背景技术
消旋卡多曲是由法国Bioprojet公司研制的一种脑啡肽酶抑制剂,并于1993年法国以商品名Tiorfan上市。消旋卡多曲作为一种新型作用机制的抗腹泻药,直接抑制肠道过度分泌,快速改善腹泻症状,治疗小儿轮状病毒性腹泻疗效显著,能明显缩短病程、减少患儿的痛苦,适用于成人及1月以上婴儿和儿童的急性腹泻。上市不久,加拿大儿科协会和美国疾病预防中心就把消旋卡多曲列入儿童腹泻治疗的必备药物,2011年也列入了中国国家儿科腹泻病治疗共识的推荐用药。目前国内临床一线的儿科医生已经将消旋卡多曲作为临床儿童腹泻治疗的高效安全药物,具有广阔的市场前景。
对甲苯磺酸是消旋卡多曲合成中的副产物,可能会和溶剂中的甲醇、乙醇、异丙醇反应生成对甲苯磺酸甲酯、对甲苯磺酸乙酯和对甲苯磺酸异丙酯。磺酸酯类为基因毒性杂质,必须严格控制。经检索,目前关于对甲苯磺酸甲酯、对甲苯磺酸乙酯和对甲苯磺酸异丙酯的痕量检测多采用GC-MS的方法。
对甲苯磺酸甲酯,英文名称:Methyl p-toluenesulfonate,CAS:80-48-8,分子式:C8H10O3S;分子量:186.22,结构式如下所示:
对甲苯磺酸乙酯:英文名称:Ethyl p-toluenesulfonate,CAS:80-40-0,分子式:C9H12O3S;分子量:200.25,结构式如下所示:
对甲苯磺酸异丙酯:英文名称:Isopropyl p-toluenesulfonate,CAS:2307-69-9,分子式:C10H14O3S;分子量:214.28,结构式如下所示:
发明内容
本发明的目的在于克服GC-MS仪器昂贵、普及率不高、操作复杂等不足,提供一种更简单易行且同时检测三种对甲苯磺酸酯类的HPLC方法。经实验证明,该方法具有专属性强、快速、灵敏、准确等优点,能够可靠地对消旋卡多曲中对甲苯磺酸甲酯、对甲苯磺酸乙酯和对甲苯磺酸异丙酯进行定性定量分析。
本发明的技术方案是:一种同时检测消旋卡多曲中三种对甲苯磺酸酯类物质(对甲苯磺酸甲酯、对甲苯磺酸乙酯和对甲苯磺酸异丙酯)含量的HPLC方法,其特征是,将消旋卡多曲样品溶解后采用HPLC检测方法对其中的对甲苯磺酸甲酯、对甲苯磺酸乙酯和对甲苯磺酸异丙酯进行定性、定量分析。
其中,色谱条件为:色谱柱:德国默克LiChrospher RP 18;流动相A:1.0±0.2g/l的磷酸二氢钾水溶液,磷酸调pH至2.5;流动相B:乙腈;检测波长:225nm。
优选色谱条件为:
色谱柱:德国默克LiChrospher RP 18(end-capped,250mm×4.0mm×5μm);
流动相A:1.0g磷酸二氢钾置1000ml水中,磷酸调pH至2.5;
流动相B:乙腈;
溶剂:乙腈;
检测器:紫外检测器;
检测波长:225nm;
流速:1.0ml/min;
柱温:40℃;
进样量:10μl;
梯度洗脱条件见表1。
表1梯度洗脱表
时间(分) |
流动相A(%) |
流动相B(%) |
0 |
60 |
40 |
5 |
60 |
40 |
25 |
20 |
80 |
35 |
20 |
80 |
40 |
60 |
40 |
50 |
60 |
40 |
进一步的,本发明采用外标法对消旋卡多曲中对甲苯磺酸酯类物质进行定量。
进一步的,在本发明的检测条件下,对甲苯磺酸甲酯RT为10.6±0.1min;对甲苯磺酸乙酯RT为14.1±0.1min,对甲苯磺酸异丙酯RT为16.7±0.1min,消旋卡多曲RT为18.9±0.1min。本发明的优势是:
1、本发明首次建立了采用HPLC同时检测对甲苯磺酸甲酯、对甲苯磺酸乙酯和对甲苯磺酸异丙酯含量的方法,便于对消旋卡多曲的质量进行控制,从而提高了消旋卡多曲的用药安全性。
2、分离效果好
本发明首次采用高效液相色谱法同时检测消旋卡多曲中的对甲苯磺酸甲酯、对甲苯磺酸乙酯和对甲苯磺酸异丙酯,并对方法进行了优化,使这3种杂质能能与消旋卡多曲得到很好的分离。从图6和表3可以看出:对甲苯磺酸甲酯RT为10.651min;对甲苯磺酸乙酯RT为14.100min,对甲苯磺酸异丙酯RT为16.731min,消旋卡多曲RT为18.865min,分离效果好。
3、方法的专属性强、快速、灵敏、准确
经实验证明,该方法具有专属性强(专门针对对甲苯磺酸甲酯、对甲苯磺酸乙酯和对甲苯磺酸异丙酯)、快速、灵敏(对甲苯磺酸甲酯检出限为0.516ppm,定量限为1.031ppm;对甲苯磺酸乙酯检出限为0.500ppm,定量限为1.000ppm;对甲苯磺酸异丙酯检出限为0.493ppm,定量限为0.986ppm)、准确(对甲苯磺酸甲酯:89.67%~100.61%;对甲苯磺酸乙酯:90.16%~98.13%;对甲苯磺酸异丙酯:90.23%~98.45%)等优点,能够可靠地对消旋卡多曲中的对甲苯磺酸甲酯、对甲苯磺酸乙酯和对甲苯磺酸异丙酯进行定性定量分析。
具体实施方式
实施例1
1仪器与材料
1.1仪器:Waters e2695高效液相色谱仪。
1.2试剂:乙腈(色谱级),磷酸二氢钾、磷酸(试剂级),水为纯净水。
2方法与结果
2.1色谱条件
色谱柱:德国默克LiChrospher RP 18(end-capped,250mm×4.0mm×5μm);
流动相A:1.0g磷酸二氢钾置1000ml水中,磷酸调pH至2.5;
流动相B:乙腈;
溶剂:乙腈;
检测器:紫外检测器;
检测波长:225nm;
流速:1.0ml/min;
柱温:40℃;
进样量:10μl;
梯度洗脱条件见表2。
表2梯度洗脱表
时间(分) |
流动相A(%) |
流动相B(%) |
0 |
60 |
40 |
5 |
60 |
40 |
25 |
20 |
80 |
35 |
20 |
80 |
40 |
60 |
40 |
50 |
60 |
40 |
2.2溶液的制备
2.21专属性溶液的制备
精密称取对甲苯磺酸甲酯对照品200.79mg,置10ml量瓶中,用乙腈溶解并稀释至刻度,摇匀。精密量取1ml,置100ml量瓶中,加乙腈稀释至刻度,摇匀;再精密量取1ml,置100ml量瓶中,加乙腈稀释至刻度,摇匀,得溶液a。
精密称取对甲苯磺酸乙酯对照品201.38mg,置10ml量瓶中,用乙腈溶解并稀释至刻度,摇匀。精密量取1ml,置100ml量瓶中,加乙腈稀释至刻度,摇匀;再精密量取1ml,置100ml量瓶中,加乙腈稀释至刻度,摇匀,得溶液b。
精密称取对甲苯磺酸异丙酯对照品201.68mg,置10ml量瓶中,用乙腈溶解并稀释至刻度,摇匀。精密量取1ml,置100ml量瓶中,加乙腈稀释至刻度,摇匀;再精密量取1ml,置100ml量瓶中,加乙腈稀释至刻度,摇匀,得溶液c。
精密量取溶液a、b、c各5ml置同一100ml量瓶中,加乙腈稀释至刻度,摇匀,得浓度分别为0.100395μg/ml、0.100690μg/ml和0.100840μg/ml的对照品溶液。
精密称精密称取消旋卡多曲样品500.92mg,置25ml量瓶中,用乙腈溶解并稀释至刻度,摇匀,得供试品溶液。
精密称取消旋卡多曲样品1.00492g,置50ml量瓶中,分别量取溶液a、b、c各2.5ml,置同一量瓶中,用乙腈溶解并稀释至刻度,摇匀,得混合溶液。
2.22加标供试品溶液的制备
称取消旋卡多曲样品1g(精确到0.00001g)共六份,分别置50ml量瓶中,加入溶液a、b、c各2.5ml,用乙腈溶解并稀释至刻度,摇匀,作为加标供试品溶液,计算方法的重复性。不同日期对同一样品进行测定,计算方法的中间精密度。
配制加不同浓度对甲苯磺酸甲酯、乙酯及异丙酯对照品溶液的加标供试品溶液,计算方法的准确度。
2.23检测
精密量取2.21的溶液a、溶液b、溶液c、对照品溶液、供试品溶液和混合溶液各10μl直接(分别)进样,按照2.1所示的色谱条件进行HPLC检测,记录色谱图。结果如图1-6所示。从图6可以看出:对甲苯磺酸甲酯RT为10.651min,对甲苯磺酸乙酯RT为14.100min,对甲苯磺酸异丙酯RT为16.731min,消旋卡多曲RT为18.865min,各色谱峰能得到很好的分离,且其他杂质不干扰对甲苯磺酸甲酯、乙酯及异丙酯的测定。
3分析方法的验证
3.1线性关系
对照品溶液(0.1μg/ml)分别各取2μl、4μl、6μl、8μl、10μl、12μl进样,以峰面积为纵坐标,浓度(进样量)为横坐标,绘制标准曲线。对甲苯磺酸甲酯:y=544.21x-197.67,R=0.9978;对甲苯磺酸乙酯:y=466.8x-237.6,R=0.9942;对甲苯磺酸异丙酯:y=396.51x-143.27,R=0.9952。结果见图7-9。其截距绝对值为100%(10μl)浓度面积的3~4%左右。
3.2重复性与中间精密度
取同一消旋卡多曲样品配制的六份加标供试品溶液进行重复性实验,结果见表3-5。
表3重复性结果(对甲苯磺酸甲酯)
表4重复性结果(对甲苯磺酸乙酯)
表5重复性结果(对甲苯磺酸异丙酯)
不同日期取重复试验的同一消旋卡多曲样品配制的六份加标供试品溶液进行重复性实验,结果见表6-8。
表6中间精密度结果(对甲苯磺酸甲酯)
表7中间精密度结果(对甲苯磺酸乙酯)
表8中间精密度结果(对甲苯磺酸异丙酯)
3.3准确度
配制样品加不同浓度对照品溶液的供试品溶液,计算方法的准确度。结果见表9-11。表9准确度结果(对甲苯磺酸甲酯)
表10准确度结果(对甲苯磺酸乙酯)
表11准确度结果(对甲苯磺酸异丙酯)
3.4耐用性:取准确度项下对照品溶液,在8小时内重复进样,对照品峰面积相对标准差分别为1.16%、1.51%和0.98%。
3.5检出限:方法的检出限(LOD)为取信噪比S/N≥3时的对甲苯磺酸甲酯、对甲苯磺酸乙酯和对甲苯磺酸异丙酯的进样浓度,其相对于理论样品浓度的比值为检出限,通过计算分别为0.516ppm、0.500ppm和0.493ppm。
3.6定量限:方法的检出限(LOD)为取信噪比S/N≥10时的对甲苯磺酸甲酯、对甲苯磺酸乙酯和对甲苯磺酸异丙酯的进样浓度,其相对于理论样品浓度的比值为定量限,通过计算分别为1.031ppm、1.000ppm和0.986ppm。
4讨论
本发明首次采用高效液相色谱法同时检测消旋卡多曲中的对甲苯磺酸甲酯、对甲苯磺酸乙酯和对甲苯磺酸异丙酯,并对方法进行了优化,使这3种杂质能与消旋卡多曲得到很好的分离。经实验证明,该方法具有专属性强、快速、灵敏、准确等优点,经实验证明,该方法具有专属性强、快速、灵敏、准确等优点。
磺酸脂类为基因毒性杂质,必须严格控制。查询http://toxnet.nlm.nih.gov/cpdb/未发现它们具体的基因毒性数据。因此以TTC=1.5μg/day作为接触限度计算其在成品中的接触限度。消旋卡多曲最大日剂量为300mg/d,因此限度Con计算公式如下:
消旋卡多曲中对甲苯磺酸甲酯、对甲苯磺酸乙酯和对甲苯磺酸异丙酯限度均不超过5ppm,且三者之和限度不超过5ppm。
实施例2:实际样品的检测
1)取消旋卡多曲原料药,用乙腈溶解,配制成1ml中含有20mg消旋卡多曲的溶液,作为供试品溶液;
2)取对甲苯磺酸甲酯对照品、对甲苯磺酸乙酯对照品和对甲苯磺酸异丙酯对照品用乙腈溶解,配制成1ml中含有0.1μg对甲苯磺酸甲酯对照品、0.1μg对甲苯磺酸乙酯对照品和0.1μg对甲苯磺酸异丙酯对照品的溶液;
3)取步骤1)制备的供试品溶液和步骤2)的对照品溶液,采用与实施例1完全相同的仪器和试剂,按照步骤1)2.1所示的色谱条件进行检测。
4)按照外标法,以峰面积计算消旋卡多曲中对甲苯磺酸甲酯、对甲苯磺酸乙酯和对甲苯磺酸异丙酯的含量。
采用上述的方法检测三批样品,结果如表12所示:
表12实际检测结果
样品批号 |
1 |
2 |
3 |
对甲苯磺酸甲酯含量(ppm) |
未检出 |
未检出 |
未检出 |
对甲苯磺酸乙酯含量(ppm) |
未检出 |
未检出 |
未检出 |
对甲苯磺酸异丙酯含量(ppm) |
未检出 |
未检出 |
未检出 |
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