CN112903868B - 一种复方番石榴制剂中多种化学成分的含量测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种复方番石榴制剂中多种化学成分的含量测定方法,包括确定色谱条件,对照品溶液的制备,供试品溶液的制备和测定法等步骤。该方法可以在同一色谱条件下同时检测复方番石榴制剂中七种成分的含量,不仅能有效简化操作步骤,而且显著缩短了测定时间,大大提高了检测效率。本发明的检测方法简便、灵敏度高,七种成分的色谱峰分离度较好,且峰型完整,检测方法具有专属性,其准确性、重现性、线性关系、稳定性均能达到科研和生产的要求,适于推广应用。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域,具体涉及一种复方番石榴制剂中多种化学成分的含量测定方法。
背景技术
复方番石榴制剂由番石榴叶、五指毛桃、鬼箭羽等组成,临床应用时间久,疗效显著,对于超重肥胖2型糖尿病患者的血糖调节及症状改善方面有明显优势。番石榴叶的主要活性成分黄酮类化合物是其降糖有效成分,临床可用以番石榴叶为主药的复方制剂治疗糖尿病。黄连中的盐酸小檗碱对初发2型糖尿病患者降糖疗效较好并能够有效改善肠道菌群紊乱。以上这些有效成分是复方番石榴制剂药理作用的主要物质基础,也是质量控制常用的指标物。
目前尚未发现有关复方番石榴制剂质量控制方面的文献报道。因此,有必要对该复方制剂的含量测定方法进行研究,开发一种操作简单,全面、准确,且耗时短的方法,以便对复方番石榴制剂的质量进行有效全面的控制。
发明内容
本发明的目的在于提供一种复方番石榴制剂中多种化学成分的含量测定方法,该方法可以在同一色谱条件下同时检测复方番石榴制剂中金丝桃苷、异槲皮苷、瑞诺苷、萹蓄苷、番石榴苷、盐酸小檗碱和槲皮素七种成份的含量,简便快捷,耗时短,为研究复方番石榴制剂的质量控制新方法奠定了一定的基础。
本发明是通过以下技术方案实现:
一种复方番石榴制剂中多种化学成分的含量测定方法,所述复方番石榴制剂由番石榴叶
120~180份、五指毛桃80~120份、党参120~180份、苍术50~100份、山楂50~100份、鬼箭羽50~100份、桑叶50~100份、黄连30~70份、干姜30~70份和红曲50~100份制成,包括以下步骤:
(1)确定的色谱条件:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以乙腈为流动相A,以0.2%磷酸水溶液为流动相B,流速为0.8-1.2 ml/min;柱温为25-35 ℃;进样量为10 µl;检测波长为360 nm;理论塔板数以金丝桃苷计算应不低于3000,以番石榴苷计算应不低于4000,以盐酸小檗碱计算应不低于3000;梯度洗脱程序如下:
t/min | A/% | B/% |
0 | 11 | 89 |
15 | 13.5 | 86.5 |
30 | 18 | 82 |
32 | 19 | 81 |
40 | 19 | 81 |
65 | 49 | 51 |
70 | 11 | 89 |
(2)对照品溶液制备:精密称取金丝桃苷、异槲皮苷、瑞诺苷、萹蓄苷、番石榴苷、盐酸小檗碱、槲皮素对照品为溶质,加入甲醇制成七种单项对照品标准溶液,精密吸取七种单项对照品标准溶液混合后,加入适量甲醇稀释定容,制成混合对照品溶液;
(3)供试品溶液制备:按照处方量分别称取各组分,加水煎煮20-40 min,放冷,滤过,滤液浓缩至50 ml,精密吸取滤液10 ml至50 ml容量瓶中,用甲醇稀释定容,冷藏20-30min,滤过,取续滤液,即得;
(4)测定法:分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl,依上述色谱条件进行测定,按外标法计算即得。
优选的,步骤(1)中,色谱柱为ZORBAX Eclipse Plus C18柱, 4.6×250 mm ,5 µm。
优选的,步骤(1)中,流速为1.0ml/min;柱温为30 ℃。
本发明与现有技术相比,具有如下有益效果:
本发明方法通过优化色谱条件可以在同一色谱条件下同时检测复方番石榴制剂中金丝桃苷、异槲皮苷、瑞诺苷、萹蓄苷、番石榴苷、盐酸小檗碱和槲皮素七种成份的含量,不仅能有效简化操作步骤,而且显著缩短了测定时间,大大提高了检测效率,为研究复方番石榴制剂的质量控制新方法奠定了一定的基础。
本发明的检测方法简便、灵敏度高,七种成分的色谱峰分离度较好,且峰型完整,检测方法具有专属性,其准确性、重现性、线性关系、稳定性均能达到科研和生产的要求,适于推广应用。
附图说明
图1为本发明混合对照品溶液的色谱图;
图2为本发明供试品溶液的色谱图;
图3为本发明空白试剂对照色谱图;
图4为本发明黄连阴性对照色谱图;
图5为本发明番石榴叶、桑叶、五指毛桃、鬼箭羽阴性对照色谱图;
(其中,1.金丝桃苷;2.异槲皮苷;3.瑞诺苷;4.番石榴苷;5.萹蓄苷;6.盐酸小檗碱;7.槲皮素);
图6为色谱条件方法优化1的色谱图;
图7为色谱条件方法优化2的色谱图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明,以下实施例为本发明具体的实施方式,但本发明的实施方式并不受下述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
1 试验材料
1.1 仪器
1260型高效液相色谱仪 ( 美国Agilent公司 ) ,在线真空脱气装置、四元梯度泵、自动进样器、柱温箱以及DAD检测器。BS224S型万分之一电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司) ;KQ3200E型医用超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司) ;HH-S4型数显恒温水浴锅(金坛市医疗仪器厂)。
1.2 药物与试剂
1金丝桃苷对照品( 批号:CFN98754,含量 > 98% )、2异槲皮苷对照品
( 批号:CFN98753,含量 > 98% )、3瑞诺苷对照品 ( 批号:CFN90718,含量 >98% ) 和5萹蓄苷对照品( 批号:CFN98961,含量 > 98% )均购自武汉天植生物技术有限公司;4番石榴苷对照品 ( 批号:DST191016-023,含量 > 98% )购自成都德思特生物技术有限公司;6盐酸小檗碱对照品 ( 批号:110713-201613,含量 > 86.8% ) 和7槲皮素对照品 ( 批号:081-9003,含量 > 98.5% )均购自中国食品药品检定研究院。复方番石榴制剂为自制;甲醇为色谱纯,水为超纯水,其他试剂均为分析纯。
1.3 药材
番石榴叶(产地:广东,批号200401)、五指毛桃(产地:广东,批号C22012115)、党参(产地:甘肃,批号C12010187)、苍术(产地:内蒙古,批号C22010118)、鬼箭羽(产地:广西,批号200401)、桑叶(产地:广东,批号C22011122)、山楂(产地:河北,批号C22011011)、黄连(产地:四川,批号C22008120)、干姜(产地:四川,批号201102)和红曲(产地:浙江,批号201001)。番石榴叶和鬼箭羽均购于广州康圣药业有限公司,五指毛桃、党参、苍术、桑叶、山楂和黄连饮片均购于国药集团冯了性(佛山)药材饮片有限公司,干姜和红曲均购于广州至信中药饮片有限公司。
2 试验方法
2.1 供试品溶液的制备
按照复方番石榴制剂处方量分别称取番石榴叶7.5 g,五指毛桃5 g、党参5g、苍术3.5g、山楂3.5g、鬼箭羽3.5g、桑叶3.5g、黄连2.5g、干姜1.5g和红曲2.5g,置500 ml烧杯中,加水适量,煎煮40 min,放冷,滤过,滤液浓缩至50 ml,精密吸取滤液10 ml至50 ml容量瓶中,用甲醇稀释定容,冷藏30 min,滤过,取续滤液,即得。
2.2 对照品贮备液的制备
分别精密称取1~7对照品6.8 mg、5.2 mg、8.8 mg、10.4 mg、8.6 mg、12.5 mg和11.0 mg,分别置于25 ml量瓶中,用甲醇溶解并定容,摇匀,得到1~7浓度为0.272、0.208、0.352、0.416、0.344、0.500和0.440 mg/ml的对照品贮备液。
2.3 混合对照品溶液的制备
分别精密吸取上述1~7对照品贮备液各5、3、2、3、3、3和2 ml,置同一50 ml量瓶中,用甲醇稀释定容,摇匀,作为混合对照品溶液。
2.4 阴性对照溶液的制备
按照供试品溶液的制备方法,分别制备缺黄连和缺番石榴叶、桑叶、五指毛桃、鬼箭羽的阴性对照溶液。
2.5 色谱条件
色谱柱为ZORBAX Eclipse Plus C18柱(4.6×250 mm , 5 µm);流动相为乙腈(A) - 0.2%磷酸水溶液 (B),线性梯度洗脱,程序见表1;流速为1.0 ml/min;柱温为30℃;进样量为10 µl;检测波长为360 nm。理论塔板数以金丝桃苷计算应不低于3000,以番石榴苷计算应不低于4000,以盐酸小檗碱计算应不低于3000。色谱图见图2,由图2可知,复方番石榴制剂中的7个活性成分都能达到较好分离,样品中其它成分对测定成分无干扰;阴性样品色谱图(图4、5)中,各待测成分相对应的保留时间处均无干扰。
表1 梯度洗脱程序
t/min | A/% | B/% |
0 | 11 | 89 |
15 | 13.5 | 86.5 |
30 | 18 | 82 |
32 | 19 | 81 |
40 | 19 | 81 |
65 | 49 | 51 |
70 | 11 | 89 |
2.6 方法学考察
2.6.1 标准曲线的制作
分别精密吸取1、2、4、5和6号对照品储备液各1、3、5、8和10 ml,分别置于5只50 ml量瓶中混合;再精密吸取3号和7号对照品储备液1、2、5、8和10 ml,分别置于上述5只50 ml量瓶中混合,再用甲醇稀释定容至刻度,摇匀,制得浓度分别为5.44~54.4 µg/ml、4.16~41.6 µg/ml、7.04~70.4 µg/ml、8.32~83.2 µg/ml、6.88~68.8 µg/ml、10.0~100.0 µg/ml、8.8~ 88.0 µg/ml的1~7系列对照品溶液。精密吸取上述系列对照品溶液,分别注入液相色谱仪,以对照品溶液色谱峰面积A为纵坐标,对照品溶液浓度C(µg/ml)为横坐标,绘制标准曲线,并计算回归方程 (见表2)。结果表明1~7在上述浓度范围内线性关系良好。
表2 1~7的线性回归方程和线性范围
成分 | 线性回归方程 | 相关系数/R<sup>2</sup> | 线性范围(µg/ml) |
金丝桃苷 | Y = 8438.1 x - 7.9659 | 0.9996 | 5.44 ~ 54.4 |
异槲皮苷 | Y = 6620.2 x - 8.2911 | 0.9996 | 4.16 ~ 41.6 |
瑞诺苷 | Y = 7104.9 x + 2.2194 | 0.9995 | 7.04 ~ 70.4 |
番石榴苷 | Y = 8641.5 x + 6.0883 | 0.9996 | 8.32 ~ 83.2 |
萹蓄苷 | Y = 7194.1 x - 6.3788 | 0.9994 | 6.88 ~ 68.8 |
盐酸小檗碱 | Y = 3853.6 x - 2.8475 | 0.9998 | 10 ~ 100.0 |
槲皮素 | Y = 9863.8 x + 11.3200 | 0.9997 | 8.8 ~ 88.0 |
2.6.2 精密度试验
精密吸取同一混合对照品溶液,连续进样6次,按照“2.5项”下的方法测定各成分的峰面积,结果测得1~7的峰面积的RSD分别为1.56%、2.38%、1.05%、2.11%、1.67%、1.82%和2.36%,结果RSD均小于3.00%,说明仪器精密度良好。
2.6.3 稳定性试验
精密吸取同一复方番石榴制剂供试品溶液,分别于制备后0 h、2 h、4 h、8 h、12 h和24 h进样测定,按照“2.5项”下的方法测定复方番石榴制剂中7种成分的峰面积,计算得各成分峰面积的RSD分别为0.35%、0.47%、0.36%、0.46%、0.29%、0.61%和0.47%,结果RSD均小于3.00%,表明供试品溶液在24 h内稳定。
2.6.4 重复性试验
取复方番石榴制剂样品,共6份,精密称取,按“2.1”项下方法制备供试品溶液,按照“2.5项”下的色谱条件分别进样测定各供试品中7种成分的峰面积,计算复方番石榴制剂提取液中1 ~ 7成分的平均含量和对应成分含量的RSD值,结果见表3,表明重复性良好。
表3重复性试验结果(n = 6)
成分 | 平均含量(mg) | <i>RSD</i>(%) |
金丝桃苷 | 5.76 | 3.15 |
异槲皮苷 | 8.67 | 3.06 |
瑞诺苷 | 3.85 | 2.85 |
番石榴苷 | 6.25 | 2.68 |
萹蓄苷 | 9.15 | 3.04 |
盐酸小檗碱 | 4.11 | 2.62 |
槲皮素 | 1.62 | 3.43 |
2.6.5 加样回收率试验
按照处方量减半精密称取复方番石榴制剂样品各6份,分别加入对照品溶液适量,按照供试品溶液的制备方法制备,按“2.5项”下的色谱条件测定,计算复方番石榴制剂提取液中1 ~ 7的平均回收率和对应的RSD值。结果见表4,表明该方法准确性良好。
表4 7种成分的加样回收率试验(n = 6)
3 试验结果
取“2.6.4项”下6份复方番石榴制剂的提取液,按照“2.5 项”下的色谱条件进行检测分析,结果见表 5。
表5 复方番石榴制剂测定结果(n = 6)
成分 | 平均含量(mg) | <i>RSD</i>(%) |
金丝桃苷 | 5.69 | 3.62 |
异槲皮苷 | 8.15 | 3.15 |
瑞诺苷 | 3.89 | 2.93 |
番石榴苷 | 6.31 | 3.61 |
萹蓄苷 | 9.22 | 3.87 |
盐酸小檗碱 | 4.16 | 3.53 |
槲皮素 | 1.68 | 2.69 |
4方法分析
4.1 本试验采用HPLC法同时测定复方番石榴制剂中7种有效成分的含量,该方法简便,灵敏度高,重复性好,便于推广应用。通过预试验及结合相关文献方法,考察了不同色谱柱、流动相、流速、柱温等因素,选择分离度较好、基线较平稳的色谱条件。
4.2 本试验考察比较了Boston Green ODS C18柱( 4.6×250 mm,5 µm )和ZORBAX Eclipse Plus C18柱( 4.6×250 mm , 5 µm )对分离度和基线的影响,结果表明后者对7种成分的分离度较好且基线较平稳,故本试验选用色谱柱ZORBAX Eclipse PlusC18柱( 4.6×250 mm , 5 µm )。
4.3色谱条件方法优化:
色谱条件方法优化1:
色谱柱为ZORBAX Eclipse Plus C18柱(4.6×250 mm , 5 µm);流动相为甲醇(A) - 1%冰醋酸水溶液 (B),线性梯度洗脱,程序见表6;流速为1.0 ml/min;柱温为30℃;进样量为10 µl;检测波长为360 nm。HPLC图谱见图6。由图可知,各色谱峰之间不能有效分离,流动相选取需进一步优化。
表6 梯度洗脱程序
t/min | 甲醇A(%) | 1%冰醋酸B(%) |
0 | 11 | 89 |
20 | 39 | 61 |
37 | 56 | 44 |
40 | 11 | 89 |
色谱条件方法优化2:
色谱柱为ZORBAX Eclipse Plus C18柱(4.6×250 mm , 5 µm);流动相为乙腈(A) – 0.2%磷酸水溶液 (B),线性梯度洗脱,程序见表7;流速为1.0 ml/min;柱温为30℃;进样量为10 µl;检测波长为360 nm。HPLC图谱见图7。由图可知,大部分色谱峰之间可达到有效分离,流动相洗脱顺序还需进一步稍作优化。
表7 梯度洗脱程序
t/min | 乙腈A(%) | 0.2%磷酸水溶液B(%) |
0 | 11 | 89 |
15 | 13.5 | 86.5 |
30 | 18 | 82 |
40 | 18 | 82 |
65 | 49 | 51 |
70 | 11 | 89 |
色谱条件方法优化3:
色谱柱为ZORBAX Eclipse Plus C18柱(4.6×250 mm , 5 µm);流动相为乙腈(A) – 0.2%磷酸水溶液 (B),线性梯度洗脱,程序见表8;流速为1.0 ml/min;柱温为30℃;进样量为10 µl;检测波长为360 nm。HPLC图谱见图2。由图可知,各色谱峰之间可达到有效分离,分离度符合规定,流动相洗脱顺序确定。
表8 梯度洗脱程序
t/min | 乙腈A(%) | 0.2%磷酸水溶液B(%) |
0 | 11 | 89 |
15 | 13.5 | 86.5 |
30 | 18 | 82 |
32 | 19 | 81 |
40 | 19 | 81 |
65 | 49 | 51 |
70 | 11 | 89 |
本试验考察比较了甲醇-1%冰醋酸水溶液和乙腈-0.2%磷酸水溶液对有效成分分离度和基线的影响,结果发现,使用乙腈-0.2%磷酸水溶液为流动相,能达到较好的分离度且基线较平稳,故本试验采用乙腈-0.2%磷酸水溶液进行梯度洗脱,优选表8所示的梯度洗脱程序。
4.4 本试验考察了不同柱温、流速对分离度及基线是否平稳的影响。本试验考察的柱温为25℃,30℃和35℃,试验结果表明,柱温对其影响较小,故本试验柱温采用30℃;还考察了3种不同流速 0.8 ml/min、1.0 ml/min、1.2 ml/min 对分离度的影响,试验结果表明 1.0 ml/min 时分离度较好,基线也较平衡,故本试验采用的流速为1.0 ml/min。
Claims (3)
1.一种复方番石榴制剂中多种化学成分的含量测定方法,所述复方番石榴制剂由番石榴叶
120~180份、五指毛桃80~120份、党参30~70份、苍术50~100份、山楂50~100份、鬼箭羽50~100份、桑叶50~100份、黄连30~70份、干姜120~180份和红曲50~100份制成,其特征在于,包括以下步骤:
(1)确定的色谱条件:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以乙腈为流动相A,以0.2%磷酸水溶液为流动相B,流速为0.8-1.2 ml/min;柱温为25-35 ℃;进样量为10 μl;检测波长为360 nm;理论塔板数以金丝桃苷计算应不低于3000,以番石榴苷计算应不低于4000,以盐酸小檗碱计算应不低于3000;梯度洗脱程序如下:
(2)对照品溶液制备:精密称取金丝桃苷、异槲皮苷、瑞诺苷、萹蓄苷、番石榴苷、盐酸小檗碱、槲皮素对照品为溶质,加入甲醇制成七种单项对照品标准溶液,精密吸取七种单项对照品标准溶液混合后,加入适量甲醇稀释定容,制成混合对照品溶液;
(3)供试品溶液制备:按照处方量分别称取各组分,加水煎煮20-40 min,放冷,滤过,滤液浓缩至50 ml,精密吸取滤液10 ml至50 ml容量瓶中,用甲醇稀释定容,冷藏20-30 min,滤过,取续滤液,即得;
(4)测定法:分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μl,依上述色谱条件进行测定,按外标法计算即得。
2.根据权利要求1所述的一种复方番石榴制剂中多种化学成分的含量测定方法,其特征在于,步骤(1)中,色谱柱为ZORBAX Eclipse Plus C18柱,4.6×250 mm ,5 µm 。
3.根据权利要求1所述的一种复方番石榴制剂中多种化学成分的含量测定方法,其特征在于,步骤(1)中,流速为1.0ml/min;柱温为30 ℃。
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