CN111443142A - 一种保元汤制剂中多指标成分的同时检测方法 - Google Patents

一种保元汤制剂中多指标成分的同时检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种保元汤制剂中多指标成分的同时检测方法，所述保元汤制剂的指标成分包括人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮、甘草苷、甘草酸、芹糖异甘草苷、异甘草苷和肉桂酸，按照下述高效液相色谱条件进行检测：色谱柱：十八烷基键合硅胶色谱柱；DAD检测器，检测波长201‑205nm，258‑262nm，288‑292nm，358‑362nm；流动相A：乙腈，流动相B：醋酸铵缓冲溶液，梯度洗脱。本发明提供的检测方法，能够实现上述多种指标成分的有效分离，且本发明提供的方法经专属性、灵敏度等方法学研究及验证，发现本发明的方法灵敏、准确、重现性较好。

Description

一种保元汤制剂中多指标成分的同时检测方法
技术领域
本发明涉及药物分析技术领域，尤其涉及一种保元汤制剂中多指标成分的同时检测方法。
背景技术
保元汤出自明孙志宏编纂的《简明医彀》(1629年)，是古代经典名方，主“元气虚弱，精神倦怠，肌肉柔慢，饮食少进，面青
Figure BDA0002466241000000011
白，睡卧宁静及有杂证，皆属虚弱，宜服”，其组方由人参、黄芪、甘草、肉桂组成，煎煮时加生姜一片。作为中医药传承与发展过程中保留下来的中药方剂杰出代表之一，在现代临床上有着广泛的应用，主要用于冠心病、慢性肾衰、再生障碍性贫血、乙型肝炎、白细胞减少等病证的治疗。
但是，目前保元汤的质量控制较为简单，主要采用薄层色谱法对其化合物进行鉴别，或者采用高效液相色谱法对保元汤主要成分中的单个化合物进行含量检测，不能全面反映保元汤的质量。此外，由于地理气候条件、采收时间和预处理方式等方面的差异，不同产区的同种中药其化学成分含量存在较大差异。以多味药材中多种有效成分共同检测是提高中药质量控制标准的必然趋势。因此，开发一种可以同时检测保元汤中多种指标成分的含量测定方法，实现对保元汤中多个指标成分的控制，对今后保元汤的开发和质量控制具有十分重要的意义。
发明内容
针对现有检测方法无法实现保元汤制剂中多个指标成分的同时检测的问题，本发明提供一种保元汤制剂中多指标成分的同时检测方法。
为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案是：
一种保元汤制剂中多指标成分的同时检测方法，所述保元汤制剂的指标成分包括人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮、甘草苷、甘草酸、芹糖异甘草苷、异甘草苷和肉桂酸，在于，所述检测方法包括以下步骤：
(1)供试品溶液和混合对照品工作液的配制：
取保元汤制剂制成供试品溶液；
取人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮、甘草苷、甘草酸单铵盐、芹糖异甘草苷、异甘草苷和肉桂酸对照品，用溶剂配制成混合对照品工作液；
(2)按照下述超高效液相色谱条件对所述供试品溶液和混合对照品工作液进行检测，色谱条件为：
色谱柱：十八烷基键合硅胶色谱柱；
DAD检测器，检测波长201-205nm，258-262nm，288-292nm，358-362nm；
流动相A：乙腈，流动相B：醋酸铵缓冲溶液；
洗脱方式为梯度洗脱。
本发明中检测波长201-205nm用于检测人参皂苷Rg1/Re、人参皂苷Rb1；258-262nm用于检测毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮、甘草苷、甘草酸；288-292nm用于检测肉桂酸；358-362nm用于芹糖异甘草苷、异甘草苷。
本发明所述保元汤制剂包括保元汤的液体制剂和固体制剂，所述液体制剂包括保元汤水煎液和保元汤口服液，所述保元汤固体制剂的剂型包括片剂、粉剂、颗粒剂或胶囊剂等。
人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮、甘草苷、甘草酸、芹糖异甘草苷、异甘草苷和肉桂酸这几种组分的极性不同，对pH的敏感性不同，最大吸收波长也不相同，本发明提供的保元汤中多指标成分的检测方法，综合考量了上述多种因素，以十八烷基键合硅胶色谱柱作为检测色谱柱，以乙腈-醋酸铵缓冲液作为流动相，采用特定的梯度洗脱程序，有效克服了保元汤药味繁多、各成分复杂且相互干扰而不能全面、清晰地对保元汤质量进行检测的缺陷。本发明通过对高效液相色谱条件的控制，实现了保元汤中多种主要有效成分的同时定量检测，将原本需要多次定量检测完成的测定指标，能够用一次定量检测完成，极大地提高了检测效率；且本发明提供的方法经专属性、灵敏度等方法学研究及验证，发现本发明的方法灵敏度、准确度、重现性较好，可以实现更加全面有效地对保元汤的质量进行控制。
本发明中选择甘草酸单铵盐作为甘草酸的对照品，在计算供试品溶液的甘草酸的含量时将对照品溶液中的甘草酸单铵盐折算为甘草酸的含量进行计算。
可选的，混合对照品工作液配制中所用溶剂可为甲醇或乙醇，优选为甲醇。
优选的，所述梯度洗脱的洗脱程序如下：
0-10min，7％→23.5％流动相A，93％→76.5％流动相B；
10-16min，23.5％流动相A，76.5％流动相B；
16-18min，23.5％→26％流动相A，76.5％→74％流动相B；
18-22min，26％→32％流动相A，74％→68％流动相B；
22-27min，32％→52％流动相A，68％→48％流动相B；
27-32min，52％→90％流动相A，48％→10％流动相B。
优选的梯度洗脱顺序，可以提高各组分峰之间的分离度和检测的灵敏度，使检测结果定量准确，且精密度高。
优选的，所述醋酸铵缓冲液的浓度为0.8-1.2mmol/L，pH为4.3-4.7。
更优选的，所述醋酸铵缓冲液的浓度为1.0mmol/L，pH为4.5。
优选的流动相的浓度、pH值，可以减少谱带拖尾，改善峰形，从而有利于提高各组分之间的分离度。
优选的，流速为0.4-0.6mL/min，柱温为25-35℃。
更优选的，流速为0.5mL/min，柱温为30℃，进样体积为5μL。
优选的流速和柱温，有利于进一步提高各组分之间的分离度，使检测结果的准确度及精密度更高。
优选的，检测波长为203nm、260nm、290nm和360nm。
优选的检测波长，可尽量避免中药提取物中大量杂质对检测的干扰，提高检测的灵敏度和检测结果的准确性。
优选的，所述色谱柱的规格为100*4.6mm，填料直径为2.7μm。
更优选的，所述色谱柱为Agilent Proshell 120 EC-C18。
优选的色谱柱规格、型号可以使各组分峰形、分离度及检测的灵敏度俱佳，且基线干扰较小。
优选的，所述用于保元汤的原料包括人参、黄芪、甘草和肉桂，附加生姜。
优选的，所述供试品溶液的配制包括如下步骤：
S1，精密量取所述保元汤液体制剂或保元汤固体制剂的水溶液，加入无水乙醇，涡旋，离心，取上清液蒸干后，甲醇溶解定容，过滤，得检测除人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1之外其他指标成分的供试品溶液；
S2，精密量取所述保元汤液体制剂或保元汤固体制剂的水溶液加入Oasis HLB型固相萃取柱中，以纯净水、38-42wt％甲醇水溶液洗涤样品，然后以58-62wt％甲醇水溶液洗脱样品，收集洗脱液，在惰性氛围下蒸干，甲醇溶解定容，过滤，得检测人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1三种指标成分的供试品溶液。
保元汤水煎液的制备方法步骤如下：将人参3.75g、黄芪7.5g、甘草1.85g和肉桂0.75g混匀，附加生姜1片，加入8-12倍量的水浸泡25-35min，武火煮沸，文火煎煮35-45min，过滤，60℃减压浓缩，加水定容至25mL，得保元汤水煎液。
优选的，步骤S1中，无水乙醇的加入量为量取保元汤液体制剂或保元汤固体制剂的水溶液的体积的5.8-6.2倍，将上清液蒸干后，用甲醇定容至2mL。
优选的，步骤S2中，所述纯净水、38-42wt％甲醇水溶液的用量为量取保元汤液体制剂或保元汤固体制剂溶解得到的溶液的体积的1.8-2.2倍，洗脱液蒸干后用甲醇定容至5mL。
保元汤的原料含有4-5味药材，水提液中含有大量糖类及蛋白质等成分，其制剂中含有多种辅料，通过上述制备方法可以减少杂质的干扰，有利于提高检测的准确度，并使各检测成分的色谱峰的峰形、色谱峰的响应值及分离度良好。
本发明提供的定量检测方法为保元汤制剂中多种组分的定量检测，且一般由于组方饮片中指标成分的含量存在较大的差异，不适合采用外标一点法。因此，本发明配制了系列混合对照品工作液，建立合适的工作曲线，从而实现了对保元汤制剂中多指标成分的准确定量计算。
所述混合对照品工作液中各指标成分的浓度为：人参皂苷Re、Rg1、Rb1的浓度均分别为400、200、100、50、25μg·mL-1；毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮、甘草苷、芹糖异甘草苷、甘草酸单铵盐、肉桂酸的浓度均分别为500、250、50、10和2μg·mL-1；异甘草苷的浓度分别为200、100、20、4、0.8μg·mL-1。
按照下述方法配制一系列不同浓度的混合对照品工作液：
精密称定对照品人参皂苷Re、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1，各10mg，混合；以甲醇溶解、定容至25mL，得到混合的三种人参皂苷对照品储备液；再以甲醇逐步稀释，分别制得五种不同浓度的混合对照品工作液，浓度依次为400、200、100、50、25μg·mL-1。
精密称定对照品异甘草苷5mg；以甲醇溶解、定容至25mL，得储备液；再以甲醇逐步稀释，分别制得五种不同浓度的对照品工作液，浓度依次为200、100、20、4、0.8μg·mL-1。
精密称定对照品毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮、甘草苷、芹糖异甘草苷、甘草酸单铵盐、肉桂酸，各12.5mg，混合；以甲醇溶解、定容至25mL，得储备液；再以甲醇逐步稀释，分别制得五种不同浓度的混合对照品工作液，浓度依次为500、250、50、10、2μg·mL-1。
以上三组不同浓度的混合对照品工作液，用于建立相应化合物定量检测用标准曲线。
采用现代化方法对中成药进行开发与研究具有重要意义，为中成药的质量提供一个客观、整体的评价依据。本发明采用UPLC-DAD法对保元汤制剂中的多种成分进行含量测定，建立了标准、可靠的定量方法，为今后对保元汤的开发和质量控制提供了参考。
附图说明
图1为实施例2中专属性项下混合对照品溶液、全方供试品溶液、不含人参的阴性供试品溶液和人参单方阴性供试品溶液，在203nm条件下的色谱图，其中，(a)混合对照品溶液，(k)缺人参阴性供试品溶液，(c)全方供试品溶液；(l)人参阴性供试品溶液，峰1为人参皂苷Rg1/Re，峰2为人参皂苷Rb1；
图2为实施例2中专属性项下混合对照品溶液、全方供试品溶液、不含黄芪的阴性供试品溶液和黄芪单方阴性供试品溶液，在260nm条件下的色谱图，其中，(a)混合对照品溶液，(c)全方供试品溶液，(e)缺黄芪阴性供试品溶液和(h)黄芪阴性供试品溶液，峰3为毛蕊异黄酮葡萄糖苷，峰4为毛蕊异黄酮；
图3为实施例2中专属性项下混合对照品溶液、全方供试品溶液、不含甘草的阴性供试品溶液和甘草单方阴性供试品溶液，在260nm条件下的色谱图，其中，(a)混合对照品溶液，(b)缺甘草阴性供试品溶液，(c)全方供试品溶液和(f)甘草阴性供试品溶液，峰5为甘草苷，峰6为甘草酸(对照品为甘草酸单铵盐)；
图4为实施例2中专属性项下混合对照品溶液、全方供试品溶液、不含肉桂的阴性供试品溶液和肉桂单方阴性供试品溶液，在290nm条件下的色谱图，其中，(a)混合对照品溶液，(i)缺肉桂阴性供试品溶液，(c)全方供试品溶液和(j)肉桂阴性供试品溶液，峰9为肉桂酸；
图5为实施例2中专属性项下混合对照品溶液、全方供试品溶液、不含甘草的阴性供试品溶液和甘草单方阴性供试品溶液，在360nm条件下的色谱图，其中，(a)混合对照品溶液，(b)缺甘草阴性供试品溶液，(c)全方供试品溶液和(f)甘草阴性供试品溶液，峰7为芹糖异甘草苷，峰8为异甘草苷；
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
1.溶液的配制
1.1供试品溶液的配制
S1，将人参3.75g、黄芪7.5g、甘草1.88g和肉桂0.75g混匀，加入10倍量的水于陶瓷锅中浸泡30min，武火煮沸，文火保持微沸状态继续煎煮40min，趁热过滤，60℃减压浓缩，以水定容至25mL，得保元汤水煎液；
S2，精密量取所述保元汤水煎液1mL加入量瓶中，加入6倍体积无水乙醇，涡旋3min，12000rpm离心10min，取上清液蒸干后用甲醇定容至2mL量瓶中，取续滤液，得检测除人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1之外其他指标成分的供试品溶液；
S3，精密量取所述保元汤水煎液5mL加入Oasis HLB型固相萃取柱中，以纯净水、40wt％甲醇水溶液各10mL洗涤样品，然后以60wt％甲醇水溶液洗脱样品，收集洗脱液，脱液置于60℃水浴中用氮气吹至近干，以甲醇复溶、定容至5mL，取续滤液，得检测人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1三种指标成分的供试品溶液。
1.2混合对照品工作液的配制
精密称定对照品人参皂苷Re、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1，各10mg，混合；以甲醇溶解、定容至25mL，得到混合的三种人参皂苷对照品储备液；再以甲醇逐步稀释，分别制得五种不同浓度的混合对照品工作液，浓度依次为400、200、100、50、25μg·mL-1。
精密称定对照品异甘草苷5mg；以甲醇溶解、定容至25mL，得储备液；再以甲醇逐步稀释，分别制得五种不同浓度的对照品工作液，浓度依次为200、100、20、4、0.8μg·mL-1。
精密称定对照品毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮、甘草苷、芹糖异甘草苷、甘草酸单铵盐、肉桂酸，各12.5mg，混合；以甲醇溶解、定容至25mL，得储备液；再以甲醇逐步稀释，分别制得五种不同浓度的混合对照品工作液，浓度依次为500、250、50、10、2μg·mL-1。
1.3阴性对照溶液的配制
按照保元汤配方分别制备不含人参、黄芪、甘草或肉桂药材饮片的阴性样品，再按上述供试品溶液的制备方法制备相对应的缺方阴性样品溶液。
分别取人参、黄芪、甘草或肉桂药材单独饮片，按上述供试品溶液的制备方法制备相对应的单方阴性样品溶液。
1.5超高效液相色谱(UPLC))条件：
色谱柱：AgilentProshell 120 EC-C18(100mm×4.6mm，2.7μm)；
流动相：乙腈(A)-醋酸铵缓冲溶液(pH 4.5；1mmol/L)(B)；
流速：0.5mL·min-1；
柱温：30℃；
进样量：5μL；
检测波长：203nm(人参皂苷Rg1/Re、人参皂苷Rb1)；260nm(毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮、甘草苷、甘草酸)；290nm(肉桂酸)；360nm(芹糖异甘草苷、异甘草苷)，梯度洗脱条件见表1。
表1梯度洗脱条件
Time(min) A(％) B(％)
0-10 7-23.5 93-76.5
10-16 23.5 76.5
16-18 23.5-26 76.5-74
18-22 26-32 74-68
22-27 32-52 68-48
27-32 52-90 48-10
实施例2
方法学验证：
2.1专属性
混合对照品溶液：取各指标成分对照品储备液适量，混合，以甲醇稀释、定容，制成人参皂苷Re、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1的浓度分别为200μg·mL-1；毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮、甘草苷、芹糖异甘草苷、甘草酸单铵盐、肉桂酸的浓度分别为250μg·mL-1；异甘草苷的浓度为100μg·mL-1的混合对照品溶液。
按照上述超高效液相色谱条件进样分析1.1配制的供试品溶液、上述配制的混合对照品溶液、及1.3项下配制的阴性对照溶液。
其中，图1为混合对照品溶液(a)，缺人参阴性供试品溶液(k)，全方供试品溶液(c)；人参阴性供试品溶液(l)在203nm条件下的色谱图，峰1为人参皂苷Rg1/Re(左边小峰为Re，右边略大的峰为Rg1)，峰2为人参皂苷Rb1，
注：人参皂苷Rg1和人参皂苷Re结构和极性很相似，很难有效分离，根据中国药典的要求，将两者作为一个色谱峰进行定量计算。
图2为混合对照品溶液(a)，全方供试品溶液(c)，缺黄芪阴性供试品溶液(e)和黄芪阴性供试品溶液(h)在260nm条件下的色谱图，其中，峰3为毛蕊异黄酮葡萄糖苷，峰4为毛蕊异黄酮。
图3为混合对照品溶液(a)，缺甘草阴性供试品溶液(b)，全方供试品溶液(c)和甘草阴性供试品溶液(f)在260nm条件下的色谱图，其中，峰5为甘草苷，峰6为甘草酸(对照品为甘草酸单铵盐)。
图4为混合对照品溶液(a)，缺肉桂阴性供试品溶液(i)，全方供试品溶液(c)和肉桂阴性供试品溶液(j)在290nm条件下的色谱图，其中，峰9为肉桂酸。
图5为混合对照品溶液(a)，缺甘草阴性供试品溶液(b)，全方供试品溶液(c)和甘草阴性供试品溶液(f)在360nm条件下的色谱图，其中，峰7为芹糖异甘草苷，峰8为异甘草苷。
对比图谱可知，供试品溶液中人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re来自人参中；毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮来自黄芪；甘草酸、甘草苷、异甘草苷、芹糖异甘草苷来自甘草；肉桂酸来自肉桂；缺方阴性供试品溶液在测定成分出峰时间处均无干扰，分析方法专属性良好。
2.2线性与范围
分别精密称取10mg人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re对照品，混合，置于25mL容量中，用甲醇定容，得储备液；分别移取各储备液，混合，用甲醇稀释制备5种不同浓度的混合标准溶液：人参皂苷Re、Rg1和Rb1的浓度均为25.01、50.02、100.04、200.08和400.16μg/mL。
分别精密称取12.5mg毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、甘草酸单铵盐、甘草苷、芹糖异甘草苷、肉桂酸对照品，混合，置于25mL容量中，用甲醇定容，得储备液；分别移取各储备液，混合，用甲醇稀释制备5种不同浓度的混合标准溶液：2、10、50、250、500μg/mL。
精密称取5mg异甘草苷对照品，置于25mL容量中，用甲醇定容，得储备液；用甲醇稀释储备液制备5种不同浓度的混合标准溶液：0.80、4.01、20.05、100.25和200.50μg/mL。
按照超高效液相色谱条件进样测定，记录色谱峰的峰面积，以各对照品浓度x(μg.mL-1)为横坐标，峰面积y为纵坐标，绘制标准曲线，进行回归计算，得到得回归方程。以对照品溶液逐级稀释法进样检测，以信噪比约为3时浓度为最低检测限(LOD)，以信噪比约为10时浓度为最低定量限(LOQ)，结果见表2。
表2
Figure BDA0002466241000000111
结果表明，人参皂苷Rg1/Re、人参皂苷Rb1、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮、甘草苷、甘草酸(甘草酸单铵盐)、芹糖异甘草苷、异甘草苷和肉桂酸在考察范围内线性关系良好，相关系数均大于0.999。
2.3精密度、重复性和稳定性试验
精密度：取1.2项下配制的混合对照品溶液，按上述高效液相色谱条件测定，连续进样6次，连续进样3天，以各化合物峰面积的相对标准偏差(RSD)评价仪器精密度。
重复性：取同一批次保元汤供试品溶液，按1.1项下供试品溶液的制备方法平行制备6份供试品溶液，按上述高效液相色谱条件测定，以各化合物峰面积的相对标准偏差(RSD)评价供试液制备方法重复性。
稳定性：取同一批次保元汤供试品溶液，按1.1项下供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，按上述高效液相色谱条件测定，分别于0、2、4、6、8、10、12h测定，以各化合物峰面积的相对标准偏差(RSD)评价供试液稳定性。结果见表3。
表3
Figure BDA0002466241000000121
结果表明，上述有效成分的日内和日间精密度RSD分别为0.2-1.0％和0.4-2.1％，表明仪器精密度良好。重复性RSD为0.3-2.1％，表明该方法重复性良好。稳定性RSD为0.6-2.3％，表明供试品溶液在12h内稳定。
2.4准确度
取已知指标成分含量的样品9份，精密称定，采用高、中、低(1:1.2，1:1，1:0.8)的不等量加样回收率法进行，每一种浓度平行制备3份，按超高效液相色谱条件进行测定，计算各成分的平均回收率及RSD，测定结果见表4。
表4
Figure BDA0002466241000000131
以上结果表明，各成分在各浓度下的回收率回收率在84.67％-98.47％之间，RSD值均小于0.9％，说明本法准确度较好。
实施例3
取16批保元汤汤样品，按实施例1中1.1项下供试品溶液的制备操作制备供试品溶液，按超高效液相色谱条件进样测定，记录各成分峰面积，采用外标法根据各成分峰面积，计算各批次样品中有效成分的含量。含量测定结果见表5。
表5
Figure BDA0002466241000000141
Figure BDA0002466241000000151
由上表可以看出，不同批次的原料成分提取得到的人参皂苷Rg1/Re、人参皂苷Rb1、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮、甘草苷、甘草酸、芹糖异甘草苷、异甘草苷和肉桂酸差距较大，因此，很有必要对保元汤汤中的这几种组分进行定量检测，这对保元汤的质量控制具有十分重要的意义。
实施例4
超高效液相色谱(UPLC)条件：色谱柱：AgilentProshell 120 EC-C18(100mm×4.6mm，2.7μm)；流动相：乙腈(A)-醋酸铵缓冲溶液(pH 4.5；1mmol/L)(B)；流速：0.5mL·min-1；梯度洗脱条件见表1；柱温：30℃；进样量：5μL；检测波长：203nm，260nm，290nm，360nm。
混合对照品工作液的配制：
精密称定对照品人参皂苷Re、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1，各10mg，混合；以甲醇溶解、定容至25mL，得到混合的三种人参皂苷对照品储备液；再以甲醇逐步稀释，分别制得五种不同浓度的混合对照品工作液，浓度依次为400、200、100、50、25μg·mL-1。精密称定对照品异甘草苷5mg；以甲醇溶解、定容至25mL，得储备液；再以甲醇逐步稀释，分别制得五种不同浓度的对照品工作液，浓度依次为200、100、20、4、0.8μg·mL-1。精密称定对照品毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮、甘草苷、芹糖异甘草苷、甘草酸单铵盐、肉桂酸，各12.5mg，混合；以甲醇溶解、定容至25mL，得储备液；再以甲醇逐步稀释，分别制得五种不同浓度的混合对照品工作液，浓度依次为500、250、50、10、2μg·mL-1。
供试品溶液的制备：
S1，将人参3.75g、黄芪7.5g、甘草1.88g和肉桂0.75g混匀，加入10倍量的水于陶瓷锅中浸泡30min，武火煮沸，文火保持微沸状态继续煎煮40min，趁热过滤，60℃减压浓缩，以水定容至25mL，得煎液；
S2，精密量取所述煎液1mL加入量瓶中，加入6倍体积无水乙醇，涡旋涡旋3min，12000rpm离心10min，取上清液蒸干后用甲醇定容至2mL量瓶中，取续滤液，得检测除人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1之外其他指标成分的供试品溶液；
S3，精密量取所述煎液5mL加入Oasis HLB型固相萃取柱中，以纯净水、40wt％甲醇水溶液各10mL洗涤样品，然后以60wt％甲醇水溶液洗脱样品，收集洗脱液，脱液置于60℃水浴中用氮气吹至近干，以甲醇复溶、定容至5mL，取续滤液，得检测参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1三种指标成分的供试品溶液。
将上述对照品储备液和供试品溶液分别注入UPLC进行测定。
实施例5
超高效液相色谱(UPLC)条件：色谱柱：AgilentProshell 120 EC-C18(100mm×4.6mm，2.7μm)；流动相：乙腈(A)-醋酸铵缓冲溶液(pH 4.3；0.8mmol/L)(B)；流速：0.6mL·min-1；梯度洗脱条件见表1；柱温：25℃；进样量：5μL；检测波长：205nm，258nm，288nm，362nm。
混合对照品工作液的配制：
精密称定对照品人参皂苷Re、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1，各10mg，混合；以甲醇溶解、定容至25mL，得到混合的三种人参皂苷对照品储备液；再以甲醇逐步稀释，分别制得五种不同浓度的混合对照品工作液，浓度依次为400、200、100、50、25μg·mL-1。精密称定对照品异甘草苷5mg；以甲醇溶解、定容至25mL，得储备液；再以甲醇逐步稀释，分别制得五种不同浓度的对照品工作液，浓度依次为200、100、20、4、0.8μg·mL-1。精密称定对照品毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮、甘草苷、芹糖异甘草苷、甘草酸单铵盐、肉桂酸，各12.5mg，混合；以甲醇溶解、定容至25mL，得储备液；再以甲醇逐步稀释，分别制得五种不同浓度的混合对照品工作液，浓度依次为500、250、50、10、2μg·mL-1。
供试品溶液的制备：
S1，将人参3.75g、黄芪7.5g、甘草1.88g和肉桂0.75g混匀，加入10倍量的水于陶瓷锅中浸泡30min，武火煮沸，文火保持微沸状态继续煎煮40min，趁热过滤，60℃减压浓缩，以水定容至25mL，得煎液；
S2，精密量取所述煎液1mL加入量瓶中，加入6倍体积无水乙醇，涡旋涡旋3min，12000rpm离心10min，取上清液蒸干后用甲醇定容至2mL量瓶中，取续滤液，得检测除人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1之外其他指标成分的供试品溶液；
S3，精密量取所述煎液5mL加入Oasis HLB型固相萃取柱中，以纯净水、40wt％甲醇水溶液各10mL洗涤样品，然后以60wt％甲醇水溶液洗脱样品，收集洗脱液，脱液置于60℃水浴中用氮气吹至近干，以甲醇复溶、定容至5mL，取续滤液，得检测参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1三种指标成分的供试品溶液。
将上述对照品储备液和供试品溶液分别注入UPLC进行测定。
实施例6
超高效液相色谱(UPLC)条件：色谱柱：AgilentProshell 120 EC-C18(100mm×4.6mm，2.7μm)；流动相：乙腈(A)-醋酸铵缓冲溶液(pH 4.7；1.2mmol/L)(B)；流速：0.4mL·min-1；梯度洗脱条件见表1；柱温：35℃；进样量：5μL；检测波长：201nm，262nm，292nm，358nm。
混合对照品工作液的配制：
精密称定对照品人参皂苷Re、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1，各10mg，混合；以甲醇溶解、定容至25mL，得到混合的三种人参皂苷对照品储备液；再以甲醇逐步稀释，分别制得五种不同浓度的混合对照品工作液，浓度依次为400、200、100、50、25μg·mL-1。精密称定对照品异甘草苷5mg；以甲醇溶解、定容至25mL，得储备液；再以甲醇逐步稀释，分别制得五种不同浓度的对照品工作液，浓度依次为200、100、20、4、0.8μg·mL-1。精密称定对照品毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮、甘草苷、芹糖异甘草苷、甘草酸单铵盐、肉桂酸，各12.5mg，混合；以甲醇溶解、定容至25mL，得储备液；再以甲醇逐步稀释，分别制得五种不同浓度的混合对照品工作液，浓度依次为500、250、50、10、2μg·mL-1。
供试品溶液的制备：
S1，将人参3.75g、黄芪7.5g、甘草1.88g和肉桂0.75g混匀，加入10倍量的水于陶瓷锅中浸泡30min，武火煮沸，文火保持微沸状态继续煎煮40min，趁热过滤，60℃减压浓缩，以水定容至25mL，得煎液；
S2，精密量取所述煎液1mL加入量瓶中，加入6倍体积无水乙醇，涡旋涡旋3min，12000rpm离心10min，取上清液蒸干后用甲醇定容至2mL量瓶中，取续滤液，得检测除人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1之外其他指标成分的供试品溶液；
S3，精密量取所述煎液5mL加入Oasis HLB型固相萃取柱中，以纯净水、40wt％甲醇水溶液各10mL洗涤样品，然后以60wt％甲醇水溶液洗脱样品，收集洗脱液，脱液置于60℃水浴中用氮气吹至近干，以甲醇复溶、定容至5mL，取续滤液，得检测参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1三种指标成分的供试品溶液。
将上述对照品储备液和供试品溶液分别注入UPLC进行测定。
试验结果证明，实施例4-6中除了人参皂苷Rg1和人参皂苷Re之外，其他指标成分的色谱峰与其相邻色谱峰之间的分离度均大于1.5，各色谱峰的理论塔板数不低于30000。
对比例1
超高效液相色谱(UPLC)条件：色谱柱：CNW XDB-C18(100mm×4.6mm，3μm)；流动相：乙腈(A)-醋酸铵缓冲溶液(pH 4.5；1mmol/L)(B)；流速：0.5mL·min-1；梯度洗脱条件见表1；柱温：30℃；进样量：5μL；检测波长：203nm，260nm，290nm，360nm。
取与实施例4中相同的供试品溶液和混合对照品工作液分别注入UPLC进行测定，记录色谱图。
可以证明，将本发明提供的检测方法中的色谱柱更换为其他色谱柱，无法实现保元汤中多种组分的有效分离。
对比例2
超高效液相色谱(UPLC)条件：色谱柱：Shimadzu shim-pack C18(150mm×4.6mm,5μm)；流动相：乙腈(A)-醋酸铵缓冲溶液(pH 4.5；1mmol/L)(B)；流速：0.5mL·min-1；梯度洗脱条件见表1；柱温：30℃；进样量：5μL；检测波长：203nm，260nm，290nm，360nm。
取与实施例4中相同的供试品溶液和混合对照品工作液分别注入UPLC进行测定，记录色谱图。
可以证明，将本发明提供的检测方法中的色谱柱更换为其他色谱柱，无法实现保元汤中多种组分的有效分离。
对比例3
超高效液相色谱(UPLC)条件：色谱柱：AgilentProshell 120 EC-C18(100mm×4.6mm，2.7μm)；流动相：乙腈(A)-水(B)；流速：0.5mL·min-1；梯度洗脱条件见表1；柱温：30℃；进样量：5μL；检测波长：203nm，260nm，290nm，360nm。
取与实施例4中相同的供试品溶液和混合对照品工作液分别注入UPLC进行测定，记录色谱图。
可以证明，将本发明提供的检测方法中的流动相替换为乙腈-水按照相同的梯度进行洗脱，无法实现保元汤中多种组分的有效分离。
对比例4
超高效液相色谱(UPLC)条件：色谱柱：AgilentProshell 120 EC-C18(100mm×4.6mm，2.7μm)；流动相：乙腈(A)-0.05％磷酸溶液(B)；流速：0.5mL·min-1；梯度洗脱条件见表1；柱温：30℃；进样量：5μL；检测波长：203nm，260nm，290nm，360nm。
取与实施例4中相同的供试品溶液和混合对照品工作液分别注入UPLC进行测定，记录色谱图。
可以证明，将本发明提供的检测方法中的流动相替换为乙腈-0.05％磷酸溶液按照相同的梯度进行洗脱，无法实现保元汤中多种组分的有效分离。
对比例5
超高效液相色谱(UPLC)条件：色谱柱：AgilentProshell 120 EC-C18(100mm×4.6mm，2.7μm)；流动相：乙腈(A)-0.1％甲酸溶液(B)；流速：0.5mL·min-1；梯度洗脱条件见表1；柱温：30℃；进样量：5μL；检测波长：203nm，260nm，290nm，360nm。
取与实施例4中相同的供试品溶液和混合对照品工作液分别注入UPLC进行测定，记录色谱图。
可以证明，将本发明提供的检测方法中的流动相替换为乙腈-0.1％甲酸溶液按照相同的梯度进行洗脱，无法实现保元汤中多种组分的有效分离。
对比例6
超高效液相色谱(UPLC)条件：色谱柱：AgilentProshell 120 EC-C18(100mm×4.6mm，2.7μm)；流动相：乙腈(A)-醋酸铵溶液(1mmol/L，pH4.5)(B)；流速：0.5mL·min-1；梯度洗脱条件见表1；柱温：40℃；进样量：5μL；检测波长：203nm，260nm，290nm，360nm。
取与实施例4中相同的供试品溶液和混合对照品工作液分别注入UPLC进行测定，记录色谱图。
可以证明，将柱温调节为40℃时不能实现保元汤中多种组分的有效分离。
对比例7
超高效液相色谱(UPLC)条件：色谱柱：AgilentProshell 120 EC-C18(100mm×4.6mm，2.7μm)；流动相：乙腈(A)-醋酸铵缓冲溶液(pH4.5；1mmol/L)(B)；流速：0.8mL·min-1；梯度洗脱条件见表1；柱温：30℃；进样量：5μL；检测波长：203nm，260nm，290nm，360nm。
取与实施例4中相同的供试品溶液和混合对照品工作液分别注入UPLC进行测定，记录色谱图。
可以证明，实施例7中将流速调节为0.8mL/min，无法实现保元汤中多种有效组分的充分分离。
采用本发明提供的检测方法对保元汤口服液或保元汤固体制剂中上述多种指标成分进行检测，同样可以达到与保元汤水煎液基本相当的检测效果。制备保元汤口服液或固体制剂的供试品溶液时按照本领域常规操作制备成浓度在线性范围内的供试品溶液即可，其他检测步骤同保元汤水煎液的相同。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (11)

1.一种保元汤制剂中多指标成分的同时检测方法，所述保元汤制剂的指标成分包括人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮、甘草苷、甘草酸、芹糖异甘草苷、异甘草苷和肉桂酸，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：
(1)供试品溶液和混合对照品工作液的配制：
取保元汤制剂制成供试品溶液；
取人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮、甘草苷、甘草酸单铵盐、芹糖异甘草苷、异甘草苷和肉桂酸对照品，用溶剂配制成混合对照品工作液；
(2)按照下述超高效液相色谱条件对所述供试品溶液和混合对照品工作液进行检测，色谱条件为：
色谱柱：十八烷基键合硅胶色谱柱；
DAD检测器，检测波长201-205nm，258-262nm，288-292nm，358-362nm；
流动相A：乙腈，流动相B：醋酸铵缓冲溶液；
洗脱方式为梯度洗脱。
2.如权利要求1所述的保元汤制剂中多指标成分的同时检测方法，其特征在于，所述梯度洗脱的洗脱程序如下：
0-10min，7％→23.5％流动相A，93％→76.5％流动相B；
10-16min，23.5％流动相A，76.5％流动相B；
16-18min，23.5％→26％流动相A，76.5％→74％流动相B；
18-22min，26％→32％流动相A，74％→68％流动相B；
22-27min，32％→52％流动相A，68％→48％流动相B；
27-32min，52％→90％流动相A，48％→10％流动相B。
3.如权利要求1所述的保元汤制剂中多指标成分的同时检测方法，其特征在于，所述醋酸铵缓冲液的浓度为0.8-1.2mmol/L，pH为4.3-4.7。
4.如权利要求1或3所述的保元汤制剂中多指标成分的同时检测方法，其特征在于，所述醋酸铵缓冲液的浓度为1.0mmol/L，pH为4.5。
5.如权利要求1所述的保元汤制剂中多指标成分的同时检测方法，其特征在于，流速为0.4-0.6mL/min，柱温为25-35℃。
6.如权利要求1所述的保元汤制剂中多指标成分的同时检测方法，其特征在于，检测波长为203nm、260nm、290nm和360nm。
7.如权利要求1所述的保元汤制剂中多指标成分的同时检测方法，其特征在于，流速为0.5mL/min，柱温为30℃，进样体积为5μL。
8.如权利要求1所述的保元汤制剂中多指标成分的同时检测方法，其特征在于，所述色谱柱的规格为100*4.6mm，填料直径为2.7μm。
9.如权利要求8所述的保元汤制剂中多指标成分的同时检测方法，其特征在于，所述色谱柱为Agilent Proshell 120 EC-C18。
10.如权利要求1所述的保元汤制剂中多指标成分的同时检测方法，所述保元汤制剂包括保元汤液体制剂和保元汤固体制剂，其特征在于，所述供试品溶液的制备方法包括如下步骤：
S1，精密量取所述保元汤液体制剂或保元汤固体制剂的水溶液，加入无水乙醇，涡旋，离心，取上清液蒸干后，甲醇溶解定容，过滤，得检测除人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1之外其他指标成分的供试品溶液；
S2，精密量取所述保元汤液体制剂或保元汤固体制剂的水溶液加入Oasis HLB型固相萃取柱中，以纯净水、38-42wt％甲醇水溶液洗涤样品，然后以58-62wt％甲醇水溶液洗脱样品，收集洗脱液，在惰性氛围下蒸干，甲醇溶解定容，过滤，得检测人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1三种指标成分的供试品溶液。
11.如权利要求1所述的保元汤制剂中多指标成分的同时检测方法，其特征在于，所述混合对照品工作液中各指标成分的浓度为：人参皂苷Re、Rg1、Rb1的浓度均分别为400、200、100、50、25μg·mL-1；毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮、甘草苷、芹糖异甘草苷、甘草酸单铵盐、肉桂酸的浓度均分别为500、250、50、10和2μg·mL-1；异甘草苷的浓度分别为200、100、20、4、0.8μg·mL-1。
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