1332μg/mL、甘草酸铵 580μg/mL、6-姜辣素223.2μg/mL。

优选的，所述混合对照品溶液的配制溶剂均是甲醇溶液。

（三）有益效果

（1）保元汤制剂中八种指标性成分分别是人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、甘草苷、甘草酸铵、桂皮醛、6-姜辣素。因各成分的极性大小不同，性质不同，对pH的敏感程度不同，最大吸收波长也不同；人参皂苷末端吸收和6-姜辣素在波长203nm下，峰的响应较高，分离度好，但在此波长下，黄芪中的毛蕊异黄酮葡萄糖苷有阴性干扰，且溶剂峰对指标性成分产生干扰，因此申请人经过多次探索和实验研究，选择波长254nm下指认毛蕊异黄酮葡萄糖苷、桂皮醛、甘草苷和甘草酸铵，无拖尾现象产生，其响应值更高，峰型更好看且稳定。总而言之，本发明通过探索和研究，选择203nm和254nm双波长进行检测，可以同时检测保元汤制剂中八种指标性成分，在波长203nm下测出君药人参中的人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、生姜中的6-姜辣素，波长254nm测出臣药黄芪中的毛蕊异黄酮葡萄糖苷、肉桂中的桂皮醛、甘草中的甘草苷和甘草酸铵。

（2）本发明综合考虑各指标性成分因素，提供了一种双波长同时测定八种成分含量的方法，采用十八烷基键合硅胶色谱柱，流动相为乙腈和0.1%磷酸水溶液，经过多次实验摸索出的梯度洗脱程序，可快速简单地检测出保元汤中的各指标性成分的含量。

（3）本发明的保元汤制剂中多种指标性成分含量测定方法专属性好，精密度、稳定性和重复性高，可全面、稳定和快速地实现保元汤中各单味药指标性成分的质量控制。

附图说明

图1为本发明实施例2中专属性项下波长203nm的色谱图；

图2为本发明实施例2中专属性项下波长254nm的色谱图。

具体实施方式

为了更好的解释本发明，以便于理解，下面结合附图，通过具体实施方式，对本发明作详细描述。

为了更好的理解上述技术方案，下面将参照附图更详细地描述本发明的示例性实施例。虽然附图中显示了本发明的示例性实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更清楚、透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。

下述实施例中所采用的仪器、试药和试剂如下：

1、仪器与试药

（1）仪器：Agilent1260型高效液相色谱仪，美国Agilent公司；C18色谱柱（250×4.6mm，5μm），英国Advanced Chromatography Technologies Ltd；Sartorius BT224S电子天平（万之一），北京赛多利斯天平有限公司；Sartorius BT25S电子天平（十万之一)，德国赛多利斯公司；HH-4数显恒温水浴锅，邦西仪器科技（上海）有限公司；洁康超声波清洗机，东莞市洁康超声波设备有限公司；GZX-9130 MB数显鼓风干燥箱，上海博讯实业有限公司。

（2）试药：

对照品：人参皂苷Rg1（批号110703-201832，中国食品药品检定研究院，含量：92.4%）、人参皂苷Re（批号110754-201827，中国食品药品检定研究院，含量：93.4%）、人参皂苷Rb1（批号110704-201827，中国食品药品检定研究院，含量：91.2%）、毛蕊异黄酮葡萄糖苷（批号111920-201606，中国食品药品检定研究院，含量：97.6%）、桂皮醛（110710-201821，中国食品药品检定研究院，含量：99.6%）、甘草苷（批号111610-201607，中国食品药品检定研究院，含量：93.1%）、甘草酸铵（批号110731-201720，中国食品药品检定研究院，含量：96.2%）、6-姜辣素（批号111833-201806，中国食品药品检定研究院，含量：99.9%）。

（3）试剂：

双蒸水、甲醇、乙腈、磷酸。

实施例1：试验验证

一种同时检测保元汤制剂中多种指标性成分的方法，包括以下步骤：

（1）保元汤的供试品溶液制备方法

称取保元汤的一份处方重量：人参3.73g，黄芪7.46g，甘草1.86g，肉桂0.75g，生姜3g。然后加水煎煮：一煎加水300mL，浸泡30min，置于陶罐，电磁炉加热，先在1800W的功率下武火煮沸，再在800W的功率下文火保持微沸，煎至120mL；用200目尼龙布2层过滤；二煎加水为225mL，煎至105mL；合并两次煎液。

取煎液50mL，以4000r/min的离心速率离心10min，量取上清液10mL加在C₁₈固相萃取小柱上，用双蒸水10mL洗脱，弃去，以15%甲醇水10ml洗脱，弃去，最后纯甲醇20mL洗脱并收集，蒸干，加甲醇定容至5mL容量瓶中，摇匀，过滤，即得。

（2）混合对照品溶液的配制

分别精密称取桂皮醛、6-姜辣素、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、甘草苷、甘草酸铵、人参皂苷Rg1、Re、Rb1对照品适量，于同一5mL容量瓶中，加甲醇溶解，稀释至刻度，摇匀；制成混合对照品溶液，浓度分别为：毛蕊异黄酮葡萄糖苷 66μg/mL、甘草苷 356μg/mL、人参皂苷Rg1354μg/mL、人参皂苷Re 320μg/mL、桂皮醛 441μg/mL、人参皂苷Rb1 332μg/mL、甘草酸铵580μg/mL、6-姜辣素223.2μg/mL。

（3）单味药材溶液的制备

按照保元汤的供试品溶液的制备方法分别制备人参、黄芪、甘草、肉桂、生姜的单味药材的样品溶液。

（4）阴性样品溶液的制备

按照保元汤的供试品溶液的制备方法分别制备缺少人参、黄芪、甘草、肉桂、生姜的阴性样品溶液。

（5）高效液相的色谱条件

色谱柱为菲罗门C18柱（250×4.6mm，5μm）色谱柱；流动相：100%乙腈：0.1%磷酸水溶液；梯度洗脱：0~14min，17%-19%乙腈，83%~81%磷酸水溶液；14~37min，19%~23%乙腈，81%~77%磷酸水溶液；37~60min，23%~30%乙腈，77%~70%磷酸水溶液；60~95min，30%~44%乙腈，70%~56%磷酸水溶液；流速：1.0mL/min；检测波长203nm和254nm；柱温：25℃；进样量10μl。

（6）测定法

分别精密吸取保元汤混合对照品溶液、阴性样品溶液与供试品溶液各10μl注入液相色谱仪，测定。

（7）通过定量检测用标准曲线计算供试品溶液中各种指标性成分的浓度，结果见表1所示。

实施例2：方法学考察

1、 保元汤中八种成分线性关系考察

1.1人参皂苷Rg1线性关系

精密吸取浓度为354μg/mL的人参皂苷Rg1混合对照品溶液，加甲醇稀释溶液，配制成浓度分别为177、88.5、44.25、22.125、11.0625μg/mL的对照品溶液，分别吸取10μl注入高效液相色谱仪，进行测定，在203nm波长下记录峰面积。

1.2人参皂苷Re线性关系

精密吸取浓度为320μg/mL的人参皂苷Re混合对照品溶液，加甲醇稀释溶液，配制成浓度分别为160、80、40、20、10μg/mL的对照品溶液，分别吸取10μl注入高效液相色谱仪，进行测定，在203nm波长下记录峰面积。

1.3人参皂苷Rb1线性关系

精密吸取浓度为332μg/mL的人参皂苷Rb1混合对照品溶液，加甲醇稀释溶液，配制成浓度分别为166、83、41.5、20.75、10.375μg/mL的对照品溶液，分别吸取10μl注入高效液相色谱仪，进行测定，在203nm波长下记录峰面积。

1.4毛蕊异黄酮葡萄糖苷线性关系

精密吸取浓度为66 μg/mL的毛蕊异黄酮葡萄糖苷混合对照品溶液，加甲醇稀释溶液，配制成浓度分别为33.0、16.5、8.25、4.125、2.0625 μg/mL的对照品溶液，分别吸取10μl注入高效液相色谱仪，进行测定，在254nm波长下记录峰面积。

1.5甘草苷线性关系

精密吸取浓度为356μg/mL的甘草苷混合对照品溶液，加甲醇稀释溶液，配制成浓度分别为178、89、44.5、22.25、11.125μg/mL的对照品溶液，分别吸取10μl注入高效液相色谱仪，进行测定，在254nm波长下记录峰面积。

1.6甘草酸铵线性关系

精密吸取浓度为580μg/mL的甘草酸铵混合对照品溶液，加甲醇稀释溶液，配制成浓度分别为290、145、72.5、36.25、18.125μg/mL的对照品溶液，分别吸取10μl注入高效液相色谱仪，进行测定，在254nm波长记录峰面积。

1.7桂皮醛线性关系

精密吸取浓度为411μg/mL的桂皮醛混合对照品溶液，加甲醇稀释溶液，配制成浓度分别为205.5、102.75、51.375、25.6875、12.84375μg/mL的对照品溶液，分别吸取10μl注入高效液相色谱仪，进行测定，在254nm波长下记录峰面积。

1.8 6-姜辣素线性关系

精密吸取浓度为223.2μg/mL的6-姜辣素混合对照品溶液，加甲醇稀释溶液，配制成浓度分别为111.6、55.8、27.9、13.95、6.975μg/mL的对照品溶液，分别吸取10μl注入高效液相色谱仪，进行测定，在203nm波长记录峰面积。

以保元汤含量测定方法建立过程中的高效液相色谱方法进行测定，并记录峰对应波长下的面积，以浓度为X，色谱峰面积为Y，进行线性回归。以上所述结果见表2。

2、专属性考察

取混合对照品溶液、保元汤全方供试品溶液、单味药材溶液和阴性供试品溶液，按照实施例1中的高效液相色谱条件进样，选择203nm和254nm双波长记录色谱图，见图1和图2。

图1中，波长203nm下，混合对照品溶液中，3号峰为人参皂苷Rg1；4号峰为人参皂苷Re； 6号峰为人参皂苷Rb1；8号峰为6-姜辣素；S1为空白甲醇溶液，S2为保元汤全方供试品溶液，S3混合对照品溶液，S4人参单煎供试品溶液，S5缺人参阴性样品溶液，S6生姜单煎供试品溶液，S7缺生姜阴性样品溶液。

图2中，波长254nm下，混合对照品溶液中，1号峰为毛蕊异黄酮葡萄糖苷；2号峰为甘草苷；5号峰为桂皮醛；7号峰为甘草酸铵；其中S1为空白甲醇溶液，S2为保元汤全方供试品溶液，S3为混合对照品溶液，S4黄芪单煎供试品溶液，S5缺黄芪阴性样品溶液，S6甘草单煎供试品溶液，S7缺甘草阴性样品溶液，S8肉桂单煎供试品溶液，S9缺肉桂阴性样品溶液。

通过与混合对照品比对可知，人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1来自保元汤中人参，毛蕊异黄酮葡萄糖苷来自保元汤中黄芪，甘草苷和甘草酸铵来自保元汤中甘草，桂皮醛来自保元汤中肉桂，6-姜辣素来自保元汤中生姜。

结果显示，所有缺单味药的阴性供试品溶液在测定成分出峰时间处均无干扰，各成分之间的分离度良好，分析方法可行性强，表明方法的专属性良好。

3、精密度考察

取实施例1中的混合对照品溶液，按照实施例1（5）中的高效液相色谱条件进样，连续进样6次，测定，记录各个峰面积。

检测结果见表3所示，各成分的RSD均小于3.0%，表明该仪器测定这些成分的精密度良好。

4、重复性考察

从同一保元汤煎液中取6份样品，按实施例1中的方法制备6份平行供试品溶液，按照（5）项下色谱条件进样，记录峰面积。

检测结果见表4所示，结果显示各成分的RSD均小于3.0%，表明该检测方法的重复性良好。

5、稳定性考察

按实施例1中的方法制备供试品溶液放置室温下，取样时间为0、2、4、6、8、10、12、24h时，按照（5）项下色谱条件进样，记录各个峰峰面积。

检测结果见表5所示，各成分的RSD均小于3.0%，制备的供试品溶液在室温条件下24h基本稳定。

6、加样回收试验

取同一批次药材煎煮6份保元汤煎液，分别精密加入混合对照品溶液，其余按供试品制备方式操作，按照实施例1中的色谱条件进样，计算8个成分的加样回收率，结果见表6。

以上结果表明，各成分在各浓度下的回收率均在95%-105%之间，RSD值均小于3.0%，说明此方法的准确度较好。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (9)

1.一种同时检测保元汤制剂中多种指标性成分的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将保元汤制剂制备成供试品溶液；

（2）精密称取人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、甘草苷、甘草酸铵、桂皮醛、6-姜辣素，配成一系列不同浓度的混合对照品溶液；

（3）用高效液相色谱对所述的供试品溶液和混合对照品溶液进行检测，得到对应的指标性成分的定量检测用标准曲线；

其中，高效液相色谱检测的条件包括：检测波长分别为200-205nm和250-260nm；流动相A：乙腈，流动相B：体积分数为0.05-0.2%的磷酸水溶液；

（4）通过定量检测用标准曲线计算供试品溶液中各种指标性成分的浓度。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述检测波长分别为203nm和254nm。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，高效液相色谱采用梯度洗脱，具体程序如下：

0~14min，17%~19%流动相A，83%~81%流动相B；

14~37min，19%~23%流动相A，81%~77%流动相B；

37~60min，23%~30%流动相A，77%~70%流动相B；

60~95min，30%~44%流动相A，70%~56%流动相B。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，高效液相色谱采用十八烷基键合硅胶色谱柱；色谱柱的规格为250×4.6mm，填料直径为5μm。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，高效液相色谱的条件还包括：流动相流速为1.0mL/min；柱温：25℃；进样量10μL。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的保元汤制剂的成分包括人参、黄芪、甘草、肉桂和生姜。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，供试品溶液的制备方法如下：将保元汤制剂用水煎煮两次，得到煎液，取少量煎液离心，将上清液加在固相萃取柱上，用水和甲醇水溶液分别洗脱，弃去，最后用纯甲醇洗脱，收集纯甲醇的洗脱液，蒸干，加甲醇定容。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，混合对照品中各物质浓度分别为：毛蕊异黄酮葡萄糖苷 40-90μg/mL、甘草苷 300-400μg/mL、人参皂苷Rg1 300-400μg/mL、人参皂苷Re 260-380μg/mL、桂皮醛 400-500μg/mL、人参皂苷Rb1 260-400μg/mL、甘草酸铵 500-700μg/mL、6-姜辣素180-260μg/mL。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，混合对照品中各物质浓度分别为：毛蕊异黄酮葡萄糖苷 66μg/mL、甘草苷 356μg/mL、人参皂苷Rg1 354μg/mL、人参皂苷Re 320μg/mL、桂皮醛 441μg/mL、人参皂苷Rb1 332μg/mL、甘草酸铵 580μg/mL、6-姜辣素223.2μg/mL。

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