CN117007733B - 一种青蒿膏中五种成分的高效液相色谱测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及天然药物提取物分析技术领域，具体涉及一种青蒿膏中五种成分的高效液相色谱测定方法。所述五种成分包括：左旋樟脑、脱氧青蒿素、二氢表去氧青蒿素B、二氢青蒿酸和青蒿酸，所述高效液相色谱的检测条件包括：流动相：流动相A为乙腈，流动相B为0.1%磷酸水溶液；洗脱方式：梯度洗脱。本发明具有快速、准确、操作简便的优点。
Description
技术领域
本发明涉及天然药物提取物分析技术领域，具体涉及一种青蒿膏中五种成分的高效液相色谱测定方法。
背景技术
青蒿素是一种用于治疗疟疾的天然药物，也是合成抗疟药双氢青蒿素、蒿甲醚、青蒿琥酯的原料。从植物黄花蒿中提取是生产青蒿素的主要途径，在生产过程中会产生大量几乎不含青蒿素的青蒿膏，这些青蒿膏大多被废弃造成资源浪费。青蒿膏及其中的一些成分具有抗菌、抗病毒、抗炎镇痛等生物活性，可在深度加工后用于医药、化妆品、农林业等领域。
青蒿膏中的成分主要为单萜、倍半萜、长链脂肪醇等类型，其中已知的倍半萜类成分均与青蒿素拥有相同的结构母核，包括二氢表去氧青蒿素B、青蒿素I、脱氧青蒿素、二氢青蒿酸、青蒿酸等成分。快速准确地检测青蒿膏及其后续加工的产品中主要成分的含量，是青蒿膏开发生产质量控制过程中的关键环节。
对于青蒿膏中的几种含量较高的活性成分的检测方法一般采用气相色谱法和高效液相色谱法，气相色谱法分析受样品中成分的沸点、热稳定性等因素影响，不容易准确定量，限制了该方法的应用。而高效液相色谱法在分析多种青蒿膏中的成分方面，具有较高的灵敏性和稳定性。
中国发明专利申请CN103353498A公开了一种青蒿素浸膏中青蒿素含量检测的高效液相色谱方法，流动相：乙腈∶水(6∶4，体积比)；流速：1.0mL/min；溶剂用甲醇溶解；色谱柱：C18(4.6×250mm5μm)；柱温：30℃，进样量：20μL；紫外检测器；检测波长：210nm。青蒿素在进样量1-100μg内与峰面积呈良好线性关系，线性相关系数r＝1。本方法仅仅分析了样品中的青蒿素含量，很难同时用于分析样品中的其它组分的含量。
中国发明专利申请CN108362811A公开了一种青蒿中有效成分的检测方法。所述检测方法包括以下步骤：将样品破碎、过筛，然后进行超声萃取，接着用超高效液相色谱进行梯度洗脱，流动相A与流动相B按照体积比为90∶10-10∶90的混合溶液，所述流动相A为乙腈，所述流动相B为体积分数为0.1％的乙酸溶液，再用质谱法检出，用峰面积外标法定量检测。该方法能够同时检测青蒿药材中青蒿素、青蒿酸、青蒿乙素、双氢青蒿素、山柰酚、木犀草素和槲皮素的含量。本方法采用的是超高效液相色谱-质谱联用法（UPLC-MS）分析，需要采用相应的仪器才能实施该方法，并且没有进行左旋樟脑、脱氧青蒿素、二氢表去氧青蒿素B和二氢青蒿酸成分的测定。
因此，开发一种能解决上述技术问题的青蒿膏中五种成分的高效液相色谱测定方法是非常必要的。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足而提供一种快速、准确、操作简便的青蒿膏中五种成分，左旋樟脑、脱氧青蒿素、二氢表去氧青蒿素B、二氢青蒿酸和青蒿酸的高效液相色谱测定方法，将其运用于青蒿膏原料及其产品的检测，为青蒿膏产品的质量控制提供技术支持。
本发明是通过以下技术方案予以实现的：
一种青蒿膏中五种成分的高效液相色谱测定方法，所述五种成分包括：左旋樟脑、脱氧青蒿素、二氢表去氧青蒿素B、二氢青蒿酸和青蒿酸，所述高效液相色谱的检测条件包括：
流动相：流动相A为乙腈，流动相B为0.1%磷酸水溶液；
洗脱方式：梯度洗脱，洗脱程序为：0-6min，52%流动相A，48%流动相B；6-7min，52%-45%流动相A，48%-55%流动相B；7-22min，45%流动相A，55%流动相B；22-23min，45%-60%流动相A，55%-40%流动相B；23-33min，60%流动相A，40%流动相B；33-34min，60%-70%流动相A，40%-30%流动相B；34-43min，70%流动相A，30%流动相B；43-45min，70%-52%流动相A，30%-48%流动相B。
其中，二氢表去氧青蒿素B的结构式如下：
。
优选地，所述测定方法具体包括如下步骤：
（1）配制标准溶液和待测样品溶液；
（2）将标准溶液和待测样品溶液分别放入高效液相色谱仪中进行检测；
（3）计算五种成分的含量。
更优选地，配制标准溶液包括如下步骤：分别准确称取五种成分的标准品，用甲醇配制成不同梯度浓度的标准溶液。
更优选地，配制标准溶液包括如下步骤：分别准确称取五种成分的标准品10 mg，置于10 mL容量瓶中，用色谱纯甲醇定容，配制成浓度为1 mg/mL的甲醇溶液，再用色谱纯甲醇稀释配制成浓度梯度为0.5 mg/mL、0.25 mg/mL、0.125 mg/mL、0.0625 mg/mL的标准溶液。
更优选地，待测样品溶液的配制工艺包括如下步骤：将待测样品加入甲醇中，超声溶解后过滤，滤液即为待测样品溶液。
更优选地，待测样品溶液的浓度为12.5-250g/mL；超声的时间为5-15min；过滤采用的过滤膜尺寸为13 mm×0.22 μm。
更优选地，待测样品溶液的配制工艺包括如下步骤：称取样品准确称取0.1 g-2.0g，置于25 mL棕色容量瓶中，并加入色谱纯甲醇超声提取5-15min，静置沉淀20-60min，用色谱纯甲醇定容后取上层溶液过13 mm×0.22 μm滤膜，滤液即为待测样品溶液。
优选地，所述高效液相色谱的检测条件还包括：检测器为二极管阵列检测器。
优选地，所述高效液相色谱的检测条件还包括：色谱柱为Supersil ODS-B柱或其他柱效相等的色谱柱。
更优选地，所述Supersil ODS-B柱的规格为内径4.6 mm×长度250 mm，粒径5 μm。
优选地，所述高效液相色谱的检测条件还包括：柱温为常温。
优选地，所述高效液相色谱的检测条件还包括：流速为1.0mL/min，进样量为5-25μL。
优选地，所述高效液相色谱的检测条件还包括五种成分的检测波长：脱氧青蒿素为200nm或209nm，二氢表去氧青蒿素B为209nm，二氢青蒿酸和青蒿酸均为220nm，左旋樟脑为200nm或289nm。
优选地，步骤（3）中以标准储备溶液的出峰时间确定五种成分的保留时间，以标准溶液中5种成分的峰面积（A）对应的质量浓度（c）绘制标准曲线，得到线性回归方程，以确定样品中5种成分的含量。
本发明的有益效果是：
1、本发明的方法可对青蒿膏中的五种成分同时进行检测，且前处理操作方法较为简单，有利于缩短检测周期。
2、本发明的方法还可以对以青蒿膏为原料加工的产品进行检测，本发明的方法对于黄花蒿药材的分析检测也具有一定的参考价值，适用范围广。
附图说明
图1为实施例1青蒿膏中五种不同成分在200 nm下的高效液相色谱图。
图2为实施例1青蒿膏中五种不同成分在209 nm下的高效液相色谱图。
图3为实施例1青蒿膏中五种不同成分在220 nm下的高效液相色谱图。
图4为对比例1青蒿膏中五种不同成分在200 nm下的高效液相色谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1
五种成分标准品的测定及青蒿膏中五种成分的测定
1. 试剂和材料
1.1 甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯）、磷酸（优级纯）、滤膜（13 mm×0.22 μm）、超纯水。
1.2 标准品：左旋樟脑、脱氧青蒿素、二氢表去氧青蒿素B、二氢青蒿酸、青蒿酸（纯度均≥98%）。
1.3 五种成分标准溶液的制备：分别准确称取五种成分的标准品10mg，置于10mL容量瓶中，用色谱纯甲醇定容，配制成浓度为1mg/mL的标准溶液。再用色谱纯甲醇将标准溶液配制成浓度梯度为0.0625 mg/mL，0.125 mg/mL，0.25 mg/mL，0.5 mg/mL，1mg/mL的标准溶液。
2. 仪器和设备
高效液相色谱仪，检测器为二极管阵列检测器、分析天平、高频数控超声波清洗器。
3. 高效液相色谱条件
3.1 色谱柱：依利特Supersil ODS-B柱，250 mm×4.6 mm, 5 μm；
3.2 流动相：流动相A为乙腈，流动相B为0.1%磷酸水溶液，梯度洗脱程序：0-6min，52%流动相A，48%流动相B；6-7min，52%-45%流动相A，48%-55%流动相B；7-22min，45%流动相A，55%流动相B；22-23min，45%-60%流动相A，55%-40%流动相B；23-33min，60%流动相A，40%流动相B；33-34min，60%-70%流动相A，40%-30%流动相B；34-43min，70%流动相A，30%流动相B；43-45min，70%-52%流动相A，30%-48%流动相B；
3.3 流速：1.0mL/min；
3.4 柱温：常温；
3.5 进样量：20 μL；
3.6 检测波长：左旋樟脑和脱氧青蒿素为200nm；二氢表去氧青蒿素B为209nm；二氢青蒿酸和青蒿酸为220nm。
4.标准溶液的检测
在上述色谱条件下对制备的五种成分不同浓度的标准溶液进行检测，确定各成分的出峰时间，以保留时间定性；同时以五种成分不同浓度标准溶液的峰面积（A）对应的质量浓度（c, mg/mL）分别绘制标准曲线，得到线性回归方程，计算检出限（S/N=3）和定量限（S/N=10），结果如表1所示：
表1 青蒿膏中五种成分的线性方程表
5.青蒿膏样品检测
准确称取青蒿膏样品0.2525g，加入25mL色谱纯甲醇，超声提取15min，静置30min沉淀后，取上层溶液过滤膜，在上述色谱条件下进行测定，根据五种成分的保留时间确定该样品中含有左旋樟脑、脱氧青蒿素、二氢表去氧青蒿素B、二氢青蒿酸、青蒿酸，在不同检测波长（200 nm、209 nm、220 nm）下的检测结果分别见图1-图3。根据其峰面积分别计算其含量，结果见表2。
6.加样回收试验
取已测定5种成分含量的青蒿膏样品6份，每份约0.25g，精密称定，每份分别加入相同量的5种成分对照品，其余按上述方法操作，制备加样供试品溶液，按照上述的色谱条件条件测定，计算平均回收率及相对标准偏差RSD，结果见表2。由实验结果可知，该方法的准确度好。
表2 青蒿膏中五种成分的含量表
青蒿膏样品中各组分的加样回收试验的相对偏差为1.0%~2.3%，准确度好。
实施例2
青蒿精油中五种成分的测定
1.试剂和材料
甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯）、磷酸（优级纯）、滤膜（13 mm×0.22 μm）、超纯水。
2. 仪器和设备
高效液相色谱仪，检测器为二极管阵列检测器、分析天平、高频数控超声波清洗器。
3. 高效液相色谱条件
3.1 色谱柱：依利特Supersil ODS-B柱，250 mm×4.6 mm, 5 μm；
3.2 流动相：流动相A为乙腈，流动相B为0.1%磷酸水溶液，梯度洗脱程序：0-6min，52%流动相A，48%流动相B；6-7min，52%-45%流动相A，48%-55%流动相B；7-22min，45%流动相A，55%流动相B；22-23min，45%-60%流动相A，55%-40%流动相B；23-33min，60%流动相A，40%流动相B；33-34min，60%-70%流动相A，40%-30%流动相B；34-43min，70%流动相A，30%流动相B；43-45min，70%-52%流动相A，30%-48%流动相B；
3.3 流速：1.0mL/min；
3.4 柱温：常温；
3.5 进样量：20 μL；
3.6 检测波长：左旋樟脑和脱氧青蒿素为200nm；二氢表去氧青蒿素B为209nm；二氢青蒿酸和青蒿酸为220nm。
4.样品测定
一种由青蒿膏加工得到的青蒿精油，准确称取青蒿精油样品0.2550g，超声提取15min，静置30min沉淀后，取上层溶液过滤膜，在上述色谱条件下进行测定，根据五种成分的保留时间确定该样品中含有左旋樟脑、脱氧青蒿素、二氢表去氧青蒿素B、二氢青蒿酸、青蒿酸。根据其峰面积分别计算其含量，结果如表3。
表3 青蒿精油中五种成分的含量表
对比例1
与实施例1的区别仅在于流动相洗脱程序不同，具体如下：流动相A为乙腈，流动相B为0.1%磷酸水溶液，流动相A：流动相B=65：35运行20min，检测波长为200nm，结果如图4所示，脱氧青蒿素的峰和左旋樟脑的峰与其它物质的峰重叠在一起无法分辨。
上述详细说明是针对本发明其中之一可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本发明技术方案的范围内。
Claims (7)
1.一种青蒿膏中五种成分的高效液相色谱测定方法，其特征在于，所述五种成分包括：左旋樟脑、脱氧青蒿素、二氢表去氧青蒿素B、二氢青蒿酸和青蒿酸，所述高效液相色谱的检测条件包括：
流动相：流动相A为乙腈，流动相B为0.1%磷酸水溶液；
洗脱方式：梯度洗脱，洗脱程序为：0-6min，52%流动相A，48%流动相B；6-7min，52%-45%流动相A，48%-55%流动相B；7-22min，45%流动相A，55%流动相B；22-23min，45%-60%流动相A，55%-40%流动相B；23-33min，60%流动相A，40%流动相B；33-34min，60%-70%流动相A，40%-30%流动相B；34-43min，70%流动相A，30%流动相B；43-45min，70%-52%流动相A，30%-48%流动相B；
五种成分的检测波长：脱氧青蒿素为200nm或209nm，二氢表去氧青蒿素B为209nm，二氢青蒿酸和青蒿酸均为220nm，左旋樟脑为200nm或289nm；
所述测定方法具体包括配制待测样品溶液，所述待测样品溶液的配制工艺包括如下步骤：将待测样品加入甲醇中，超声溶解后过滤，滤液即为待测样品溶液；
所述高效液相色谱的检测条件还包括：色谱柱为SupersilODS-B柱；所述SupersilODS-B柱的规格为内径4.6mm×长度250mm，粒径5μm。
2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述测定方法具体包括如下步骤：
（1）配制标准溶液和待测样品溶液；
（2）将标准溶液和待测样品溶液分别放入高效液相色谱仪中进行检测；
（3）计算五种成分的含量。
3.根据权利要求2所述的测定方法，其特征在于，配制标准溶液包括如下步骤：分别准确称取五种成分的标准品，用甲醇配制成不同梯度浓度的标准溶液。
4.根据权利要求1-3任一所述的测定方法，其特征在于，所述高效液相色谱的检测条件还包括：检测器为二极管阵列检测器。
5.根据权利要求1-3任一所述的测定方法，其特征在于，所述高效液相色谱的检测条件还包括：柱温为常温。
6.根据权利要求1-3任一所述的测定方法，其特征在于，所述高效液相色谱的检测条件还包括：流速为1.0mL/min，进样量为5-25μL。
7.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，待测样品溶液的浓度为12.5-250g/mL；超声的时间为5-15min；过滤采用的过滤膜尺寸为13mm×0.22μm。
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