CN113552274A - 一种青蒿素副产物高效液相指纹图谱的建立及含量测定方法 - Google Patents

一种青蒿素副产物高效液相指纹图谱的建立及含量测定方法 Download PDF

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Abstract

本发明具体公开了一种青蒿素副产物高效液相指纹图谱的建立及含量测定方法，其中指纹图谱的建立包括供试品溶液的制备和指纹图谱的建立，采用Waters Symmetry C18色谱柱，250×4.6mm，5μm；流动相A为乙腈，流动相B为0.2％磷酸；流速为1mL/min，检测波长为210nm；柱温为30℃；进样量为10μL。本发明建立了青蒿素副产物的高效液相指纹图谱方法，各共有峰分离度均较好，并以青蒿酸为对照，分别对青蒿素生产过程中2种副产物(AE和ARF)样品进行含量测定，建立青蒿素副产物的质量评价方法，为青蒿素副产物的合理开发利用提供了基础。

Description

一种青蒿素副产物高效液相指纹图谱的建立及含量测定方法
技术领域
本发明涉及药品检测技术领域，尤其涉及一种青蒿素副产物高效液相指纹图谱的建立及含量测定方法。
背景技术
疟疾是当今世界上最常见的寄生虫病之一，据世界卫生组织(World HealthOrganization, WHO)报告，在2019年全球大约有2.29亿例疟疾报告，目前以青蒿素为基础的联合疗法(artemisinin combination therapy,ACT)是WHO在疟疾流行国家推荐的一线治疗方法， 2010-2019年间，制造商在全球售出超过31亿个疗程的青蒿素联合疗法。一个疗程的ACT 花费在1.0至3.5美元之间，而生活在经济困难国家的人们仍然无法负担多个疗程的治疗费用，因此，降低青蒿素类抗疟药物的生产成本至关重要。
研究发现在黄花蒿体内青蒿酸的含量是其青蒿素含量的8-10倍，二氢青蒿酸的含量是青蒿素含量的2倍，在青蒿素的工业生产过程中，青蒿酸和二氢青蒿酸也被提取出来，而青蒿酸和二氢青蒿酸是已知的生物合成青蒿素的重要前体，是半合成青蒿素的潜在原料。目前工业上提取青蒿素主要采用溶剂提取重结晶法，青蒿素生产流程如附图16，以汽油作为溶剂，提取工艺为汽油提取-硅胶过柱除杂-浓缩结晶-粗品重结晶，最终得到青蒿素，柱层析后的洗脱液以及重结晶后的母液在大生产中通常作为废料处理，而青蒿酸和二氢青蒿酸等被留在废料中，没有加以有效利用，废料既造成了资源浪费也可能会导致环境污染，为了合理利用 ABP(青蒿素副产物)，有必要为其建立质量控制标准。
指纹图谱分析可以识别单味中药和中成药中的多种化合物，是评估中药整体质量的一种重要方法，不仅可以确定是否存在所需的标记物或活性物质，而且可以确定所有可检测的分析物的完整比率。因此，建立中药的指纹图谱代表了一种全面的定性方法，用于物种认证、质量评估，并确保中药及其相关产品的一致性和稳定性。目前已知相关研究报道ABP中含有的青蒿酸是合成青蒿素的重要前体，但尚未有关于ABP指纹图谱和含量测定的文献报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种青蒿素副产物高效液相指纹图谱的建立及含量测定方法，本发明建立了青蒿素副产物的高效液相指纹图谱方法，各共有峰分离度均较好，并以青蒿酸为对照，分别对AE和ARF样品进行含量测定，建立青蒿素副产物的质量评价方法，为青蒿素副产物的合理开发利用提供了基础。
本发明提供的一种青蒿素副产物高效液相指纹图谱的建立方法，包括以下步骤：
(1)供试品溶液的制备
分别精密称取0.1g AE和0.1g ARF，分别置于50mL具塞锥形瓶中，加甲醇25mL，称定重量，超声处理，取出放冷，用甲醇补足失重，过0.45μm微孔滤膜，取滤液即得AE供试品溶液和ARF供试品溶液；
(2)指纹图谱的建立
将所述AE供试品溶液和所述ARF供试品溶液注入高效液相色谱仪，得到AE指纹图谱和ARF指纹图谱；
其中所述高效液相色谱仪的色谱条件如下：
采用Waters Symmetry C18色谱柱，250×4.6mm，5μm；流动相A为乙腈，流动相B为0.2％磷酸；流速为1mL/min，检测波长为210nm；柱温为30℃；进样量为10μL；
AE高效液相色谱的流动相梯度洗脱程序如下表：
Figure RE-GDA0003233289850000021
ARF高效液相色谱的流动相梯度洗脱程序如下表：
Figure RE-GDA0003233289850000022
(3)生成对照指纹图谱
将所述AE指纹图谱和所述ARF指纹图谱的cdf文件分别导入国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》进行分析，设置S1为参照图谱，时间窗宽度设置为0.2，对照图谱生成方法设置为平均数，采用多点校正后进行全谱峰匹配和相似度计算，并生成AE对照指纹图谱和ARF对照指纹图谱。
进一步地，所得到的所述AE对照指纹图谱共有34个峰，其中18号为二氢青蒿酸峰，20号为青蒿酸峰；所得到的所述ARF对照指纹图谱共有27个峰，其中15号为青蒿素峰， 24号为二氢青蒿酸峰，25号为青蒿酸峰。
进一步地，所述超声处理时间为15～60min，频率为40kHz，功率为300W。
本发明还提供了一种青蒿素副产物的含量测定方法，包括以下步骤：
(1)供试品溶液的制备
分别精密称取0.1g AE和0.1g ARF，分别置于50mL具塞锥形瓶中，加入无水乙醇25mL，称定重量，超声处理，取出放冷，用无水乙醇补足失重，过0.45μm微孔滤膜滤过，取滤液即得AE供试品溶液和ARF供试品溶液；
(2)对照品溶液的制备
分别精密称取10.12mg二氢青蒿酸和10.13mg青蒿酸对照品，置于50mL容量瓶中，并加入甲醇定容至刻度线，摇匀，得到浓度为202.4μg/mL的二氢青蒿酸和202.6μg/mL的青蒿酸对照品储备溶液；
(3)标准曲线的制备
分别移取步骤(2)中的对照品储备溶液0.5、1、2、4、6、8mL置于10mL容量瓶中，并加甲醇定容至刻度线，摇匀，得到稀释后各梯度浓度的二氢青蒿酸和青蒿酸对照品溶液；将稀释后的各梯度浓度对照品和对照品储备溶液注入高效液相色谱仪进行检测，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，并绘制标准曲线，得到线性方程；
(4)含量测定
将供试品溶液注入高效液相色谱仪进行检测，记录二氢青蒿酸和青蒿酸的峰面积，并将峰面积带入线性方程，计算二氢青蒿酸和青蒿酸的百分含量；
其中步骤(3)和步骤(4)中的高效液相色谱仪的色谱条件如下：
采用Waters Symmetry C18色谱柱，250×4.6mm，5μm；流动相A为乙腈，流动相B为0.2％磷酸；洗脱程序如下表：
Figure RE-GDA0003233289850000041
流速为1mL/min，检测波长为210nm；柱温为30℃；进样量为10μL。
进一步地，所述超声处理时间为15～60min，频率为40kHz，功率为300W。
本发明的优点如下：
1.经过对流动相和梯度洗脱条件等条件优化，使得各共有峰分离度均较好，可以全面反应AE和ARF的整体质量。
2.建立了2种青蒿素副产物的指纹图谱并测定了二氢青蒿酸和青蒿酸含量，给未来对青蒿素副产物的定性、定量研究提供了依据，有助于提升对青蒿素副产物的资源利用。
3.本发明中发现2种青蒿素副产物中的二氢青蒿酸和青蒿酸的含量较高，具有开发利用的潜在价值，后续可进一步开展青蒿素副产物及其所含青蒿酸的资源利用及产品开发方面的研究。
4.本发明2种青蒿素副产物均有较好的抗氧化能力，具有产品开发的潜在价值。
附图说明
图1为AE紫外等吸收强度图；
图2为ARF紫外等吸收强度图；
图3为AE流动相梯度浓度考察；
图4为ARF流动相梯度浓度考察；
图5为不同提取溶剂对色谱峰的影响；
图6为不同超声时间对色谱峰的影响；
图7为10批AE指纹图谱；
图8为10批ARF指纹图谱；
图9为AE对照指纹图谱；
图10为ARF对照指纹图谱；
图11为AE峰标识；其中18号为二氢青蒿酸，20号为青蒿酸；
图12为ARF峰标识；其中15号为青蒿素，24号为二氢青蒿酸，25号为青蒿酸；
图13为专属性实验结果图；其中A为对照品溶液，B为AE供试品溶液，C为ARF供试品溶液；
图14为青蒿素副产物清除ABTS·+能力；
图15为青蒿素副产物抗氧化能力；
图16为青蒿素生产流程图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要说明的是，下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得，因此不能理解为对本发明的限制。
实施例1一种青蒿素副产物高效液相指纹图谱的建立方法
1.1样品
2种类型ABP(青蒿素副产物)[AE(除杂洗脱液)：AE-1～10；ARF(重结晶母液)：ARF-1～10]各10批，由重庆科瑞南海制药有限责任公司提供。
1.2色谱条件的考察
分别称取AE(AE-1)、ARF(ARF-1)样品0.1g，置50mL具塞锥形瓶中，加甲醇25 mL，称定重量，超声处理(频率40kHz，功率300W)15min，取出放冷，用甲醇补足失重，过0.45μm微孔滤膜，将滤液注入高效液相色谱仪。通过全波长扫描发现，AE和ARF 中绝大多数成分的吸收峰在210nm处，见图1和图2，因此选择在210nm处检测AE、ARF 的指纹图谱。通过调节流动相的比例和洗脱程序，使各色谱峰分离，见图3和图4。
最终优化得到AE和ARF的HPLC指纹图谱色谱条件如下：
色谱柱：Waters Symmetry C18柱(250×4.6mm，5μm)；流动相：乙腈(A)-0.2％磷酸(B)；流速：1mL/min，检测波长：210nm；柱温：30℃；进样量：10μL；洗脱程序分别见表1和表2。
表1AE高效液相色谱的流动相梯度洗脱程序
Figure RE-GDA0003233289850000061
表2 ARF高效液相色谱的流动相梯度洗脱程序
Figure RE-GDA0003233289850000062
1.3供试品溶液制备方法考察
1.3.1提取溶剂考察
精密称取AE(AE-1)样品2份，每份0.1g，置于50mL具塞锥形瓶中，1份加甲醇25 mL，称定重量，超声处理(频率40kHz，功率300W)15min，取出放冷，用甲醇补足失重，过0.45μm微孔滤膜，取滤液即得；1份加乙酸乙酯25mL，称定重量，超声处理(频率40kHz，功率300W)15min，取出放冷，用乙酸乙酯补足失重，离心，精密移取上清液 10mL置水浴锅上蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至10mL容量瓶定容，摇匀，过0.45μm微孔滤膜，即得。2种提取溶剂制得的供试品溶液按照“1.2”项下的色谱条件进样，记录色谱图，见图5，色谱图结果显示峰数量、峰高、峰面积没有明显差别，由于采用乙酸乙酯制样过程复杂，复溶过程易导致化学成分损失，因此采用甲醇作为溶剂。
1.3.2提取时间考察
精密称取AE(AE-1)样品3份，每份0.1g，置于50mL具塞锥形瓶中，加甲醇25mL，称定重量，分别超声处理(频率40kHz，功率300W)15min、30min、60min，取出放冷，用甲醇补足失重，通过0.45μm微孔滤膜滤过，取滤液即得，并按照“1.2”项下的色谱条件进样，记录色谱图，见图6，色谱图结果显示峰数量、峰高、峰面积没有明显差别，为了节约时间，因此采用超声15min。
综上，最终确定供试品溶液的制备方法为：分别精密称取0.1g AE和0.1g ARF，分别置于50mL具塞锥形瓶中，加甲醇25mL，称定重量，超声处理(频率40kHz，功率300W)15min，取出放冷，用甲醇补足失重，过0.45μm微孔滤膜，取滤液即得。
1.4方法学考察
1.4.1精密度试验
取AE(AE-1)、ARF(ARF-1)供试品溶液各1份，分别按“1.2”项下色谱条件分别连续测定6次，记录色谱图。将所得HPLC色谱图导入“《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012.130723版本)”软件进行峰匹配，分别以20(S)、25(S)为参照峰，计算其他共有峰的相对保留时间，结果见表3和表4。
表3 AE的HPLC指纹图谱精密度试验(相对保留时间)
Figure RE-GDA0003233289850000071
Figure RE-GDA0003233289850000081
表4 ARF的HPLC指纹图谱精密度试验(相对保留时间)
Figure RE-GDA0003233289850000082
结果显示AE、ARF各共有峰相对保留时间RSD<1％，表明仪器精密度良好。
1.4.2稳定性试验
取AE(AE-1)、ARF(ARF-1)供试品溶液各1份，分别按“1.2”项下色谱条件分别在0、2、4、8、12、24h进样，记录色谱图。将所得HPLC色谱图导入“《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012.130723版本)”软件进行峰匹配，分别以20(S)、25(S) 为参照峰，计算其他共有峰的相对保留时间，结果见表5和表6。
表5 AE的HPLC指纹图谱稳定性试验(相对保留时间)
Figure RE-GDA0003233289850000083
Figure RE-GDA0003233289850000091
表6 ARF的HPLC指纹图谱稳定性试验(相对保留时间)
Figure RE-GDA0003233289850000092
Figure RE-GDA0003233289850000101
结果显示AE、ARF各共有峰相对保留时间RSD<1％，表明供试品溶液在24h内测定的结果稳定。
1.4.3重复性试验
取AE(AE-1)、ARF(ARF-1)分别平行制备6份供试品溶液，进样，记录色谱图。将所得HPLC色谱图导入“《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012.130723版本)”软件进行峰匹配，分别以20(S)、25(S)为参照峰，计算其他共有峰的相对保留时间结果见表 7和表8。
表7 AE的HPLC指纹图谱重复性试验(相对保留时间)
Figure RE-GDA0003233289850000102
Figure RE-GDA0003233289850000111
表8 ARF的HPLC指纹图谱重复性试验(相对保留时间)
Figure RE-GDA0003233289850000112
结果显示AE、ARF各共有峰相对保留时间RSD<1％，表明该方法重复性较好。
1.5样品指纹图谱的建立
取AE和ARF样品按“1.3”项下优化所得方法制备供试品溶液，按照“1.2”项下的色谱条件进样，记录色谱图和数据。将10批AE样品和10批ARF样品的cdf文件分别导入国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012.130723版本)进行分析，设置 S1为参照图谱，时间窗宽度设置为0.2，对照图谱生成方法设置为平均数，采用多点校正后进行全谱峰匹配和相似度计算，并生成对照指纹图谱，匹配结果见图7和图8；对照指纹图谱见图9和图10；各批样品相似度评价结果见表9。
表9 AE、ARF样品与对照图谱的相似度评价
Figure RE-GDA0003233289850000121
结果可知AE、ARF样品与对照图谱的相似度均>0.91，证明相似度良好。
1.6部分特征峰标识
分别取二氢青蒿酸、青蒿酸、青蒿素对照品适量，用3mL甲醇溶解，过0.45μm微孔滤膜，将滤液注入高效液相色谱仪，按照“1.2”项下的色谱条件进样。将“1.5”项下生成的对照指纹图谱与对照品图谱进行比对，结果见图11和图12，标记出AE的HPLC指纹图谱中2个特征峰：二氢青蒿酸(18号)、青蒿酸(20号)；标记出ARF的HPLC指纹图谱中3个特征峰：青蒿素(15号)、二氢青蒿酸(24号)、青蒿酸(25号)。
本实施例1通过对色谱条件及供试品制备等条件优化，使得各共有峰分离度均较好，最终得到AE和ARF的指纹图谱，并对部分特征峰进行了标识，虽然不能标定出全部峰形较高的色谱峰，但因为指纹图谱的整体性和模糊性，不会影响对样品一致性的对比。通过指纹图谱软件生成的对照指纹图谱，既可用于AE和ARF的定性分析，也能在一定程度上反应AE和ARF的整体质量。
实施例2一种青蒿素副产物的含量测定方法
1.1样品
样品同实施例1。
1.2色谱条件
色谱柱：Waters Symmetry C18柱(250×4.6mm，5μm)；流动相：乙腈(A)-0.2％磷酸(B)；流速：1mL/min，检测波长：210nm；柱温：30℃；进样量：10μL；洗脱程序见表 10。
表10高效液相色谱的流动相梯度洗脱程序
Figure RE-GDA0003233289850000131
1.3供试品溶液的制备
分别精密称取0.1g AE和0.1g ARF，分别置于50mL具塞锥形瓶中，加入无水乙醇25mL，称定重量，超声处理(频率40kHz，功率300W)15～60min，取出放冷，用无水乙醇补足失重，过0.45μm微孔滤膜滤过，取滤液即得。
1.4对照品溶液的制备
分别精密称取二氢青蒿酸、青蒿酸对照品10.12、10.13mg，置于50mL容量瓶中，并加入甲醇定容至刻度线，摇匀，得到浓度为202.4μg/mL的二氢青蒿酸和202.6μg/mL的青蒿酸对照品储备溶液。
1.5方法学考察
1.5.1专属性考察
将对照品溶液、供试品溶液分别在“1.2”项色谱条件下进样检测，结果见图13。溶剂峰对二氢青蒿酸和青蒿酸无干扰，理论塔板数以二氢青蒿酸和青蒿酸计为均不低于15000，2 种供试品溶液中二氢青蒿酸、青蒿酸与其相邻色谱峰的分离度均大于1.5，表明该方法专属性良好。
1.5.2精密度考察
取“1.4”项的二氢青蒿酸和青蒿酸对照品溶液，按照“1.2”项下的色谱条件连续进样检测6次，并记录每次进样后二氢青蒿酸和青蒿酸的峰面积。结果显示二氢青蒿酸和青蒿酸对照品溶液峰面积RSD分别为1.17％、1.10％，表明仪器精密度良好。
1.5.3稳定性考察
取AE、ARF样品制备供试品溶液各1份分别于0、2、4、8、12、24h时按照“1.2”项下的色谱条件进样检测，并记录二氢青蒿酸和青蒿酸的峰面积。结果表明AR中二氢青蒿酸和青蒿酸峰面积的RSD分别为1.35％和1.03％，ARF中二氢青蒿酸和青蒿酸含量的RSD分别为1.14、1.27，说明样品溶液在24h里测定稳定性良好。
1.5.4重复性考察
取AE、ARF样品，并分别平行制备6份供试品溶液，按照“1.2”项下的色谱条件依次进样，并记录二氢青蒿酸和青蒿酸的百分含量。结果表明AR中二氢青蒿酸和青蒿酸含量的RSD分别为1.05、0.81，ARF中二氢青蒿酸和青蒿酸含量的RSD分别为1.05、1.30，表明该方法重复性较好。
1.5.5加样回收率
精密称取AE和ARF各6份，每份0.05g，并分别添加与样品中含量相当的二氢青蒿酸和青蒿酸对照品，按照“1.3”项下的方法制备供试品溶液，再以“1.2”项下的色谱条件分别进样检测，计算二氢青蒿酸和青蒿酸的平均加样回收率，结果见表11。结果分别符合2020版《中华人民共和国药典》第四部(通则9101)下含量在1％时回收率范围“92～105％”和在10％时回收率范围“95～102％”的要求。
表11 AE和ARF中二氢青蒿酸和青蒿酸的加样回收率试验结果
Figure RE-GDA0003233289850000151
1.6标准曲线、线性范围、定量限与检测限
分别移取“1.4”项下对照品储备溶液0.5、1、2、4、6、8mL置10mL容量瓶中，并加甲醇定容至刻度线，摇匀，得到梯度浓度的二氢青蒿酸和青蒿酸对照品溶液。将稀释后的各浓度对照品和对照品储备溶液按“1.2”项下的色谱条件进样检测，以峰面积(Y)为纵坐标，浓度(X，μg/mL)为横坐标，并绘制标准曲线，得到线性方程。以信噪比为3时考察检测限、信噪比为10时考察定量限，结果见表12。
表12线性方程、线性范围及检测限、定量限
Figure RE-GDA0003233289850000152
1.7含量测定
按照“1.3”项下的方法制备10批AE和10批ARF的供试品溶液，按照“1.2”项下的色谱条件进样检测，记录二氢青蒿酸和青蒿酸的峰面积，并将峰面积带入线性方程，计算二氢青蒿酸和青蒿酸的百分含量，结果见表13。
表13 AE和ARF中二氢青蒿酸和青蒿酸含量(
Figure RE-GDA0003233289850000161
n＝3)
Figure RE-GDA0003233289850000162
由本实施例2可知2种青蒿素副产物中的二氢青蒿酸和青蒿酸的含量较高，AE中二氢青蒿酸含量为9.01％～10.48％，青蒿酸含量为2.71％～3.41％；ARF中二氢青蒿酸含量为2.21％～4.70％，青蒿酸含量为0.53％～1.18％。此外，通过对青蒿素副产物指纹图谱的研究，发现均有峰形较高的共有峰。
实施例3青蒿素副产物抗氧化活性研究
1.1样品
样品同实施例1。
1.2 ABTS·+清除能力测定
将7mmol/L的ABTS溶液与2.45mmol/L的过硫酸钾溶液按体积比1:1混合，在黑暗环境中室温放置14h，生成ABTS自由基储备液。分析前将上述储备溶液用95％乙醇稀释至在734nm处吸光度为0.7±0.02。将0.1mL浓度为0～346.4μg/mL的维生素E(Trolox)溶液与3.9mL底物溶液混合，孵育6min，取200μL混合液置于96孔板中，在734nm处检测吸光度。以浓度为横坐标、吸光度为纵坐标做回归曲线，得到线性方程及范围。将0.1mL 供试品甲醇溶液(浓度为4mg/mL)替代Trolox溶液进行反应并检测，结果带入线性方程， ABTS自由基清除能力以Trolox抗氧化能力当量(TEAC)表示，结果见图14。由结果可知， ARF对ABTS·+的清除能力明显强于AE；除第7批外，其他批次AE的抗氧化能差异不大；而ARF的批间差异则较明显。
1.3 FARP测定
将0.3mol/L的乙酸钠缓冲溶液、20mmol/L的FeCl3和10mmol/L的TPTZ溶液(溶剂为40mmol/L的HCl溶液)按体积比为10:1:1混合，得到FRAP工作液，放置在37℃水浴中保温。精密移取不同浓度(1～10mmol/L)的FeSO4·7H2O溶液20μL，加入3mLFRAP 工作液，混匀后37℃反应40min，取200μL混合液置于96孔板中，在593nm处检测吸光度。以浓度为横坐标、吸光度为纵坐标做回归曲线，得到线性方程及范围。将20μL供试品甲醇溶液(浓度为4mg/mL)替代FeSO4·7H2O溶液进行反应并检测，结果带入线性方程，抗氧化能力用FARP(mmol/L)表示，结果见图15。由结果可知，同一批次AE和ARF的抗氧化能力(FARP)差距较ABTS·+清除能力小。
由本实施例3可知，AE和ARF均有较好的抗氧化能力；同时结合含量测定结果可知，二氢青蒿酸和青蒿酸的含量与2种抗氧化能力指标无明显相关性，说明倍半萜类成分不是2种副产物中起主要抗氧化作用的成分。抗氧化能力强的成分大都具有多羟基结构，结合AE和ARF的指纹图谱可知，ARF在大极性部分(0～30min)有较多色谱峰，而AE的峰较少，推测青蒿素副产物的抗氧化能力与此部位有关。此外，本发明还考察了2种副产物的Fe3+还原能力和DPPH·清除能力，结果发现AE和ARF均没有明显的Fe3+还原能力和DPPH·清除能力，表明2种副产物的抗氧化能力存在一定的选择性。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体结构及特性等常识在此未作过多描述，所属领域普通技术人员知晓申请日或者优先权日之前发明所属技术领域所有的普通技术知识，能够获知该领域中所有的现有技术，并且具有应用该日期之前常规实验手段的能力，所属领域普通技术人员可以在本申请给出的启示下，结合自身能力完善并实施本方案，一些典型的公知结构或者公知方法不应当成为所属领域普通技术人员实施本申请的障碍。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明结构的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。

Claims (5)

1.一种青蒿素副产物高效液相指纹图谱的建立方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)供试品溶液的制备
分别精密称取0.1g AE和0.1g ARF，分别置于50mL具塞锥形瓶中，加甲醇25mL，称定重量，超声处理，取出放冷，用甲醇补足失重，过0.45μm微孔滤膜，取滤液即得AE供试品溶液和ARF供试品溶液；
(2)指纹图谱的建立
将所述AE供试品溶液和所述ARF供试品溶液注入高效液相色谱仪，得到AE指纹图谱和ARF指纹图谱；
其中所述高效液相色谱仪的色谱条件如下：
采用Waters Symmetry C18色谱柱，250×4.6mm，5μm；流动相A为乙腈，流动相B为0.2％磷酸；流速为1mL/min，检测波长为210nm；柱温为30℃；进样量为10μL；
AE高效液相色谱的流动相梯度洗脱程序如下表：
Figure FDA0003177387380000011
ARF高效液相色谱的流动相梯度洗脱程序如下表：
Figure FDA0003177387380000012
(3)生成对照指纹图谱
将所述AE指纹图谱和所述ARF指纹图谱的cdf文件分别导入国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》进行分析，设置S1为参照图谱，时间窗宽度设置为0.2，对照图谱生成方法设置为平均数，采用多点校正后进行全谱峰匹配和相似度计算，并生成AE对照指纹图谱和ARF对照指纹图谱。
2.根据权利要求1所述的一种青蒿素副产物高效液相指纹图谱的建立方法，其特征在于：所得到的所述AE对照指纹图谱共有34个峰，其中18号为二氢青蒿酸峰，20号为青蒿酸峰；所得到的所述ARF对照指纹图谱共有27个峰，其中15号为青蒿素峰，24号为二氢青蒿酸峰，25号为青蒿酸峰。
3.根据权利要求1所述的一种青蒿素副产物高效液相指纹图谱的建立方法，其特征在于：所述超声处理时间为15～60min，频率为40kHz，功率为300W。
4.一种青蒿素副产物的含量测定方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)供试品溶液的制备
分别精密称取0.1g AE和0.1g ARF，分别置于50mL具塞锥形瓶中，加入无水乙醇25mL，称定重量，超声处理，取出放冷，用无水乙醇补足失重，过0.45μm微孔滤膜滤过，取滤液即得AE供试品溶液和ARF供试品溶液；
(2)对照品溶液的制备
分别精密称取10.12mg二氢青蒿酸和10.13mg青蒿酸对照品，置于50mL容量瓶中，并加入甲醇定容至刻度线，摇匀，得到浓度为202.4μg/mL的二氢青蒿酸和202.6μg/mL的青蒿酸对照品储备溶液；
(3)标准曲线的制备
分别移取步骤(2)中的对照品储备溶液0.5、1、2、4、6、8mL置于10mL容量瓶中，并加甲醇定容至刻度线，摇匀，得到稀释后各梯度浓度的二氢青蒿酸和青蒿酸对照品溶液；将稀释后的各梯度浓度对照品和对照品储备溶液注入高效液相色谱仪进行检测，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，并绘制标准曲线，得到线性方程；
(4)含量测定
将供试品溶液注入高效液相色谱仪进行检测，记录二氢青蒿酸和青蒿酸的峰面积，并将峰面积带入线性方程，计算二氢青蒿酸和青蒿酸的百分含量；
其中步骤(3)和步骤(4)中的高效液相色谱仪的色谱条件如下：
采用Waters Symmetry C18色谱柱，250×4.6mm，5μm；流动相A为乙腈，流动相B为0.2％磷酸；
洗脱程序如下表：
Figure FDA0003177387380000031
流速为1mL/min，检测波长为210nm；柱温为30℃；进样量为10μL。
5.根据权利要求4所述的一种青蒿素副产物的含量测定方法，其特征在于：所述超声处理时间为15～60min，频率为40kHz，功率为300W。
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