CN115097023A - 佐米胺有关物质的高效液相色谱检测方法 - Google Patents

佐米胺有关物质的高效液相色谱检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了佐米胺有关物质的高效液相色谱检测方法，属于药物分析技术领域。其色谱条件包括：色谱柱为二十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，以磷酸三钾溶液‑乙腈为流动相A，乙腈‑水为流动相B，甲醇为流动相C；采用双波长检测；采用梯度程序洗脱。本专利申请提供的检测方法克服了佐米胺的主要杂质i‑8与佐米胺，以及相邻杂质因极性相近而难以分离的问题，可有效达到佐米胺与杂质、以及杂质之间的良好分离，对佐米胺的杂质可以进行精确地定量检测和分析，从而实现对佐米胺质量的有效监控；该方法可快速、简单地检测佐米胺及其杂质，并对其精确定量，大大提升了药物分析工作的效率和准确性；进而保证佐米曲普坦的安全性和有效性。

Description

佐米胺有关物质的高效液相色谱检测方法
技术领域
本发明涉及药物分析技术领域，具体涉及一种佐米胺有关物质的高效液相色谱检测方法。
背景技术
佐米胺((S)-4-(4-Aminobenzyl)-1,3-oxazolidin-2-one)，分子式为C10H12N2O2，分子量为192.21，CAS号为152305-23-2。佐米胺是合成佐米曲普坦的医药中间体，佐米胺及相关杂质结构式如下。
Figure BDA0003672143960000011
杂质研究是药物质量研究的一项重要内容，杂质的研究和控制是药品质量保证的关键要素之一。起始原料中杂质的合理控制能够有效地控制成品的质量。医药中间体的有关物质检查是一项非常重要的质量控制指标。佐米胺是合成佐米曲普坦的关键物料之一，为了保证佐米曲普坦的安全性和有效性，需要对佐米胺的有关物质进行研究。目前佐米胺有关物质的研究鲜有报道。
其终产品佐米曲普坦的检测方法有诸多文献公开，如专利文献“稳定的佐米曲普坦片剂”(公开号：CN103340854B)提供的有关物质检测色谱条件为：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；以乙腈-0.12％冰乙酸(90:410)，用三乙胺调节pH值至3.0±0.2为流动相；检测波长为225nm。
张姮婕等在《华西药学》2012第27期发表文章《HPLC测定佐米曲普坦中的有关物质》中公开了如下色谱条件：采用Waters Symmetry shieldTM C18色谱柱，流动相为磷酸二氢钾缓冲溶液(取6.8g磷酸二氢钾、1.01g庚烷磺酸钠，加水溶解并稀释至1L，用三乙胺调pH6)-乙腈(82∶18)，检测波长224nm。
然而，采用上述公开的色谱检测方法很难将佐米胺以及各个杂质分开，其原因为杂质i-8和佐米胺及相邻未知杂质极性相似，采用现有的技术方案无法满足各个色谱峰分离的要求，从而无法准确地对各个杂质进行定量分析，故开发专属性更好的佐米胺有关物质的检测方法成为本领域技术人员亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种佐米胺有关物质的高效液相色谱检测方法，达到佐米胺与杂质，以及杂质之间的良好分离，对佐米胺的杂质进行精确地定量检测和分析，从而实现对佐米胺质量的有效监控；该方法可快速、准确地分离和检测出佐米胺及其杂质。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
佐米胺有关物质的高效液相色谱检测方法，在高效液相色谱仪上进行佐米胺有关物质检测，其色谱条件包括：
色谱柱为二十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，以磷酸三钾溶液-乙腈为流动相A，乙腈-水为流动相B，甲醇为流动相C；杂质i-1的检测波长为205nm，杂质i-7、杂质i-8和其他杂质的检测波长为230nm；采用紫外检测器；采用如下梯度程序洗脱：
在0～10分钟内，流动相A、流动相B和流动相C的体积比保持88～92:0:8～12不变；在10～16分钟内，流动相A、流动相B和流动相C的体积比由88～92:0:8～12线性渐变至85:5:10；在16～30分钟内，流动相A、流动相B和流动相C的体积比保持85:5:10不变；在30～40分钟内，流动相A、流动相B和流动相C的体积比由85:5:10线性渐变至75:15:10；在40～42分钟内，流动相A、流动相B和流动相C的体积比保持75:15:10不变；在42～54分钟内，流动相A、流动相B和流动相C的体积比由75:15:10线性渐变至47:43:10；在54～60分钟内，流动相A、流动相B和流动相C的体积比保持47:43:10不变；在60～61分钟内，流动相A、流动相B和流动相C的体积比由47:43:10线性渐变至88～92:0:8～12；在61～70分钟内，流动相A、流动相B和流动相C的体积比保持88～92:0:8～12不变，即60分钟后为色谱柱平衡时间。
所述杂质i-1、杂质i-7、杂质i-8以及佐米胺的结构式如下：
Figure BDA0003672143960000021
优选的，所述磷酸三钾溶液配制方法为：取磷酸三钾，用水溶解并稀释，用磷酸调节pH值；所述磷酸三钾溶液浓度为0.018mol/L～0.022mol/L，优选0.02mol/L；
所述磷酸三钾溶液pH值范围为8.8～9.2，优选9.0；
所述流动相A中磷酸三钾溶液与乙腈体积比为95:5～93:7，优选93:7。
优选的，流动相B中乙腈和水的体积比为88:12～92:8，优选90:10。
优选的，所述色谱柱采用如下品牌的色谱柱：Sun Armor RP-AQUA C28。
优选的，所述的检测方法，还包括供试品溶液的配制，所述供试品溶液浓度为2.5mg/ml，以佐米胺计，采用稀释剂溶解并稀释，所述稀释剂为0.02mol/L磷酸三钾溶液(用磷酸调节pH值至9.0)-乙腈(93:7)。
优选的，柱温选自20～30℃，优选25℃。
优选的，流动相流速选自0.8～1.2mL/min，优选1.0mL/min。
优选的，在柱温为25℃，流动相A为磷酸三钾溶液-乙腈(93:7)，所述磷酸三钾溶液浓度为0.02mol/L，用磷酸调节pH值至9.0，流动相B为乙腈-水(90:10)，流速为1.0mL/min条件下，各个杂质的相对保留时间为：所述杂质i-1为0.45，所述杂质i-7为0.37，所述杂质i-8为1.35，其他杂质按照出峰顺序依次为1.42，1.64，2.60，3.25。
优选的，所述的检测方法，还包括如下步骤：
步骤1、系统适用性溶液、杂质对照品溶液的配制：
杂质i-8对照品贮备溶液：取杂质i-8对照品适量加稀释剂溶解并定量稀释配制成浓度为0.1mg/ml溶液。
系统适用性溶液：取佐米胺对照品，精密量取杂质i-8对照品贮备溶液置同一量瓶中，加稀释剂溶解并稀释含佐米胺浓度为2.5mg/ml，杂质i-8浓度为0.0025mg/ml溶液。
杂质对照品贮备溶液：分别取杂质i-1对照品、杂质i-7对照品、杂质i-8对照品置于同一量瓶中，加稀释剂溶解制备成浓度均为10μg/ml的溶液。
杂质对照品溶液：精密量取杂质对照品贮备溶液2.5ml，置10ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀。
步骤2、供试品溶液的配制：取佐米胺加稀释剂溶解并稀释至浓度为2.5mg/ml溶液。
对照溶液：精密量取供试品溶液用稀释剂稀释1000倍，摇匀。
步骤3、分别精密量取稀释剂、系统适用性溶液、杂质对照品溶液、对照溶液和供试品溶液各20μL，分别注入液相色谱仪，进行梯度洗脱，杂质i-1的检测波长为205nm，杂质i-7、杂质i-8和其他杂质的检测波长为230nm，记录色谱图。
优选的，分别按外标法以峰面积计算杂质i-1、杂质i-7和杂质i-8的含量，按主成分自身对照法计算其他杂质的含量。
或者，采用加校正因子的主成分自身对照法计算杂质i-7和杂质i-8的含量。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本专利申请提供的检测方法克服了佐米胺的主要杂质i-8与佐米胺，以及相邻杂质因极性相近而难以分离的问题，可有效达到佐米胺与杂质、以及杂质之间的良好分离，对佐米胺的杂质可以进行精确地定量检测和分析，从而实现对佐米胺质量的有效监控；
2、本发明采用双波长同时测定杂质i-1，以及杂质i-7、杂质i-8和其他杂质，该方法可快速、简单地检测佐米胺及其杂质，并对其精确定量，大大提升了药物分析工作的效率和准确性；进而保证佐米曲普坦的安全性和有效性；
3、在对比试验中，发现超出本申请限定范围的检测方法无法对杂质实现准确地检出和定量；本申请方法专属性强，检测灵敏度高，线性良好，检测方法耐用性好，色谱条件存在一定程度波动时不影响杂质的准确检出和定量。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为实施例1稀释剂在205nm波长下的色谱图；
图2为实施例1稀释剂在230nm波长下的色谱图；
图3为实施例1的系统适用性溶液在230nm波长下的色谱图；
图4为实施例1的对照品溶液在205nm波长下的色谱图；
图5为实施例1的对照品溶液在230nm波长下的色谱图；
图6为实施例1的对照溶液在230nm波长下的色谱图；
图7为实施例1的佐米胺供试品溶液在205nm波长下的色谱图；
图8为实施例1的佐米胺供试品溶液在230nm波长下的色谱图；
图9为实施例3的系统适用性溶液在230nm波长下的色谱图；
图10为实施例4的系统适用性溶液在230nm波长下的色谱图；
图11为实施例5的系统适用性溶液在230nm波长下的色谱图；
图12为实施例6的系统适用性溶液在230nm波长下的色谱图；
图13为实施例7的系统适用性溶液在230nm波长下的色谱图；
图14为实施例8的系统适用性溶液在230nm波长下的色谱图；
图15为实施例9的系统适用性溶液在230nm波长下的色谱图；
图16为实施例10的系统适用性溶液在230nm波长下的色谱图；
图17为实施例11的系统适用性溶液在230nm波长下的色谱图；
图18为实施例12的系统适用性溶液在230nm波长下的色谱图；
图19为实施例13的系统适用性溶液在230nm波长下的色谱图；
图20为实施例14的系统适用性溶液在230nm波长下的色谱图；
图21为实施例15的系统适用性溶液在230nm波长下的色谱图；
图22为对比例1的系统适用性溶液在230nm波长下的色谱图；
图23为对比例2的系统适用性溶液在230nm波长下的色谱图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
佐米胺及已知杂质的结构式为：
Figure BDA0003672143960000051
在本实施例中，采用外标法和主成分自身对照法分别计算佐米胺的不同杂质，其中，按外标法以峰面积计算杂质i-1、杂质i-7和杂质i-8的含量，计算方法参见2020年版《中国药典》第四部通则0512高效液相色谱法中关于外标法的规定；采用自身对照法计算其他杂质的含量，计算方法参见2020年版《中国药典》第四部通则0512高效液相色谱法中关于自身对照法的规定。
实施例1佐米胺有关物质的高效液相色谱检测
(1)检测条件
仪器：Waters Acquity Arc高效液相色谱仪；
检测波长：杂质i-1为205nm，杂质i-7、杂质i-8和其他杂质为230nm；
色谱柱：Sun Armor AQUA二十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；
稀释剂：0.02mol/L磷酸三钾溶液(用磷酸调节pH值至9.0)-乙腈(93:7)。
流动相A：0.02mol/L磷酸三钾溶液(用磷酸调节pH值至9.0)-乙腈(93:7)；
流动相B：乙腈-水(90:10)；
流动相C：甲醇；
梯度洗脱程序：在0～10分钟内，流动相A、流动相B和流动相C的体积比保持90:0:10不变；在10～16分钟内，流动相A、流动相B和流动相C的体积比由90:0:10线性渐变至85:5:10；在16～30分钟内，流动相A、流动相B和流动相C的体积比保持85:5:10不变；在30～40分钟内，流动相A、流动相B和流动相C的体积比由85:5:10线性渐变至75:15:10；在40～42分钟内，流动相A、流动相B和流动相C的体积比保持75:15:10不变；在42～54分钟内，流动相A、流动相B和流动相C的体积比由75:15:10线性渐变至47:43:10；在54～60分钟内，流动相A、流动相B和流动相C的体积比保持47:43:10不变；在60～61分钟内，流动相A、流动相B和流动相C的体积比由47:43:10线性渐变至90:0:10；在61～70分钟内，流动相A、流动相B和流动相C的体积比保持90:0:10不变。
流速：1.0mL/min；
柱温：25℃；
进样量：20μL。
(2)检测步骤
杂质i-8对照品贮备溶液：取杂质i-8对照品约10mg，精密称定，置100ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀。
系统适用性溶液：取佐米胺对照品约50mg，精密称定，精密量取杂质i-8对照品贮备溶液0.5ml，置同一20ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀。
供试品溶液：取佐米胺约25mg，精密称定，置10ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀。
对照溶液：精密量取供试品溶液1ml，置50ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml，置20ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀。
杂质对照品贮备溶液：分别取杂质i-1对照品、杂质i-7对照品、杂质i-8对照品各约10mg，精密称定，置100ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取5.0ml，置50ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀。
杂质对照品溶液：精密量取杂质对照品贮备溶液2.5ml，置10ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀。
分别精密量取稀释剂、系统适用性溶液、对照品溶液、对照溶液、供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，在205nm波长下对照品溶液色谱图中，杂质i-7、杂质i-1和杂质i-8依次出峰；系统适用性溶液色谱图中，理论板数按佐米胺峰计算不低于3000，佐米胺峰与杂质i-8峰之间的分离度应大于2.0，杂质i-8峰高的信噪比应大于80。
杂质i-1的检测波长为205nm，杂质i-7、杂质i-8和其他杂质的检测波长为230nm。
分别按外标法以峰面积计算杂质i-1、杂质i-7和杂质i-8的含量，按主成分自身对照法计算其他杂质的含量。
各个杂质的相对保留时间为：所述杂质i-1为0.45，所述杂质i-7为0.37，所述杂质i-8为1.35，其他杂质按照出峰顺序依次为1.42，1.64，2.60，3.25。
其中，图1和图2为稀释剂分别在205nm和230nm波长下的色谱图，可见，稀释剂对佐米胺有关物质的检测无干扰；图3为系统适用性溶液在230nm波长下的色谱图，佐米胺与杂质i-8分离度为8.7，可见，佐米胺与杂质i-8分离良好、且色谱峰峰形良好，保证定量的准确性，图4和图5分别为杂质对照品溶液在205nm和230nm波长下的色谱图，根据图4和图7的杂质对照品溶液和供试品溶液在205nm波长下色谱图参照外标法计算供试品中杂质i-1的含量，根据图5和图8的杂质对照品溶液和供试品溶液在230nm波长下色谱图参照外标法计算供试品中杂质i-7、i-8的含量，根据图6和图8的对照溶液和供试品溶液在230nm波长下的色谱图参照主成分自身对照法计算其他杂质的含量。
用上述方法分别对2104913、2105903两个批号的佐米胺进行检测，检测结果如下表1所示：
表1两批佐米胺样品的有关物质检测结果
批号 2104913 2105903
i-1(％) 未检出 未检出
i-7(％) 未检出 未检出
i-8(％) 0.05 0.04
其他最大单杂(％) 0.05 0.05
总杂(％) 0.17 0.21
计算公式：
Figure BDA0003672143960000081
式中：A供试为供试品溶液色谱图中特定杂质(杂质i-1、i-7、i-8)峰的面积；
A对照为对照品溶液色谱图中特定杂质峰的面积；
m供试为供试品的称样量，mg；
m对照为特定杂质对照品的称样量，mg；
V供试为供试品的稀释体积，ml；
V对照为特定杂质对照品的稀释体积，ml；
N为特定杂质对照品的含量。
Figure BDA0003672143960000082
式中：A杂质为供试品溶液色谱图中其他单个杂质峰的面积；
A对照为对照溶液色谱图中主峰的面积。
总杂(％)＝∑杂质(％)
由表1可知，本发明方法可以检测出佐米胺中有关物质，当有关物质总杂不高于1.0％，且杂质i-1、杂质i-7、杂质i-8、其他最大单杂均不高于0.1％时，则认为此批佐米胺产品合格；反之，如果高于这个比例，则佐米胺作为起始物料会影响佐米曲普坦原料药的质量，无法保证后期生产的药物制剂的安全性和有效性。
实施例2，验证试验
为了验证本技术方案设计的检测方法的专属性和准确性，进行了包括专属性试验、定量限与检测限试验、线性与范围试验、稳定性试验、精密度试验和准确度试验的方法学验证试验，结果如下：
2.1，专属性试验
准备稀释剂、浓度为100μg/ml的杂质i-1定位溶液、浓度为100μg/ml的杂质i-7定位溶液、浓度为100μg/ml的杂质i-8定位溶液、包含浓度均为2.5μg/ml的杂质i-1、杂质i-7、杂质i-8的杂质对照品溶液、浓度为2.5mg/ml的佐米胺供试品溶液、将佐米胺供试品溶液稀释1000倍制备的对照溶液，精密量取相同体积的以上溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。
试验结果表明，溶剂、主成分均不干扰杂质i-1、杂质i-7和杂质i-8与主成分中的非特定杂质的检测。杂质i-1、杂质i-7和杂质i-8、主成分与相邻峰均可达到基线分离，本方法专属性强。
2.2，定量限与检测限试验
分别称取杂质i-1对照品、杂质i-7对照品、佐米胺对照品与杂质i-8对照品各适量，精密称定，逐步加稀释剂并配制成一系列浓度的溶液。精密量取此溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，信噪比约为10:1，作为定量限溶液；信噪比约为3:1，作为检测限溶液。试验结果见表2。可见，本方法可以在较低的浓度下对各杂质检出或定量检测，本方法灵敏度高。
表2定量限与检测限试验数据
Figure BDA0003672143960000091
2.3，线性与范围试验
分别称取杂质i-1对照品、杂质i-7对照品、佐米胺对照品与杂质i-8对照品适量，精密称定，逐步加稀释剂定量制成浓度约为0.01μg/ml、0.5μg/ml、1.0μg/ml、2.0μg/ml、2.5μg/ml、3.5μg/ml和4.0μg/ml的溶液。
精密量取线性溶液各20μl，分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图。以各成分的浓度C(μg/ml)为横坐标，各成分的峰面积A为纵坐标，进行线性回归。试验结果见表3～表9。
表3杂质i-1线性与范围结果
Figure BDA0003672143960000101
表4杂质i-1线性与范围结果(不含定量限)
Figure BDA0003672143960000102
注1：此线性方程的斜率用于i-1校正因子的计算。
表5杂质i-7线性与范围结果
Figure BDA0003672143960000103
表6佐米胺205nm线性与范围结果
Figure BDA0003672143960000104
Figure BDA0003672143960000111
注2：此线性方程的斜率用于i-1校正因子的计算。
表7佐米胺230nm线性与范围结果
Figure BDA0003672143960000112
表8杂质i-8线性与范围结果
Figure BDA0003672143960000113
表9校正因子试验结果
Figure BDA0003672143960000114
试验结果表明，杂质i-1、杂质i-7、佐米胺、杂质i-8在浓度约为0.01μg/ml～4.0μg/ml范围内，各线性相关系数均大于0.99，本方法线性关系良好。
2.4，稳定性试验
按照实施例1方法配制稀释剂、对照品溶液、供试品溶液、对照溶液和加标供试品溶液。
取对照品溶液、供试品溶液、对照溶液与加标供试品溶液于8℃放置，分别于0h、5h、10h、15h、20h和25h时，精密量取20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，计算各时间点对照品溶液色谱图中杂质i-1、杂质i-7和杂质i-8峰面积与0h峰面积的比值及对照溶液色谱图中佐米胺峰面积与0h峰面积的比值，供试品溶液及加标供试品溶液色谱图中杂质i-1、杂质i-7和杂质i-8、其他最大单杂和总杂含量与0h杂质i-1、杂质i-7和杂质i-8、其他最大单杂和总杂含量的差值。试验结果见表10～表13。
表10对照品溶液稳定性试验结果
Figure BDA0003672143960000121
表11对照溶液稳定性试验结果
时间/h 佐米胺峰面积 与0小时峰面积比值(％)
0 144314 100.0
5 144183 99.9
10 144670 100.2
15 144418 100.1
20 144745 100.3
25 144677 100.3
表12供试品溶液稳定性试验结果
Figure BDA0003672143960000122
表13加标供试品溶液稳定性试验结果
Figure BDA0003672143960000123
Figure BDA0003672143960000131
根据结果可见，杂质对照品溶液及对照溶液8℃放置25h稳定性良好；供试品溶液和加标供试品溶液配制后于8℃放置25h，杂质个数未增加，杂质i-1、杂质i-7、杂质i-8及其他最大单杂的含量均未增大，加标供试品溶液总杂增大0.01％。试验结果表明，供试品溶液和加标供试品溶液8℃放置25h稳定性良好。
2.5，精密度试验
按照实施例1方法配制稀释剂、系统适用性溶液、对照品溶液、供试品溶液、对照溶液和加标供试品溶液，其中对照溶液和加标供试品溶液分别平行配制6份。
1重复性
分析人员1，精密量取稀释剂、系统适用性溶液、对照品溶液、供试品溶液、对照溶液和加标供试品溶液，分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图。分别按外标法以峰面积计算杂质i-1、杂质i-7和杂质i-8的含量和按照加校正因子的主成分自身对照法计算杂质i-7和杂质i-8的含量，按照不加校正因子的主成分自身对照法计算其他最大单杂的含量。试验结果见表14。
表14重复性试验结果
Figure BDA0003672143960000132
6份加标供试品溶液中外标法计算杂质i-1、杂质i-7和杂质i-8含量的RSD分别为1.0％、1.0％、1.8％，按照加校正因子的主成分自身对照法计算杂质i-7和杂质i-8的含量的RSD分别为1.7％和2.1％，总杂的RSD为2.7％，均小于3％，其他最大单杂含量的RSD为8.0％，小于10％。试验结果表明，本方法重复性良好。
2中间精密度
于不同日期，更换分析人员2，按照实施例1方法配制稀释剂、系统适用性溶液、对照品溶液、供试品溶液、对照溶液和加标供试品溶液，其中对照溶液和加标供试品溶液分别平行配制6份，在不同的高效液相色谱仪上同法测定。试验结果见表15。
表15中间精密度试验结果
Figure BDA0003672143960000141
12份供试品加标溶液中外标法计算杂质i-1、杂质i-7和杂质i-8含量的RSD分别为1.9％、1.5％和4.8％，按照加校正因子的主成分自身对照法计算杂质i-7和杂质i-8的含量的RSD分别为1.6％和3.9％，总杂的RSD为3.9％，均小于6％，其他最大单杂含量的RSD为9.9％，小于20％。试验结果表明，本方法精密度良好，且用外标法和加校正因子的主成分自身对照法计算的杂质i-7和杂质i-8的含量无显著差异。
2.6，准确度试验
杂质对照品贮备溶液：取杂质i-1对照品、杂质i-7对照品和杂质i-8对照品各适量，精密称定，加稀释剂溶解并定量稀释制成每1ml中各约含10μg的溶液，摇匀。
杂质对照品溶液：精密量取杂质对照品贮备溶液2.5ml，置10ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀。
供试品溶液：取佐米胺约25mg，精密称定，置10ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀。
50％回收率溶液：取佐米胺约50mg，精密称定，精密量取杂质对照品贮备溶液2.5ml，置同一20ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀。平行配制3份。
100％回收率溶液：取佐米胺约25mg，精密称定，精密量取杂质对照品贮备溶液2.5ml，置同一10ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀。平行配制3份。
150％回收率溶液：取佐米胺约50mg，精密称定，精密量取杂质对照品贮备溶液7.5ml，置同一20ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀。平行配制3份。
精密量取稀释剂、系统适用性溶液、杂质对照品溶液、供试品溶液与50％、100％、150％三个浓度的回收率溶液，分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算杂质i-1、杂质i-7和杂质i-8的检出量并计算回收率。试验结果见表16～表18。
表16杂质i-1准确度试验结果
Figure BDA0003672143960000151
表17杂质i-7准确度试验结果
Figure BDA0003672143960000161
表18杂质i-8准确度试验结果
Figure BDA0003672143960000162
在50％～150％限度浓度范围内，杂质i-1的回收率在97.92％～105.65％之间，平均回收率为102.3％，杂质i-7的回收率在99.88％～101.74％之间，平均回收率为100.7％，杂质i-8的回收率在95.28％～105.90％之间，平均回收率为100.0％。试验结果表明，本方法准确度较高。
实施例3
按照实施例1类似的检测方法，检测2105903批次佐米胺的有关物质，不同的是：其中，0.02mol/L磷酸三钾溶液(用磷酸调节pH值至8.8)，系统适用性溶液在230nm波长下的色谱图如图9所示。
实施例4
按照实施例1类似的检测方法，不同的是：其中，0.02mol/L磷酸三钾溶液(用磷酸调节pH值至9.2)，系统适用性溶液在230nm波长下的色谱图如图10所示。
实施例5
按照实施例1类似的检测方法，不同的是：其中，柱温为20℃，系统适用性溶液在230nm波长下的色谱图如图11所示。
实施例6
按照实施例1类似的检测方法，不同的是：其中，柱温为30℃，系统适用性溶液在230nm波长下的色谱图如图12所示。
实施例7
按照实施例1类似的检测方法，不同的是：其中，流速为0.8ml/min，系统适用性溶液在230nm波长下的色谱图如图13所示。
实施例8
按照实施例1类似的检测方法，不同的是：其中，流速为1.2ml/min，系统适用性溶液在230nm波长下的色谱图如图14所示。
实施例9
按照实施例1类似的检测方法，不同的是：其中，磷酸三钾溶液浓度为0.018mol/L，系统适用性溶液在230nm波长下的色谱图如图15所示。
实施例10
按照实施例1类似的检测方法，不同的是：其中，磷酸三钾溶液浓度为0.022mol/L，系统适用性溶液在230nm波长下的色谱图如图16所示。
实施例11
按照实施例1类似的检测方法，不同的是：其中，流动相A中磷酸盐与乙腈比例为95:5，系统适用性溶液在230nm波长下的色谱图如图17所示。
实施例12
按照实施例1类似的检测方法，不同的是：其中，流动相梯度程序中流动相A、流动相B和流动相C的体积比为88:0:12，系统适用性溶液在230nm波长下的色谱图如图18所示。
实施例13
流动相A、流动相B和流动相C的体积比按照实施例1类似的检测方法，不同的是：其中，流动相梯度程序中流动相A、流动相B和流动相C的体积比为92:0:8，系统适用性溶液在230nm波长下的色谱图如图19所示。
实施例14
按照实施例1类似的检测方法，不同的是：其中，流动相B中乙腈与水比例为88:12，系统适用性溶液在230nm波长下的色谱图如图20所示。
实施例15
按照实施例1类似的检测方法，不同的是：其中，流动相B中乙腈与水比例为92:8，系统适用性溶液在230nm波长下的色谱图如图21所示。
实施例3～15分别对流动相、柱温、流动相流速、磷酸三钾溶液浓度、流动相梯度程序中比例进行了调整，考察2105903批次佐米胺的有关物质的检出结果，如表19所示。
表19实施例3～15佐米胺杂质检测结果
Figure BDA0003672143960000181
以上系统适用性试验中，杂质i-8与佐米胺分离良好，其他杂质峰也可以良好分离，说明该方法可以准确检测佐米胺中的有关物质，且方法耐用性较好，对该产品的质量控制提供了更好的依据。
对比例1
按照实施例1类似的检测方法，不同的是：其中，色谱柱为C18柱，由图22系统适用性试验色谱图可见，杂质i-8峰形异常，无法准确定量。
对比例2
按照实施例1类似的检测方法，不同的是：其中，色谱柱为C8柱，由图23系统适用性试验色谱图可见，杂质i-8与前端异常峰无法良好分离，影响杂质的定量检测。
本发明所使用的试剂均可以从市场上购得。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.佐米胺有关物质的高效液相色谱检测方法，在高效液相色谱仪上进行佐米胺有关物质检测，其特征在于，其色谱条件包括：
色谱柱为二十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，以磷酸三钾溶液-乙腈为流动相A，乙腈-水为流动相B，甲醇为流动相C；杂质i-1的检测波长为205nm，杂质i-7、杂质i-8和其他杂质的检测波长为230nm；采用紫外检测器；采用如下梯度程序洗脱：
在0～10分钟内，流动相A、流动相B和流动相C的体积比保持88～92:0:8～12不变；在10～16分钟内，流动相A、流动相B和流动相C的体积比由88～92:0:8～12线性渐变至85:5:10；在16～30分钟内，流动相A、流动相B和流动相C的体积比保持85:5:10不变；在30～40分钟内，流动相A、流动相B和流动相C的体积比由85:5:10线性渐变至75:15:10；在40～42分钟内，流动相A、流动相B和流动相C的体积比保持75:15:10不变；在42～54分钟内，流动相A、流动相B和流动相C的体积比由75:15:10线性渐变至47:43:10；在54～60分钟内，流动相A、流动相B和流动相C的体积比保持47:43:10不变；在60～61分钟内，流动相A、流动相B和流动相C的体积比由47:43:10线性渐变至88～92:0:8～12；在61～70分钟内，流动相A、流动相B和流动相C的体积比保持88～92:0:8～12不变，即60分钟后为色谱柱平衡时间；
所述杂质i-1、杂质i-7、杂质i-8以及佐米胺的结构式如下：
Figure FDA0003672143950000011
2.根据权利要求1所述的佐米胺有关物质的高效液相色谱检测方法，其特征在于，所述磷酸三钾溶液配制方法为：取磷酸三钾，用水溶解并稀释，用磷酸调节pH值；所述磷酸三钾溶液浓度为0.018mol/L～0.022mol/L；所述磷酸三钾溶液pH值范围为8.8～9.2；所述流动相A中磷酸三钾溶液与乙腈体积比为95:5～93:7；流动相B中乙腈和水的体积比为88:12～92:8；柱温选自20～30℃；流动相流速选自0.8～1.2mL/min。
3.根据权利要求1所述的佐米胺有关物质的高效液相色谱检测方法，其特征在于，所述梯度洗脱程序为：在0～10分钟内，流动相A、流动相B和流动相C的体积比保持90:0:10不变；在10～16分钟内，流动相A、流动相B和流动相C的体积比由90:0:10线性渐变至85:5:10；在16～30分钟内，流动相A、流动相B和流动相C的体积比保持85:5:10不变；在30～40分钟内，流动相A、流动相B和流动相C的体积比由85:5:10线性渐变至75:15:10；在40～42分钟内，流动相A、流动相B和流动相C的体积比保持75:15:10不变；在42～54分钟内，流动相A、流动相B和流动相C的体积比由75:15:10线性渐变至47:43:10；在54～60分钟内，流动相A、流动相B和流动相C的体积比保持47:43:10不变；在60～61分钟内，流动相A、流动相B和流动相C的体积比由47:43:10线性渐变至90:0:10；在61～70分钟内，流动相A、流动相B和流动相C的体积比保持90:0:10不变，即60分钟后为色谱柱平衡时间。
4.根据权利要求1所述的佐米胺有关物质的高效液相色谱检测方法，其特征在于，所述色谱柱采用如下品牌的色谱柱：Sun Armor RP-AQUA C28。
5.根据权利要求1所述的佐米胺有关物质的高效液相色谱检测方法，其特征在于，所述的检测方法，还包括供试品溶液的配制，所述供试品溶液采用稀释剂溶解并稀释，所述稀释剂为0.02mol/L磷酸三钾溶液(用磷酸调节pH值至9.0)-乙腈(93:7)。
6.根据权利要求3所述的佐米胺有关物质的高效液相色谱检测方法，其特征在于，柱温为25℃，流动相A为磷酸三钾溶液-乙腈(93:7)，所述磷酸三钾溶液浓度为0.02mol/L，用磷酸调节pH值至9.0，流动相B为乙腈-水(90:10)，流速为1.0mL/min。
7.根据权利要求6所述的佐米胺有关物质的高效液相色谱检测方法，其特征在于，各个杂质的相对保留时间为：所述杂质i-1为0.45，所述杂质i-7为0.37，所述杂质i-8为1.35。
8.根据权利要求1所述的佐米胺有关物质的高效液相色谱检测方法，其特征在于，所述的检测方法，还包括如下步骤：
步骤1、系统适用性溶液、杂质对照品溶液的配制：
杂质i-8对照品贮备溶液：取杂质i-8对照品，加稀释剂溶解配制成浓度为0.1mg/ml溶液；
系统适用性溶液：取佐米胺对照品，精密量取杂质i-8对照品贮备溶液置同一量瓶中，加稀释剂溶解并稀释含佐米胺浓度为2.5mg/ml，杂质i-8浓度为0.0025mg/ml溶液；
杂质对照品贮备溶液：分别取杂质i-1对照品、杂质i-7对照品、杂质i-8对照品置于同一量瓶中，加稀释剂溶解制备成浓度均为10μg/ml的溶液；
杂质对照品溶液：精密量取杂质对照品贮备溶液2.5ml，置10ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀；
步骤2、供试品溶液的配制：取佐米胺加稀释剂溶解并稀释至浓度为2.5mg/ml溶液；
对照溶液：精密量取供试品溶液用稀释剂稀释1000倍，摇匀；
步骤3、分别精密量取稀释剂、系统适用性溶液、杂质对照品溶液、对照溶液和供试品溶液各20μL，分别注入液相色谱仪，进行梯度洗脱，杂质i-1的检测波长为205nm，杂质i-7、杂质i-8和其他杂质的检测波长为230nm，记录色谱图。
9.根据权利要求1所述的佐米胺有关物质的高效液相色谱检测方法，其特征在于，分别按外标法以峰面积计算杂质i-1、杂质i-7和杂质i-8的含量，按主成分自身对照法计算其他杂质的含量。
10.根据权利要求1所述的佐米胺有关物质的高效液相色谱检测方法，其特征在于，采用加校正因子的主成分自身对照法计算杂质i-7和杂质i-8的含量。
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