CN113984916B - 一种正髓丸及正髓丸药材含量测定方法 - Google Patents
一种正髓丸及正髓丸药材含量测定方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于中医药技术领域，尤其是一种正髓丸及正髓丸药材含量测定方法，包括如下重量份数的组分：制附子7‑10份，白附子6‑10份，人参6‑10份，枸杞子5‑10份，滑石5‑10份，青黛4‑5份，甘草3‑5份。该正髓丸及正髓丸药材含量测定方法，制备的正髓丸具有对血液恶性肿瘤骨髓损伤修复的功能，和温阳化痰、益气通络的效果，通过正髓丸药材含量测定方法，该方法稳定、可靠、灵敏、专属性好，适宜进行低含量成分的检测，从而解决了现有的血液恶性肿瘤骨髓损伤进行修复治疗时，具有治疗效果的中药优势更加明显，但是使用过程中，由于中药种类繁多、浩瀚，存在如何确定测定中药中药材含量，适合对血液恶性肿瘤骨髓损伤进行修复的问题。
Description
技术领域
本发明涉及中医药技术领域，尤其涉及一种正髓丸及正髓丸药材含量测定方法。
背景技术
中药以中国传统医药理论指导采集、炮制、制剂，说明作用机理，指导临床应用的药物，统称为中药。简而言之，中药就是指在中医理论指导下，用于预防、治疗、诊断疾病并具有康复与保健作用的物质。中药主要来源于天然药及其加工品，包括植物药、动物药、矿物药及部分化学、生物制品类药物。由于中药以植物药居多，故有“诸药以草为本”的说法。
我国传统医药之所以历经数千年而不衰，至今在医疗保健中发挥着不可替代的作用，并且在世界传统医药领域处于领先地位，是由自身理论的科学性和优势所决定的。随着疾病谱的变化，老龄化社会的到来和健康观念的转变，中医药学的优势越来越显现出来，其科学性和先进性越来越被学术界、产业界所重视。
在使用过程中，中医药具有以下优势，一、中医药对生命活动的认识，提供了人类认识和把握人体复杂体系的有效途径；二、中医药对生命活动的认识，提供了人类认识和把握人体复杂体系的有效途径；三、中医药丰富的治疗手段和灵活的方法，符合人体生理病理多样性的特点；四、中医药浩瀚的经典医籍，是人类生物信息的巨大宝库。中医药现存古典医籍8000余种，记载着数千年来中医药的理论和实践经验。这是绝无仅有的，尚未被充分开采的人类生物信息的宝库；五、中医药充分体现了自然科学与社会科学的有机结合，展示了现代科学一体化的新趋势。
相对比新药，传统中药经过多年使用，其安全性更高，因此在对血液恶性肿瘤骨髓损伤进行修复治疗时，具有治疗效果的中药优势更加明显，但是使用过程中，由于中药种类繁多、浩瀚，存在如何确定测定中药中药材含量，适合对血液恶性肿瘤骨髓损伤进行修复的问题，所以需要一种正髓丸及正髓丸药材含量测定方法。
发明内容
基于现有的血液恶性肿瘤骨髓损伤进行修复治疗时，具有治疗效果的中药优势更加明显，但是使用过程中，由于中药种类繁多、浩瀚，存在如何确定测定中药中药材含量，适合对血液恶性肿瘤骨髓损伤进行修复的技术问题，本发明提出了一种正髓丸及正髓丸药材含量测定方法。
本发明提出的一种正髓丸及正髓丸药材含量测定方法，包括如下重量份数的组分：制附子7-10份，白附子6-10份，人参6-10份，枸杞子5-10份，滑石5-10份，青黛4-5份，甘草3-5份。
优选地，包括如下重量份数的组分：制附子7.5-8.0份，白附子6.5-8.0份，人参6.5-8.0份，枸杞子5.5-7.5份，滑石5.5-8.0份，青黛4.0-4.5份，甘草3.0-3.5份。
优选地，包括如下重量份数的组分：制附子8.5-9.5份，白附子7.0-9.0份，人参8.5-9.5份，枸杞子8.0-9.5份，滑石8.5-9.0份，青黛4.6-5.0份，甘草3.6-4.5份。
优选地，包括如下重量份数的组分：制附子10份，白附子10份，人参10份，枸杞子10份，滑石10份，青黛5份，甘草5份。
优选地，一种正髓丸药材含量测定方法，包括如下步骤：步骤一、色谱条件准备；
步骤二、质谱条件准备；
步骤三、数据处理与分析；
步骤四、化合物相关靶点的收集；
步骤五、BSJDTLF提取物指纹图谱建立；
步骤六、靶点治疗；
步骤七、配制标准曲线；
步骤八、样品制备；
步骤九、色谱分析；
步骤十、质谱分析；
步骤十一、方法学验证，完成测定，获得结果。
优选地，所述步骤一中色谱条件准备，采用ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱,流动相0.1％甲酸水溶液(A)-乙腈(D)梯度洗脱；流速0.3mL·min-1，进样量2μL，柱温35℃；
所述步骤二中质谱条件准备，质谱分析在Thermo Fisher Q-Orbitrap MS系统下完成，离子源为高能电喷雾离子源，扫描模式为Full-ms/dd-ms2，正负离子模式下同时采集，源参数：源喷雾电压正离子为3.5kV，负离子为2.8kV，毛细管温度320℃，离子源加热温度350℃，鞘气(sheath gas，N2)为35，辅助气为10，S-lens水平为50V，碰撞能量为20V，40V，60V，扫描范围为m/z100~1500，分辨率为70000。
优选地，所述步骤三中数据处理与分析，将采集到的原始数据利用Xcalibur软件进行数据记录、分析及处理，所述步骤四中化合物相关靶点的收集，质谱结果中化合物的相关靶点在TCMSP与CTD两个数据库检索得到。
优选地，所述步骤五中BSJDTLF提取物指纹图谱建立，复方提取物的提取总离子流图，通过准确的分子离子质量及二级碎片进行分析，所述步骤六中靶点治疗，使用TCMSP与CTD数据库检索质谱结果中182个化合物的对应靶点，将这些靶点结果通过Uniprot及DAVID数据库统一基因名称。
优选地，所述步骤七中配制标准曲线，分别精确称量甜菜碱、人参皂苷Rd、人参皂苷Rg1、琥珀酸、牛磺酸、γ-氨基丁酸、柠檬酸、异甘草素、烟酸、人参皂苷Re除牛磺酸用水溶解外其余全部用纯甲醇溶解，配置成1mg/ml的母液，将10种化合物混合配制成混合溶液，随后逐级稀释至一系列所需浓度。
优选地，所述步骤八中样品制备，正髓丹样品每个样品平行称量三份，随后加入1mL甲醇溶解，超声提取30分钟，14000rpm/min离心10分钟，取上清液待检测。
本发明中的有益效果为：
通过采用制附子7-10份，白附子6-10份，人参6-10份，枸杞子5-10份，滑石5-10份，青黛4-5份，甘草3-5份，制备的正髓丸具有对血液恶性肿瘤骨髓损伤修复的功能，和温阳化痰、益气通络的效果，通过正髓丸药材含量测定方法，利用UHPLC/ESI-Q-Orbitrap MS建立了药材中10种化合物的定量方法，并进行了方法学考察，所建立的方法符合药材含量测定的要求，该方法稳定、可靠、灵敏、专属性好，适宜进行低含量成分的检测，从而解决了现有的血液恶性肿瘤骨髓损伤进行修复治疗时，具有治疗效果的中药优势更加明显，但是使用过程中，由于中药种类繁多、浩瀚，存在如何确定测定中药中药材含量，适合对血液恶性肿瘤骨髓损伤进行修复的问题。
附图说明
图1为本发明提出的一种正髓丸及正髓丸药材含量测定方法的示意图；
图2为本发明提出的一种正髓丸及正髓丸药材含量测定方法的化合物专属性图；
图3为本发明提出的一种正髓丸及正髓丸药材含量测定方法的化合物专属性图；
图4为本发明提出的一种正髓丸及正髓丸药材含量测定方法的化合物专属性图；
图5为本发明提出的一种正髓丸及正髓丸药材含量测定方法的化合物专属性图；
图6为本发明提出的一种正髓丸及正髓丸药材含量测定方法的化合物专属性图；
图7为本发明提出的一种正髓丸及正髓丸药材含量测定方法的化合物专属性图；
图8为本发明提出的一种正髓丸及正髓丸药材含量测定方法的化合物专属性图；
图9为本发明提出的一种正髓丸及正髓丸药材含量测定方法的化合物专属性图；
图10为本发明提出的一种正髓丸及正髓丸药材含量测定方法的化合物专属性图；
图11为本发明提出的一种正髓丸及正髓丸药材含量测定方法的化合物线性方程图；
图12为本发明提出的一种正髓丸及正髓丸药材含量测定方法的化合物线性方程图；
图13为本发明提出的一种正髓丸及正髓丸药材含量测定方法的化合物线性方程图；
图14为本发明提出的一种正髓丸及正髓丸药材含量测定方法的化合物线性方程图；
图15为本发明提出的一种正髓丸及正髓丸药材含量测定方法的化合物线性方程图；
图16为本发明提出的一种正髓丸及正髓丸药材含量测定方法的化合物线性方程图；
图17为本发明提出的一种正髓丸及正髓丸药材含量测定方法的化合物线性方程图；
图18为本发明提出的一种正髓丸及正髓丸药材含量测定方法的化合物线性方程图；
图19为本发明提出的一种正髓丸及正髓丸药材含量测定方法的化合物线性方程图；
图20为本发明提出的一种正髓丸及正髓丸药材含量测定方法的化合物线性方程图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
实施例一
一种正髓丸，包括如下重量份数的组分：制附子7-10份，白附子6-10份，人参6-10份，枸杞子5-10份，滑石5-10份，青黛4-5份，甘草3-5份；
优选组分为，制附子7.5-8.0份，白附子6.5-8.0份，人参6.5-8.0份，枸杞子5.5-7.5份，滑石5.5-8.0份，青黛4.0-4.5份，甘草3.0-3.5份；
优选组分为，制附子8.5-9.5份，白附子7.0-9.0份，人参8.5-9.5份，枸杞子8.0-9.5份，滑石8.5-9.0份，青黛4.6-5.0份，甘草3.6-4.5份；
优选组分为，制附子10份，白附子10份，人参10份，枸杞子10份，滑石10份，青黛5份，甘草5份；
通过采用制附子7-10份，白附子6-10份，人参6-10份，枸杞子5-10份，滑石5-10份，青黛4-5份，甘草3-5份，制备的正髓丸具有对血液恶性肿瘤骨髓损伤修复的功能，和温阳化痰、益气通络的效果，通过正髓丸药材含量测定方法，利用UHPLC/ESI-Q-Orbitrap MS建立了药材中10种化合物的定量方法，并进行了方法学考察，所建立的方法符合药材含量测定的要求，该方法稳定、可靠、灵敏、专属性好，适宜进行低含量成分的检测，从而解决了现有的血液恶性肿瘤骨髓损伤进行修复治疗时，具有治疗效果的中药优势更加明显，但是使用过程中，由于中药种类繁多、浩瀚，存在如何确定测定中药中药材含量，适合对血液恶性肿瘤骨髓损伤进行修复的问题。
实施例二
参照图1-20，一种正髓丸的药材含量测定方法，包括如下步骤：
步骤一、色谱条件准备；
步骤一中色谱条件准备，采用ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱(2.1mm×100mm，1.8μm),流动相0.1％甲酸水溶液(A)-乙腈(D)梯度洗脱(0～4min,1％D,4～4.5min，1％～10％D；4.5～5.5min，10％～20％D；5.5～9.5min，20％～30％D；9.5～14.5min，30％～46％D；14.5～16.5min，46％～100％D；16.5～17min，100％D，17～17.5min,100％～1％D，17.5～21min，1％D)；流速0.3mL·min-1，进样量2μL，柱温35℃；
步骤二、质谱条件准备；
步骤二中质谱条件准备，质谱分析在Thermo Fisher Q-Orbitrap MS(Q-Exative)系统下完成，离子源为高能电喷雾离子源(HESI源)，扫描模式为Full-ms/dd-ms2，正负离子模式下同时采集，源参数：源喷雾电压(spray voltage)正离子为3.5kV，负离子为2.8kV，毛细管温度(capillary temperature)320℃，离子源加热温度(probe heater temperature)350℃，鞘气(sheath gas，N2)为35，辅助气(auxiliary gas，N2)为10，S-lens水平为50V，碰撞能量为20V，40V，60V，扫描范围为m/z 100~1500，分辨率为70000；
步骤三、数据处理与分析；
步骤三中数据处理与分析，将采集到的原始数据利用Xcalibur(4.2,Thermo-Fisher Scientific)软件进行数据记录、分析及处理，化合物的鉴定是基于文献的基础，根据化合物的质荷比，二级碎片进行；
步骤四、化合物相关靶点的收集；
步骤四中化合物相关靶点的收集，质谱结果中化合物的相关靶点是在TCMSP(https://tcmspw.com/tcmsp.php)与CTD(http://ctdbase.org/)两个数据库检索得到的。检索结果通过Uniprot(https://www.uniprot.org/)与DAVID(https://david.ncifcrf.gov/home.jsp)数据库统一基因名称。对统一名称后的靶点与化合物对应关系进行合并并删除重复项；
步骤五、BSJDTLF提取物指纹图谱建立；
步骤五中BSJDTLF提取物指纹图谱建立，复方提取物的提取总离子流图，如图1所示，通过准确的分子离子质量及二级碎片进行分析，数据精度误差阈值在5ppm以内，共鉴定出182个化合物，鉴定结果如下表(化合物鉴定汇总)所示；
步骤六、靶点治疗；
步骤六中靶点治疗，使用TCMSP与CTD数据库检索质谱结果中182个化合物的对应靶点，将这些靶点结果通过Uniprot及DAVID数据库统一基因名称。去除重复项后，共得到与其中100种化合物相关的1969个靶点。其中，包含了与细胞周期、细胞凋亡、炎症相关等功能富集，P53、铂耐药、细胞凋亡、HIF-1等通路富集；
步骤七、配制标准曲线；
步骤七中配制标准曲线，分别精确称量甜菜碱(1.01mg)、人参皂苷Rd(0.98mg)、人参皂苷Rg1(0.98mg)、琥珀酸(1.01mg)、牛磺酸(1.01mg)、γ-氨基丁酸(1.01mg)、柠檬酸(1.01mg)、异甘草素(0.98mg)、烟酸(0.98mg)、人参皂苷Re(1.00mg)除牛磺酸用水溶解外其余全部用纯甲醇溶解，配置成1mg/ml的母液，将10种化合物混合配制成混合溶液，随后逐级稀释至一系列所需浓度；
步骤八、样品制备；
步骤八中样品制备，正髓丹样品每个样品平行称量三份数据如下表(样品称取重量表)所示，随后加入1mL甲醇溶解，超声提取30分钟，14000rpm/min离心10分钟，取上清液待检测；
步骤九、色谱分析；
步骤九中色谱分析，采用仪器：UHPLC-MS UHPLC(ultimate3000)Q-ExativeMS(Thermo)；色谱柱：Acquityuplc HSS T3 1.7μm2.1x100mm；流动相：pump A：0.1％甲酸水；pump D：乙腈；进样量：2μl；柱温：35℃；
步骤十、质谱分析；
步骤十中质谱分析，扫描模式为正负离子Full-MSddms2，毛细管温度为320℃，辅助气温度为350℃；喷雾电压正离子模式为3.0kV，负离子模式为2.8kV；鞘气(N2)为40(arb)，辅助气(N2)为10arb(N2，纯度99.9％)。碰撞能量(NCE)为20、40、60V，扫描范围为m/z100-1500。
步骤十一、方法学验证，完成测定，获得结果；
步骤十一中方法学验证，方法学中主要考察了专属性、线性、定量限(LOQ)、稳定性、精密度等内容；
进一步地，专属性考察，样品的专属性考察是通过将空白溶剂、加入标准品溶液和样品的色谱图进行比较来进行验证，结果如图2-10所示，图中a为空白溶剂，b为标准品，c为样品结果，表明这10个化合物都有很好的专属性。
进一步地，线性及定量限，将标准品溶液逐级稀释成一系列的浓度，最终取上清液2μL进样测定。以样品中目标化合物的峰面积(Y)为纵坐标，以待测物浓度(X)为横坐标，用加权最小二乘法进行回归计算，权重系数为1/X2，线性方程、相关系数、线性范围及定量限结果如下表(淫羊藿苷的线性回归方程、相关系数、线性范围及定量线)及图11-20所示；
进一步地，精密度及稳定性，精密度的测定：将10种化合物的混合标准品溶液连续测定6针，记录10种化合物的峰面积，并计算出浓度，精密度以RSD值表示，结果如下表(10种化合物的精密度及4h稳定性和12h稳定性)所示所有化合物的精密度值均小于10％,表明该方法的精密度良好，符合药材相关规范要求。
稳定性的测定：将配制的10种化合物的混合溶液分别考察其在室温下放置4h、12h的稳定性，结果如下表(10种化合物的精密度及4h稳定性和12h稳定性)所示，RSD值均符合要求，说明样品在室温下处理相对稳定；
进一步地，定量结果，10种化合物的浓度及含量(n＝3)，如下表所示，
通过采用制附子7-10份，白附子6-10份，人参6-10份，枸杞子5-10份，滑石5-10份，青黛4-5份，甘草3-5份，制备的正髓丸具有对血液恶性肿瘤骨髓损伤修复的功能，和温阳化痰、益气通络的效果，通过正髓丸药材含量测定方法，利用UHPLC/ESI-Q-Orbitrap MS建立了药材中10种化合物的定量方法，并进行了方法学考察，所建立的方法符合药材含量测定的要求，该方法稳定、可靠、灵敏、专属性好，适宜进行低含量成分的检测，从而解决了现有的血液恶性肿瘤骨髓损伤进行修复治疗时，具有治疗效果的中药优势更加明显，但是使用过程中，由于中药种类繁多、浩瀚，存在如何确定测定中药中药材含量，适合对血液恶性肿瘤骨髓损伤进行修复的问题。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (1)
1.一种正髓丸的药材含量测定方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、色谱条件准备；
步骤二、质谱条件准备；
步骤三、数据处理与分析；
步骤四、化合物相关靶点的收集；
步骤五、BSJDTLF提取物指纹图谱建立；
步骤六、靶点治疗；
步骤七、配制标准曲线；
步骤八、样品制备；
步骤九、色谱分析；
步骤十、质谱分析；
步骤十一、方法学验证，完成测定，获得结果；
所述步骤一中色谱条件准备，采用 ACQUITY UPLC HSS T3 色谱柱,流动相 ：A:0.1%甲酸水溶液,D:乙腈,梯度洗脱;流速 0.3 m·min-1，进样量 2μL，柱温 35℃；
所述步骤二中质谱条件准备，质谱分析在Thermo Fisher Q-Orbitrap MS系统下完成，离子源为高能电喷雾离子源，扫描模式为Full-ms/dd-ms2，正负离子模式下同时采集，源参数：源喷雾电压正离子为3.5 kV，负离子为2.8 kV，毛细管温度320 ℃，离子源加热温度350℃，鞘气 N2为35，辅助气为10，S-lens水平为50 V，碰撞能量为20 V，40 V，60 V，扫描范围为m/z 100~1500，分辨率为70000；
所述步骤三中数据处理与分析，将采集到的原始数据利用Xcalibur 软件进行数据记录、分析及处理，所述步骤四中化合物相关靶点的收集，质谱结果中化合物的相关靶点在TCMSP 与CTD 两个数据库检索得到；
所述步骤五中BSJDTLF提取物指纹图谱建立，复方提取物的提取总离子流图，通过准确的分子离子质量及二级碎片进行分析，所述步骤六中靶点治疗，使用TCMSP与CTD数据库检索质谱结果中182个化合物的对应靶点，将这些靶点结果通过Uniprot及DAVID数据库统一基因名称；
所述步骤七中配制标准曲线，分别精确称量甜菜碱、人参皂苷Rd、人参皂苷Rg1、琥珀酸、牛磺酸、γ-氨基丁酸、柠檬酸、异甘草素、烟酸、人参皂苷Re除牛磺酸用水溶解外其余全部用纯甲醇溶解，配置成1mg/ml的母液，将10种化合物混合配制成混合溶液，随后逐级稀释至一系列所需浓度；
所述步骤八中样品制备，正髓丹样品每个样品平行称量三份，随后加入1 mL甲醇溶解，超声提取30分钟，14000 rpm/min离心10分钟，取上清液待检测；
所述步骤九中色谱分析，采用仪器：UHPLC-MS UHPLC ultimate3000 Q-ExativeMSThermo ，色谱柱：Acquityuplc HSS T3 1.7 μm 2.1x100mm，流动相：pump A：0.1%甲酸水，pump D：乙腈，进样量：2μl；柱温：35℃；
所述步骤十中质谱分析，扫描模式为正负离子Full- MSddms2，毛细管温度为320℃，辅助气温度为350℃，喷雾电压正离子模式为3.0 kV，负离子模式为2.8 kV，鞘气 N2为40arb，辅助气 N2为10 arb，N2纯度99.9%，碰撞能量NCE为20、40、60 V，扫描范围为m/z 100-1500。
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