CN114113395B - 一种奥贝胆酸中对甲苯磺酸乙酯的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种奥贝胆酸中对甲苯磺酸乙酯的检测方法。该方法采用HPLC对奥贝胆酸样品中的对甲苯磺酸乙酯进行定量分析，检测步骤如下：步骤一、配制标准溶液和待测供试品溶液，包括标准储备溶液的配置，标准溶液的配置，供试溶液的配置；步骤二、选定色谱条件，选择色谱柱为ThermoSyncronisC18；流动相A为0.1％～0.3％的磷酸溶液用三乙胺调pH至3.0±0.2，流动相B为乙腈，稀释剂为甲醇，检测波长为225nm，选定梯度洗脱条件为50％A，0min～50％A，15min～25％A，20min～25％A，30min～50％A，35min～50％A，45min；对甲苯磺酸乙酯保存时间为13.5±0.1min；步骤三、进行色谱测定并计算奥贝胆酸中对甲苯磺酸乙酯的含量。
Description
技术领域
本发明涉及药品基因毒性杂质检测技术领域，具体是指一种奥贝胆酸中对甲苯磺酸乙酯的检测方法。
背景技术
原发性胆汁性肝硬化(PBC)是一种常见的自身免疫性肝胆疾病，目前，熊去氧胆酸是FDA唯一批准用于治疗PBC的药物，但熊去氧胆酸与法尼醇X受体激动剂的亲和力较低，临床上40％～50％患者对熊去氧胆酸的治疗效果并不明显；奥贝胆酸，又名6-α-乙基鹅去氧胆酸，6-乙基鹅去氧胆酸，是20年来首个研发用于治疗胆汁淤积性肝病的药物，针对熊去氧胆酸没有充分应答或不能耐受的患者，因此在市场上具有广阔的前景。
对甲苯磺酸作为奥贝胆酸合成过程中使用的催化剂，可能会和溶剂乙醇反应生成基因毒性杂质对甲苯磺酸乙酯。根据ICH对药品中基因毒性杂质残留的要求，计算出对甲苯磺酸乙酯每日最大摄入量为1.5μg/天，而奥贝胆酸的口服量最大为10mg/天，因此计算出奥贝胆酸中对甲苯磺酸乙酯的限度为150ppm/天(1ppm即为1ug/g或1g/t)。
对甲苯磺酸乙酯：英文名称：Ethyl p-toluenesulfonate，CAS：80-40-0，分子式：C9H12O3S；分子量：200.25，结构式如下所示：
近几年基因毒性杂质成为药物研究中关注的焦点，其可能会对DNA产生损害，引发癌症，对甲苯磺酸乙酯作为基因毒性杂质，因此必须严格控制。经检索，目前几乎没有关于奥贝胆酸中对甲苯磺酸乙酯残留检测方法的发明报道，而关于其它药物中对甲苯磺酸乙酯的残留检测方法的专利文件中多为UHPLC-MS的方法，该方法检测成本昂贵、操作复杂、对检测人员要求高，市场普及率不高。
发明内容
本发明的目的在于：克服现有技术中的不足之处，提供一种奥贝胆酸中对甲苯磺酸乙酯的检测方法，所采用的方法简单方便，将现有报道中昂贵的UHPLC-MS检测器更换为实验室中最普通常见的紫外检测器，且不需要对样品进行衍生化等预处理。该方法具有专属性强、灵敏度高，重复性好和准确性高等优点，能快速的对奥贝胆酸中的对甲苯磺酸乙酯进行定量分析。
为了实现上述目的，本发明采取以下技术方案：
一种奥贝胆酸中对甲苯磺酸乙酯的检测方法，采用HPLC检测方法对奥贝胆酸样品中的对甲苯磺酸乙酯进行定量分析，检测步骤如下：
步骤一、配制标准溶液和待测供试品溶液
1)标准储备溶液的配置：精密称定对甲苯磺酸乙酯，加稀释剂配制成浓度为0.02mg/ml的溶液a；
2)标准溶液的配置：移取溶液a，加稀释剂稀释，混匀，配制成浓度为0.2μg/ml的对甲苯磺酸乙酯的标准溶液b；
3)供试溶液的配置：取供试品精密称定，加稀释剂配制成浓度为80mg/ml的供试溶液c；
所述稀释剂为甲醇；
步骤二、选定色谱条件
色谱柱：Thermo Syncronis C18；
流动相A：0.1％～0.3％的磷酸溶液，用三乙胺调pH至3.0±0.2；
流动相B：乙腈；
检测波长：225nm；
梯度洗脱条件为：50％A，0min～50％A，15min～25％A，20min～25％A，30min～50％A，35min～50％A，45min；
所述对甲苯磺酸乙酯保存时间为13.5±0.1min；
步骤三、进行色谱测定并计算奥贝胆酸中对甲苯磺酸乙酯的含量
分别取溶液b和溶液c各20μl进样，按照外标法计算奥贝胆酸中对甲苯磺酸乙酯的含量。
本发明中，一种奥贝胆酸中对甲苯磺酸乙酯的检测方法，优选检测步骤如下：
步骤一、配制标准溶液和待测供试品溶液
1)标准储备溶液的配置：精密称定对甲苯磺酸乙酯50mg，置25ml容量瓶中，加色谱甲醇稀释至刻度，混匀；再精密移取1.0ml置100ml容量瓶中，加色谱甲醇稀释至刻度，混匀，得溶液a；
2)标准溶液的配置：移取1.0ml溶液a置100ml容量瓶中，加色谱甲醇稀释至刻度，混匀，即得对甲苯磺酸乙酯0.2μg/ml的标准溶液，得溶液b；
3)供试溶液的配置：取供试品800mg，精密称定，置10ml容量瓶中，加稀释剂溶解并定容至刻度，即得每1ml中含80mg的供试溶液，得溶液c；
步骤二、选定色谱条件
色谱柱：Thermo Syncronis C18；
流动相A：0.1％的磷酸溶液，三乙胺调pH至3.0；
流动相B：乙腈；
稀释剂：甲醇；
检测波长：225nm；
梯度洗脱条件为：50％A，0min～50％A，15min～25％A，20min～25％A，30min～50％A，35min～50％A，45min；
所述对甲苯磺酸乙酯保存时间为13.5±0.1min；
步骤三、进行色谱测定并计算奥贝胆酸中对甲苯磺酸乙酯的含量
分别取溶液b和溶液c各20μl进样，按照外标法计算奥贝胆酸中对甲苯磺酸乙酯的含量。
本发明中，优选色谱条件为：
色谱柱：Thermo Syncronis C18，250×4.6mm×5.0μm；
流动相A：1.0ml磷酸置于1000ml水中，用三乙胺调节pH至3.0；
流动相B：乙腈
稀释剂：甲醇
检测波长：225nm；
流速：1.0ml/min；
柱温：35℃；
进样量：20μl。
本发明的优点和有益效果如下：
1、本发明首次建立了用HPLC对奥贝胆酸定量测定的方法，使得药物中的基因毒性杂质对甲苯磺酸乙酯可以准确的控制在限度内，提高了用药的安全性。
2、本发明所述方法各化合物具有不同的保留时间，能实现良好分离。
3、本发明所述方法采用的是普通的HPLC和紫外检测器，降低了检测成本，提高了方法的普及性。
4、本发明所述方法中流动相A为1.0ml磷酸+1000ml水(用三乙胺调pH＝3.0)，不含缓冲盐，减小了对色谱柱和仪器管路的堵塞和损害，提高了色谱柱的使用寿命，降低了HPLC的维护频率。
5、本发明所述方法运用双泵梯度洗脱，分析时间只需45min/针，提高了分析效率。
6、本发明所述方法具有专属性强、灵敏度高(检测限为0.2ppm，定量限为0.5ppm)，准确性好(回收率为93.67％～98.71％，RSD为1.34％)等优点，能快速、准确的检测出奥贝胆酸对甲苯磺酸乙酯的含量。
附图说明
图1为对甲苯磺酸乙酯对照品色谱图；
图2为奥贝胆酸供试品色谱图；
图3为空白溶液(甲醇)色谱图；
图4为混合溶液色谱图；
图5为对甲苯磺酸线性曲线结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
实施例
本实施例采用HPLC检测方法对奥贝胆酸样品中的对甲苯磺酸乙酯进行定量分析，具体操作步骤如下：
步骤一、配制标准溶液和待测供试品溶液
1)标准储备溶液的配置：精密称定对甲苯磺酸乙酯50mg，置25ml容量瓶中，加色谱甲醇稀释至刻度，混匀；再精密移取1.0ml置100ml容量瓶中，加色谱甲醇稀释至刻度，混匀，得溶液a；
2)标准溶液的配置：移取1.0ml溶液a置100ml容量瓶中，加色谱甲醇稀释至刻度，混匀，即得对甲苯磺酸乙酯0.2μg/ml的标准溶液，得溶液b；
3)供试溶液的配置：精密称定供试品13mg，置10ml容量瓶中，加稀释剂溶解并定容至刻度，即得每1ml中含1.3mg的供试溶液，得溶液c；
所述稀释剂为甲醇。
步骤二、选定色谱条件
色谱柱：Thermo Syncronis C18，250×4.6mm×5.0μm；
流动相A：1.0ml磷酸置于1000ml水中，用三乙胺调节pH至3.0；
流动相B：乙腈
检测波长：225nm；
流速：1.0ml/min；
柱温：35℃；
进样量：20μl；
梯度洗脱程序见下表1。
表1流动相梯度洗脱程序
| 时间(min) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0 | 50 | 50 |
| 15 | 50 | 50 |
| 20 | 25 | 75 |
| 30 | 25 | 75 |
| 35 | 50 | 50 |
| 45 | 50 | 50 |
步骤三、进行色谱测定并计算奥贝胆酸中对甲苯磺酸乙酯的含量
分别取标准溶液b和供试溶液c各20μl进样，在本发明所述的色谱条件下，测出其峰面积(如图1和图2所示)。由图1和图2可知，在本发明所述的色谱条件下，奥贝胆酸的保留时间为27.4min，对甲苯磺酸乙酯的保留时间为13.5min。
按照外标法计算奥贝胆酸对甲苯磺酸乙酯的含量，由图1和图2可知，对甲苯磺酸乙酯对照的浓度C对为0.2039μg/ml，峰面积A对为0.2522，供试溶液中对甲苯磺酸乙酯的峰面积由图谱可知未检出，即A供为0，由公式计算出供试品中对甲苯磺酸乙酯的浓度C供为0μg/ml，其与供试溶液的浓度的比值为百分比浓度，即为0％，即供试溶液中未检出对甲苯磺酸乙酯。
方法学考察
1.专属性实验
取适量色谱甲醇，作空白溶液。
称取13mg奥贝胆酸供试品，置10ml容量瓶中，用溶液b定容至刻度，摇匀，得溶液d。
称取奥贝胆酸中的起始原料7-酮基胆石酸对照10mg，置10ml容量瓶中，加色谱甲醇定容至刻度，即得7-酮基胆石酸储备液，再精密移取1.0ml稀释至10ml，摇匀，得溶液e。
称取奥贝胆酸中的起始原料对甲苯磺酸10mg，置10ml容量瓶中，加色谱甲醇定容至刻度，即得对甲苯磺酸储备液，再精密移取1.0ml稀释至10ml，摇匀，得溶液f。
称取奥贝胆酸中的中间体OB0610mg，置10ml容量瓶中，加色谱甲醇定容至刻度，即得OB06储备液，再精密移取1.0ml稀释至10ml，摇匀，得溶液g。
称取13mg奥贝胆酸供试品，置10ml容量瓶中，再分别移取上述7-酮基胆石酸储备液、对甲苯磺酸储备液、OB06储备液各1.0ml，用溶液b定容至刻度，摇匀，得混合溶液h。
取空白溶液和b、d、e、f、g、混合溶液h各20μl进样，进行色谱分析，如图3空白溶液(甲醇)色谱图和图4混合溶液色谱图所示，空白溶液和各杂质对对甲苯磺酸乙酯出峰均无干扰(各杂质的保存时间统计如表2所示)，对甲苯磺酸乙酯与相邻杂质峰分离度效果好，且理论塔板数大于8000，拖尾因子在0.8～1.2范围内。
表2奥贝胆酸中各杂质的保存时间
结论：该方法用于测定对甲苯磺酸乙酯含量专属性良好。
2、检测限、定量限实验
配制一系列不同浓度的对甲苯磺酸乙酯溶液，当连进6针信噪比在3～6范围内对应的浓度与供试品浓度的比值为检测限，信噪比在10～15范围内对应的浓度与供试品浓度的比值为定量限；实验结果如下，检测限浓度为0.016μg/ml，定量限浓度为0.04μg/ml，见表4、5：
表4检测限检测结果
| 检测限 | 保留时间min | 峰面积 | 信噪比 |
| 1 | 13.540 | 0.0107 | 6.4 |
| 2 | 13.570 | 0.0192 | 6.6 |
| 3 | 13.535 | 0.0200 | 5.9 |
| 4 | 13.555 | 0.0182 | 5.9 |
| 5 | 13.567 | 0.0179 | 5.8 |
| 6 | 13.578 | 0.0179 | 7.4 |
| 平均值 | 13.558 | 0.0173 | 6.3 |
表5定量限检测结果
奥贝胆酸可配制的浓度为80mg/ml，因此，推测出该方法用于检测奥贝胆酸中对甲苯磺酸乙酯的检测限为0.2ppm，定量限为0.5ppm。
3、线性范围试验
分别配制浓度为0.0407、0.0810、0.1214、0.1619、0.2024、0.2429、0.2834μg/ml的对照品溶液，每份溶液进样3次，配制各浓度及方法如表6所示。
表6线性结果
以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制线性曲线如图5所示，得线性方程为Y＝1.1201X+0.002，相关系数R＝0.999。
结论：该方法下，对甲苯磺酸乙酯在0.0407μg/ml～0.2834μg/ml浓度范围内，峰面积与浓度有良好的线性关系。
4、重复性试验
取标准溶液连进6针，考察系统适用性，再配制6份供试溶液进行重复性试验，结果6针标准溶液峰面积RSD＝0.70％，6份供试溶液均未检出对甲苯磺酸乙酯；另一实验员在不同日期、不同仪器上重复上述试验，结果6针标准溶液峰面积RSD＝1.20％，6份供试溶液均未检出对甲苯磺酸乙酯，结果见表7：
表7重复性试验结果
结论：由上表数据可知，该方法的重复性良好。
5、准确度验证
取对甲苯磺酸乙酯对照品50.48mg，精密称定，置20ml容量瓶中，加稀释剂溶解并定容至刻度，再精密移取1.0ml置25ml容量瓶中，加稀释剂溶解并定容至刻度，最后精密移取1.0ml置100ml容量瓶中，加稀释剂溶解并定容至刻度，即得溶液i。
取供试品32.5mg，精密称定，置25ml容量瓶中，平行9份，加适量稀释剂溶解，分别精密移取4.0ml、5.0ml、6.0ml溶液i置上述25ml容量瓶中，每个体积平行移取3份，共9份，加稀释剂定容至刻度，摇匀，即得，每份溶液进样2针。标准溶液及回收溶液的准确度计算结果见表8：
表8准确度计算结果
结论：由上表结果可知，本方法的精密度良好。
6、方法耐用性考察
称取13mg供试品，置10ml容量瓶中，用溶液b定容至刻度，摇匀，得溶液j，平行3份。
分别修改原色谱条件中的柱温(±2℃)、流速(±0.1ml/min)、流动相pH值(±0.2)以及色谱柱(不同批号)，再将溶液j进样分析，计算回收率，结果见表9。
表9方法耐用性考察结果
| 耐用性条件 | 回收率 | RSD |
| 33℃ | 94.75％ | 1.36％ |
| 37℃ | 93.54％ | 1.74％ |
| 0.9ml/min | 91.19％ | 0.38％ |
| 1.1ml/min | 91.93％ | 2.33％ |
| pH2.8 | 91.57％ | 1.01％ |
| pH3.2 | 96.76％ | 1.10％ |
| 更换色谱柱 | 96.41％ | 1.39％ |
结论：样品含量测定的结果均在验证方案要求的范围内(回收率相对偏差≤0.6％)，说明在测定条件有小的变动时，测定条件符合耐用性要求。
7、溶液稳定性试验
将配制好的标准溶液和供试溶液室温放置7天，分别于放置1、2、5、7天后进样，与当天新鲜配制的标准溶液同时进样分析，计算回收率，结果见表10。
表10溶液稳定性试验结果
结论：由上表可知，常温下7天未检出杂质，供试溶液稳定性良好。
8、供试品检测实验
利用本发明所述方法步骤检测3批市场上的奥贝胆酸供试品，结果如表11。
表11供试品检测结果
由上表可知，批号为1、2、3的供试品中均未检出对甲苯磺酸乙酯。
通过以上方法考察学实验可知，本发明提供的方法能够准确、可靠的检测奥贝胆酸中对甲苯磺酸乙酯的残留。
Claims (2)
1.一种奥贝胆酸中对甲苯磺酸乙酯的检测方法，采用HPLC检测方法对奥贝胆酸样品中的对甲苯磺酸乙酯进行定量分析，其特征在于，所述检测步骤如下：
步骤一、配制标准溶液和待测供试品溶液
1）标准储备溶液的配置：精密称定对甲苯磺酸乙酯，加稀释剂配制成浓度为0.02mg/ml的溶液a；
2）标准溶液的配置：移取溶液a，加稀释剂稀释，混匀，配制成浓度为0.2μg/ml的对甲苯磺酸乙酯的标准溶液b；
3）供试溶液的配置：取供试品精密称定，加稀释剂配制成浓度为80mg/ml的供试溶液c；
所述稀释剂为甲醇；
步骤二、选定色谱条件
色谱柱：Thermo Syncronis C18；
流动相A：0.1%～0.3%的磷酸溶液，用三乙胺调pH至3.0±0.2；
流动相B：乙腈；
检测波长：225nm；
梯度洗脱条件为：50%A，0min～50%A，15min～25％A，20min～25％A，30min～50％A，35min～50%A，45min；
所述对甲苯磺酸乙酯保存时间为13.5±0.1min；
步骤三、进行色谱测定并计算奥贝胆酸中对甲苯磺酸乙酯的含量
分别取溶液b和溶液c各20μl进样，按照外标法计算奥贝胆酸中对甲苯磺酸乙酯的含量。
2.根据权利要求1所述的奥贝胆酸中对甲苯磺酸乙酯的检测方法，其特征在于，所述色谱条件为：
色谱柱：Thermo Syncronis C18，250×4.6mm×5.0μm；
流动相A：1.0ml磷酸置于1000ml水中，用三乙胺调节pH至3.0；
流动相B：乙腈
稀释剂：甲醇
检测波长：225nm；
流速：1.0ml/min；
柱温：35℃；
进样量：20μl。
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