CN115267005B - 一种开心散中多指标成分含量的检测方法 - Google Patents
一种开心散中多指标成分含量的检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种开心散中多指标成分含量的检测方法，包括：将开心散加入溶剂溶解后超声提取、摇匀、过滤，取续滤液获得的供试品溶液采用超高效液相色谱法进行检测，确定供试品溶液中5种指标成分：远志口山酮Ⅲ、3,6’‑二芥子酰基蔗糖、人参皂苷Rg1、茯苓酸、去氢茯苓酸的含量。本发明提供的一种开心散中多指标成分含量的检测方法，精密度、重现性、稳定性良好，结果准确、可靠，可真实反映开心散中多种指标成分的质量差异，完善药物制剂的质量控制体系。
Description
技术领域
本发明属于中药成分检测的技术领域，涉及一种开心散中多指标成分含量的检测方法，具体涉及一种开心散中5种主要活性成分：远志口山酮Ⅲ、3,6’-二芥子酰基蔗糖、人参皂苷Rg1、茯苓酸、去氢茯苓酸的UHPLC检测方法。
背景技术
药物制剂首载于唐·孙思邈的《备急千金要方》：“主好忘方，远志、人参(各四分)、茯苓(二两)、菖蒲(一两)，上四味治下筛，饮服方寸匕，日三。”用于心气不足、神志不宁、焦虑失眠、抑郁怔忡等中医情志性疾病，类似于西医的抑郁症，是中医益智养心、安神定志的基本方剂。药物制剂现代临床常用于治疗抑郁症、焦虑症、痴呆症，其临床表现多为神志不宁、精神恍惚、焦虑不安、健忘失眠、惊悸怔忡等症。
开心散为棕黄色粉末，通过文献及专利查阅，与开心散成分测定的相关专利，其中涉及有效成分测定的专利为《一种开心散的质量标志物群》(CN114460245A)，以上专利是以西伯利亚远志糖A5、西伯利亚远志糖A6、远志口山酮Ⅲ、3,6’-二芥子酰基蔗糖、细叶远志苷A、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、β-细辛醚、α-细辛醚为质量标志物群，但未涉及其成分的定量方法。另有文献《经典名方开心散的基准样品关键质量属性研究》(尚炳娴,赵振霞,曾琪,苏建,徐冰,刘永利,雷海民.经典名方开心散的基准样品关键质量属性研究[J/OL].中国中药杂志:1-10[2022-07-25].)中采用高效液相色谱法对西伯利亚远志糖A5、西伯利亚远志糖A6、远志口山酮Ⅲ、3,6’-二芥子酰基蔗糖、人参皂苷Rb1、β-细辛醚、α-细辛脑进行定量分析。
但是，现有方法针对开心散进行检测选用的成分代表性不足。因此，研究出一种开心散中多指标成分含量的检测方法，对开心散的质量控制具有非常重要的意义。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种开心散中多指标成分含量的检测方法，用于解决现有技术中缺乏对开心散的质量进行有效控制的问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种开心散中多指标成分含量的检测方法，包括：将开心散加入溶剂溶解后超声提取、摇匀、过滤，取续滤液获得的供试品溶液采用超高效液相色谱法(UHPLC)进行检测，确定供试品溶液中5种指标成分：远志口山酮Ⅲ、3,6’-二芥子酰基蔗糖、人参皂苷Rg1、茯苓酸、去氢茯苓酸的含量。
较佳地，所述远志口山酮Ⅲ的CAS号为162857-78-5，所述3,6’-二芥子酰基蔗糖的CAS号为139891-98-8，所述人参皂苷Rg1的CAS号为22427-39-0，所述茯苓酸的CAS号为29070-92-6，所述去氢茯苓酸的CAS号为77012-31-8。
由于开心散由人参、远志、石菖蒲、茯苓4味中药组成。人参中主要活性成分是人参皂苷，人参皂苷Rg1合适作为衡量人参皂苷的标准。远志作为传统的益智药，远志的化学成分主要有三萜皂苷类、酮类、寡糖脂类及生物碱类等。其中的3,6’-二芥子酰基蔗糖是开心散含药血清中抗抑郁的有效成分。远志口山酮Ⅲ、3,6'-二芥子酰基蔗糖，分别代表了远志的酮类、寡糖脂类。茯苓中主要含有茯苓多糖、三萜酸类、树胶、蛋白质、甾醇和脂肪酸等，茯苓酸和去氢茯苓酸为茯苓中的代表性成分。故本发明中远志口山酮Ⅲ、3,6’-二芥子酰基蔗糖、人参皂苷Rg1、茯苓酸、去氢茯苓酸可作为开心散的指标成分。
较佳地，所述溶剂选自甲醇、70％甲醇、乙醇或70％乙醇中的一种或多种组合。优选地，所述溶剂为甲醇。
上述70％甲醇为体积百分比为70％(v/v)的甲醇水溶液。上述70％乙醇为体积百分比为70％(v/v)的乙醇水溶液。
较佳地，所述开心散加入的质量g与溶剂加入的体积mL之比为1～5:30，优选为1～4:25，更优选为3:25。
较佳地，所述超声提取的时间为10～50分钟，优选为15～45分钟，更优选为15分钟。
较佳地，所述超声提取的功率为300～400W，优选为350W；所述超声提取的频率为50～55kHz，优选为53kHz。
较佳地，所述超声提取后要进去冷却。所述冷却至室温，所述室温为20-30℃。
较佳地，所述过滤为取上清液过滤膜，放弃初滤液后，取续滤液。
优选地，所述滤膜为0.22μm滤膜。
较佳地，所述采用超高效液相色谱法(UHPLC)进行检测，包括以下步骤：
1)配制对照品溶液：将远志口山酮Ⅲ、3,6’-二芥子酰基蔗糖、人参皂苷Rg1、茯苓酸、去氢茯苓酸的对照品，加入溶剂溶解并定容，配成对照品溶液；
2)样品检测：采用超高效液相色谱法(UHPLC)分别检测供试品溶液和步骤1)中的对照品溶液，比较保留时间进行定性，采用外标法进行定量，确定供试品溶液中远志口山酮Ⅲ、3,6’-二芥子酰基蔗糖、人参皂苷Rg1、茯苓酸、去氢茯苓酸的含量。
优选地，步骤1)中，所述对照品溶液中远志口山酮Ⅲ的含量范围为0.0013～0.04mg/mL，3,6’-二芥子酰基蔗糖的含量范围为0.01～0.6mg/mL，人参皂苷Rg1的含量范围为0.006～0.2mg/mL、茯苓酸的含量范围为0.003～0.09mg/mL、去氢茯苓酸的含量范围为0.001～0.04mg/mL。
优选地，步骤1)中，所述溶剂选自甲醇、70％甲醇、乙醇或70％乙醇中的一种或多种组合。更优选地，所述溶剂为甲醇。
优选地，步骤1)中，所述对照品溶液采用逐级稀释制得。
优选地，步骤2)中，所述超高效液相色谱法(UHPLC)中，检测器为二极管阵列检测器(DAD)。
优选地，步骤2)中，所述超高效液相色谱法中的色谱柱为C18色谱柱。
更优选地，所述超高效液相色谱法中的色谱柱为ACQUITY UPLC CSH C18色谱柱(柱长为100mm，内径为2.1mm，填料粒径为1.7μm)，色谱柱中的填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶。
优选地，步骤2)中，所述超高效液相色谱法采用多波长检测，所述多波长检测的波长范围为202～321nm。所述多波长检测是指，对样品中的不同成分采用不同波长进行检测。
更优选地，所述多波长检测的波长分别为202～204nm、209～211nm、241～243nm、319～321nm。
进一步优选地，所述多波长检测的波长分别为203nm、210nm、242nm、320nm。
更进一步优选地，当多波长检测的波长为202～204、优选为203nm时，可检测人参皂苷Rg1；当多波长检测的波长为209～211、优选为210nm时，可检测茯苓酸；当多波长检测的波长为241～243、优选为242nm时，可检测去氢茯苓酸；当多波长检测的波长为319～321、优选为320nm时，可检测远志口山酮Ⅲ和3,6’-二芥子酰基蔗糖。
优选地，步骤2)中，所述超高效液相色谱法中柱温为28～40℃。更优选地，所述超高效液相色谱法中柱温为28～35℃，优选为30℃。
优选地，步骤2)中，所述超高效液相色谱法中的流速为0.1～0.5mL/min。更优选地，所述超高效液相色谱法中的流速为0.3mL/min。
优选地，步骤2)中，所述超高效液相色谱法中的进样量为1～5μL。更优选地，所述超高效液相色谱法中的进样量为3μL。
优选地，步骤2)中，所述超高效液相色谱法中，流动相为乙腈-0.05～0.15％磷酸水溶液，其中，A相为乙腈，B相为0.05～0.15％磷酸水溶液；分析时间为60min；梯度洗脱。更优选地，所述超高效液相色谱法中，流动相为乙腈-0.10％磷酸水溶液，其中，A相为乙腈，B相为0.10％磷酸水溶液；分析时间为60min；梯度洗脱。
上述0.05～0.15％磷酸水溶液为体积百分数为0.05～0.15％的磷酸水溶液。上述0.10％磷酸水溶液为体积百分数为0.10的磷酸水溶液。
更优选地，所述梯度洗脱的具体程序为：
0～5min，A相：B相体积比为10：90-14：86；
5～12min，A相：B相体积比为14：86-17：83；
12～17min，A相：B相体积比为17：83-19：81；
17～22min，A相：B相体积比为19：81-21：79；
22～29min，A相：B相体积比为21：79-24：76；
29～34min，A相：B相体积比为24：76-36：64；
34～38min，A相：B相体积比为36：64-38：62；
38～42min，A相：B相体积比为38：62-42：58；
42～47min，A相：B相体积比为42：58-60：40；
47～51min，A相：B相体积比为60：40-70：30；
51～57min，A相：B相体积比为70：30-73：27；
57～60min，A相：B相体积比为73：27-95：5。
优选地，步骤2)中，所述外标法包括以下步骤：
A)按步骤1)制备一系列不同浓度的对照品溶液，分别进行UHPLC检测，获得远志口山酮Ⅲ、3,6’-二芥子酰基蔗糖、人参皂苷Rg1、茯苓酸、去氢茯苓酸的色谱峰面积与对应远志口山酮Ⅲ、3,6’-二芥子酰基蔗糖、人参皂苷Rg1、茯苓酸、去氢茯苓酸的含量之间线性关系，绘制相应的标准工作曲线，分别计算得到远志口山酮Ⅲ、3,6’-二芥子酰基蔗糖、人参皂苷Rg1、茯苓酸、去氢茯苓酸的标准工作曲线的回归方程；
B)将供试品溶液进行UHPLC检测，将获得的远志口山酮Ⅲ、3,6’-二芥子酰基蔗糖、人参皂苷Rg1、茯苓酸、去氢茯苓酸的色谱峰面积，代入步骤A)中相应的远志口山酮Ⅲ、3,6’-二芥子酰基蔗糖、人参皂苷Rg1、茯苓酸、去氢茯苓酸的标准工作曲线的回归方程，计算得到供试品溶液中远志口山酮Ⅲ、3,6’-二芥子酰基蔗糖、人参皂苷Rg1、茯苓酸、去氢茯苓酸的含量。
更优选地，所述标准工作曲线中，以远志口山酮Ⅲ、3,6’-二芥子酰基蔗糖、人参皂苷Rg1、茯苓酸、去氢茯苓酸的色谱峰面积为纵坐标(Y轴)，其相应远志口山酮Ⅲ、3,6’-二芥子酰基蔗糖、人参皂苷Rg1、茯苓酸、去氢茯苓酸的浓度为横坐标(X轴)。
本发明第二方面提供一种开心散中多指标成分含量的检测方法在开心散的质量检测中的用途。
如上所述，本发明提供的一种开心散中多指标成分含量的检测方法，采用优化条件的前处理和仪器检测方法，对药物制剂中主要活性成分：远志口山酮Ⅲ、3,6’-二芥子酰基蔗糖、人参皂苷Rg1、茯苓酸、去氢茯苓酸进行准确的定量定性检测。该种方法的精密度、重现性、稳定性良好，结果准确、可靠，可真实反映药物制剂中多种主要活性成分的质量差异，确保批次间生产工艺与质量的稳定性，全面完善药物制剂的质量控制体系。
本发明提供的一种开心散中多指标成分含量的检测方法，相较于现有方法，可以在同一次分析中将开心散中的5种指标成分同时进行定性及定量的测定，其具有提高分析效率、降低人力物力等成本的优势。特别是，本发明采用超高效液相色谱(Ultra HighPerformance Liquid Chromatography，UHPLC)技术，与传统的HPLC相比，UHPLC的速度、灵敏度及分离度分别是HPLC的9倍、3倍及1.7倍，它缩短了分析时间，同时减少了溶剂用量降低了分析成本。
附图说明
图1显示为本发明的实施例2中开心散中人参专属性色谱图。
图2显示为本发明的实施例2中开心散中远志专属性色谱图。
图3显示为本发明的实施例2中开心散中茯苓专属性色谱图。
图4显示为本发明的实施例3中开心散中远志口山酮Ⅲ的浓度-峰面积曲线图。
图5显示为本发明的实施例3中开心散中3,6’-二芥子酰基蔗糖的浓度-峰面积曲线图。
图6显示为本发明的实施例3中开心散中人参皂苷Rg1的浓度-峰面积曲线图。
图7显示为本发明的实施例3中开心散中茯苓酸的浓度-峰面积曲线图。
图8显示为本发明的实施例3中开心散中去氢茯苓酸的浓度-峰面积曲线图。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐述本发明，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
以下实施例使用的试剂和仪器如下：
1、试剂
开心散(批号S210301R102，上海和黄药业有限公司制备)；乙腈(批号为JA089830，默克股份两合公司)；磷酸(色谱纯，上海安谱实验科技股份有限公司)；超纯水(纯水仪制备)；其余试剂(分析纯，国药)。
对照品的信息见表1。
表1
2、仪器
Agilent 1290超高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；ME204E/02型电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)；XSR205DU型电子天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)；SK7200H超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司)。
实施例1
1、供试品溶液的制备
取开心散样品3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25mL密封，超声提取(350w，53kHz)15分钟，摇匀，取上清液过0.22μm滤膜，取续滤液，即得供试品溶液1#。
2、对照品溶液的制备
取远志口山酮Ⅲ、3,6’-二芥子酰基蔗糖、人参皂苷Rg1、茯苓酸、去氢茯苓酸的对照品，精密称定，加甲醇溶解并定容，配成一系列不同浓度的对照品溶液。一系列不同浓度的对照品溶液中，远志口山酮Ⅲ的浓度范围为0.0013～0.04mg/mL，3,6’-二芥子酰基蔗糖的浓度范围为0.01～0.6mg/mL，人参皂苷Rg1的浓度范围为0.006～0.2mg/mL、茯苓酸的浓度范围为0.003～0.09mg/mL、去氢茯苓酸的浓度范围为0.001～0.04mg/mL。
3、测定
采用超高效液相色谱法(UHPLC)分别检测供试品溶液1#和一系列不同浓度的对照品溶液，比较保留时间进行定性，采用外标法进行定量。即将一系列不同浓度的对照品溶液分别进行UHPLC检测，获得远志口山酮Ⅲ、3,6’-二芥子酰基蔗糖、人参皂苷Rg1、茯苓酸、去氢茯苓酸的色谱峰面积与对应远志口山酮Ⅲ、3,6’-二芥子酰基蔗糖、人参皂苷Rg1、茯苓酸、去氢茯苓酸的浓度之间线性关系，绘制相应的标准工作曲线，分别计算得到远志口山酮Ⅲ、3,6’-二芥子酰基蔗糖、人参皂苷Rg1、茯苓酸、去氢茯苓酸的标准工作曲线的回归方程。再将供试品溶液1#进行UHPLC检测，将获得的远志口山酮Ⅲ、3,6’-二芥子酰基蔗糖、人参皂苷Rg1、茯苓酸、去氢茯苓酸的色谱峰面积，代入相应的远志口山酮Ⅲ、3,6’-二芥子酰基蔗糖、人参皂苷Rg1、茯苓酸、去氢茯苓酸的标准工作曲线的回归方程，计算得到供试品溶液1#中远志口山酮Ⅲ、3,6’-二芥子酰基蔗糖、人参皂苷Rg1、茯苓酸、去氢茯苓酸的浓度。
其中，超高效液相色谱法包括以下检测条件：
检测器为二极管阵列检测器(DAD)；色谱柱为ACQUITY UPLC CSH C18色谱柱(柱长为100mm，内径为2.1mm，填料粒径为1.7μm)，色谱柱中的填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶；采用多波长检测，多波长检测的波长分别为203nm、210nm、242nm、320nm；柱温为30℃；流速为0.3mL/min；进样量为3μL；流动相为乙腈-0.10％磷酸水溶液，其中，A相为乙腈，B相为0.10％磷酸水溶液；分析时间为60min；梯度洗脱。
梯度洗脱的具体程序为：
0～5min，A相：B相体积比为10：90-14：86；
5～12min，A相：B相体积比为14：86-17：83；
12～17min，A相：B相体积比为17：83-19：81；
17～22min，A相：B相体积比为19：81-21：79；
22～29min，A相：B相体积比为21：79-24：76；
29～34min，A相：B相体积比为24：76-36：64；
34～38min，A相：B相体积比为36：64-38：62；
38～42min，A相：B相体积比为38：62-42：58；
42～47min，A相：B相体积比为42：58-60：40；
47～51min，A相：B相体积比为60：40-70：30；
51～57min，A相：B相体积比为70：30-73：27；
57～60min，A相：B相体积比为73：27-95：5。
实施例2
1、供试品溶液的制备
取开心散样品3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入乙醇20mL密封，超声提取(350w，53kHz)20分钟，摇匀，取上清液过0.22μm滤膜，取续滤液，即得供试品溶液2#。
2、对照品溶液的制备
取远志口山酮Ⅲ、3,6’-二芥子酰基蔗糖、人参皂苷Rg1、茯苓酸、去氢茯苓酸的对照品，精密称定，加乙醇溶解并定容，配成一系列不同浓度的对照品溶液。一系列不同浓度的对照品溶液中，远志口山酮Ⅲ、3,6’-二芥子酰基蔗糖、人参皂苷Rg1、茯苓酸、去氢茯苓酸的浓度范围同实施例1中步骤2。
3、测定
采用超高效液相色谱法(UHPLC)分别检测供试品溶液2#和一系列不同浓度的对照品溶液，比较保留时间进行定性，采用外标法进行定量，得到供试品溶液2#中远志口山酮Ⅲ、3,6’-二芥子酰基蔗糖、人参皂苷Rg1、茯苓酸、去氢茯苓酸的浓度。具体定量过程同实施例1中步骤3。
其中，超高效液相色谱法包括以下检测条件：
检测器为二极管阵列检测器(DAD)；色谱柱为ACQUITY UPLC CSH C18色谱柱(柱长为100mm，内径为2.1mm，填料粒径为1.7μm)，色谱柱中的填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶；采用多波长检测，多波长检测的波长分别为202nm、209nm、241nm、319nm；柱温为35℃；流速为0.2mL/min；进样量为2μL；流动相为乙腈-0.15％磷酸水溶液，其中，A相为乙腈，B相为0.15％磷酸水溶液；分析时间为60min；梯度洗脱。
梯度洗脱的具体程序同实施例1中步骤3。
实施例3
1、供试品溶液的制备
取开心散样品3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇15mL密封，超声提取(350w，53kHz)30分钟，摇匀，取上清液过0.22μm滤膜，取续滤液，即得供试品溶液3#。
2、对照品溶液的制备
取远志口山酮Ⅲ、3,6’-二芥子酰基蔗糖、人参皂苷Rg1、茯苓酸、去氢茯苓酸的对照品，精密称定，加70％甲醇溶解并定容，配成一系列不同浓度的对照品溶液。一系列不同浓度的对照品溶液中，远志口山酮Ⅲ、3,6’-二芥子酰基蔗糖、人参皂苷Rg1、茯苓酸、去氢茯苓酸的浓度范围同实施例1中步骤2。
3、测定
采用超高效液相色谱法(UHPLC)分别检测供试品溶液3#和一系列不同浓度的对照品溶液，比较保留时间进行定性，采用外标法进行定量，得到供试品溶液3#中远志口山酮Ⅲ、3,6’-二芥子酰基蔗糖、人参皂苷Rg1、茯苓酸、去氢茯苓酸的浓度。具体定量过程同实施例1中步骤3。
其中，超高效液相色谱法包括以下检测条件：
检测器为二极管阵列检测器(DAD)；色谱柱为ACQUITY UPLC CSH C18色谱柱(柱长为100mm，内径为2.1mm，填料粒径为1.7μm)，色谱柱中的填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶；采用多波长检测，多波长检测的波长分别为204nm、211nm、243nm、321nm；柱温为28℃；流速为0.4mL/min；进样量为4μL；流动相为乙腈-0.05％磷酸水溶液，其中，A相为乙腈，B相为0.05％磷酸水溶液；分析时间为60min；梯度洗脱。
梯度洗脱的具体程序同实施例1中步骤3。
实施例4
取批号S210301R102的开心散样品，采用实施例1中步骤1配制供试品溶液。同时，分别取除去人参、远志、茯苓的开心散阴性样品，采用实施例1中步骤1配制阴性供试品溶液。另外，按实施例1中的步骤2中配制对照品溶液，对照品溶液中，远志口山酮Ⅲ浓度为10.945μg/mL、3,6’-二芥子酰基蔗糖浓度为13.93μg/mL、人参皂苷Rg1浓度为51.325μg/mL、茯苓酸浓度为21.768μg/mL、去氢茯苓酸浓度为9.616μg/mL。
将上述供试品溶液、阴性供试品溶液、对照品溶液分别按实施例1中步骤3进行测定，比较保留时间进行定性，具体测试结果见图1、2、3。由图1、2、3可知，阴性样品对供试品无干扰，专属性良好。
实施例5
对本发明的开心散样品中远志口山酮Ⅲ、3,6’-二芥子酰基蔗糖、人参皂苷Rg1、茯苓酸、去氢茯苓酸的检测方法进行方法学验证，其性能指标结果如下。
1、检测方法的线性关系
精密称取远志口山酮Ⅲ、3,6’-二芥子酰基蔗糖、人参皂苷Rg1、茯苓酸、去氢茯苓酸的对照品适量，按实施例1中步骤2加入甲醇配成一系列不同浓度的对照品溶液。按实施例1中步骤3的色谱条件，精密吸取3μL对照品溶液注入超高效液相色谱仪，以对照品浓度为纵坐标，以各指标成分的峰面积为横坐标，绘制标准曲线，具体曲线图见图4-8，标准曲线的具体数据见表2。同时，计算获得远志口山酮Ⅲ、3,6’-二芥子酰基蔗糖、人参皂苷Rg1、茯苓酸、去氢茯苓酸的标准回归方程、相关系数和线性范围，具体结果见表3。
根据图4-8、表1-2可知，5个指标成分在各自进样质量浓度范围内线性关系良好，说明本发明方法线性范围广，准确度高。
表2五个指标成分的标准曲线数据
表3
2、稳定性
取批号S210301R102的开心散样品，按实施例1中步骤1制备获得供试品溶液，按实施例1中步骤3的色谱条件，分别在0h、2h、4h、6h、8h、12h、24h进样分析，具体结果见表4。结果表明，远志口山酮Ⅲ、3,6’-二芥子酰基蔗糖、人参皂苷Rg1、茯苓酸、去氢茯苓酸的色谱峰面积在24h内的RSD均小于3％，表明供试品溶液在24h内检测对结果无影响，稳定性良好。
表4
3、精密度
3.1仪器精密度
取远志口山酮Ⅲ、3,6’-二芥子酰基蔗糖、人参皂苷Rg1、茯苓酸、去氢茯苓酸的对照品适量，精密称定，按实施例1中步骤2加入甲醇配制成一定浓度的对照品溶液，按实施例1中步骤3的色谱条件，分别连续进样分析6次，具体结果见表5。结果表明，5个指标成分连续6次进样的峰面积RSD均小于2％，表明仪器精密度良好。
表5
3.2重复性
取批号S210301R102的开心散样品，按实施例1中步骤1平行制备获得6份供试品溶液，按实施例1中步骤3的色谱条件，每份供试品溶液测定2次，重复性具体结果见表6。结果表明，5个指标成分的含量RSD均小于4％，均符合2020年版《中国药典》的要求，表明方法重复性良好。
表6重复性实验测定结果(n＝2，mg/g)
3.3中间精密度
由不同实验员取同一批的批号S210301R102的开心散样品，采用实施例1中的步骤1中各配制3份供试品溶液，按照实施例1中步骤3的色谱条件，分别在同一台UHPLC进样分析，结果见表7。结果表明，不同实验员采用同一台仪器测得的开心散中5个指标成分含量的RSD均小于3％，表明中间精密度良好。
表7中间精密度结果(n＝2，mg/g)
4、加标回收率
精密称取9份已知浓度的开心散样品(批号S210301R102)1.5g，分别按含量的50％、100％、150％三个水平加入五个指标成分的混合对照品溶液，每个水平平行3份。按实施例1中步骤1制备获得供试品溶液，并按实施例1中步骤3的色谱条件，分别进样分析，结果见表8。由表8可知，5个指标成分的加样回收率均符合2020年版《中国药典》(四部)规定的回收率限度，表明该测定方法准确度较好。
表8
实施例6
取批号S210301R102的开心散样品，采用实施例1中步骤1中配制供试品溶液，按照实施例1中步骤3的色谱条件比较同一型号ACQUITY UPLC CSH C18(2.1mm×100mm，1.7μm)的3个不同批次色谱柱对开心散样品中5个指标成分含量变化的影响，结果见表9。由结果可知，同一型号ACQUITY UPLC CSH C18(2.1mm×100mm，1.7μm)的3个不同批次色谱柱测得的开心散样品中5个指标成分含量的RSD均小于5％，表明该型号色谱柱适用于样品中5个指标成分的含量测定。
表9同一型号不同批次色谱柱的考察结果(n＝2，mg/g)
综上所述，本发明提供的一种开心散中多指标成分含量的检测方法，精密度、重现性、稳定性良好，结果准确、可靠，可真实反映开心散中多种指标成分的质量差异，完善药物制剂的质量控制体系。所以，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Claims (6)
1.一种开心散中多指标成分含量的检测方法，包括：将开心散加入溶剂溶解后超声提取、摇匀、过滤，取续滤液获得的供试品溶液采用超高效液相色谱法进行检测，确定供试品溶液中5种指标成分：远志口山酮Ⅲ、3,6’-二芥子酰基蔗糖、人参皂苷Rg1、茯苓酸、去氢茯苓酸的含量；
所述采用超高效液相色谱法进行检测，包括以下步骤：
1)配制对照品溶液：将远志口山酮Ⅲ、3,6’-二芥子酰基蔗糖、人参皂苷Rg1、茯苓酸、去氢茯苓酸的对照品，加入溶剂溶解并定容，配成对照品溶液；
2)样品检测：采用超高效液相色谱法分别检测供试品溶液和步骤1)中的对照品溶液，比较保留时间进行定性，采用外标法进行定量，确定供试品溶液中远志口山酮Ⅲ、3,6’-二芥子酰基蔗糖、人参皂苷Rg1、茯苓酸、去氢茯苓酸的含量；
步骤2)中，所述超高效液相色谱法的检测条件为：检测器为二极管阵列检测器；色谱柱为C18色谱柱；采用多波长检测，所述多波长检测的波长范围为202～321nm；流动相为乙腈-0.05～0.15％磷酸水溶液，其中，A相为乙腈，B相为0.05～0.15％磷酸水溶液；分析时间为60min；梯度洗脱；
所述多波长检测的波长分别为202～204nm、209～211nm、241～243nm、319～321nm；
所述梯度洗脱的具体程序为：
0～5min，A相：B相体积比为10：90-14：86；
5～12min，A相：B相体积比为14：86-17：83；
12～17min，A相：B相体积比为17：83-19：81；
17～22min，A相：B相体积比为19：81-21：79；
22～29min，A相：B相体积比为21：79-24：76；
29～34min，A相：B相体积比为24：76-36：64；
34～38min，A相：B相体积比为36：64-38：62；
38～42min，A相：B相体积比为38：62-42：58；
42～47min，A相：B相体积比为42：58-60：40；
47～51min，A相：B相体积比为60：40-70：30；
51～57min，A相：B相体积比为70：30-73：27；
57～60min，A相：B相体积比为73：27-95：5。
2.根据权利要求1所述的一种开心散中多指标成分含量的检测方法，其特征在于，包括以下条件中任一项或多项：
A1)所述溶剂选自甲醇、70％甲醇、乙醇或70％乙醇中的一种或多种组合；
A2)所述开心散加入的质量与溶剂加入的体积之比为1～5:30，g/mL；
A3)所述超声提取的时间为10～50分钟；
A4)所述超声提取后要进去冷却。
3.根据权利要求1所述的一种开心散中多指标成分含量的检测方法，其特征在于，步骤1)中，所述对照品溶液中远志口山酮Ⅲ的含量范围为0.0013～0.04mg/mL，3,6’-二芥子酰基蔗糖的含量范围为0.01～0.6mg/mL，人参皂苷Rg1的含量范围为0.006～0.2mg/mL、茯苓酸的含量范围为0.003～0.09mg/mL、去氢茯苓酸的含量范围为0.001～0.04mg/mL。
4.根据权利要求1所述的一种开心散中多指标成分含量的检测方法，其特征在于，步骤1)中，所述溶剂选自甲醇、70％甲醇、乙醇或70％乙醇中的一种或多种组合。
5.根据权利要求1所述的一种开心散中多指标成分含量的检测方法，其特征在于，步骤2)中，所述超高效液相色谱法的检测条件还包括有：所述超高效液相色谱法中柱温为28～40℃；和/或，所述超高效液相色谱法中的流速为0.1～0.5mL/min；和/或，所述超高效液相色谱法中的进样量为1～5μL。
6.根据权利要求1-5任一所述的一种开心散中多指标成分含量的检测方法在开心散的质量检测中的用途。
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