CN113702525A - 一种用hplc测定土霉素注射液中土霉素含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用HPLC测定土霉素注射液中土霉素含量的方法，通过进行流动相和提取液的配比，达到将制剂中的主要成分逐一分离并进行含量的测定，能有效检测0.05mg/ml到0.5mg/ml浓度范围的土霉素注射液。该方法结果准确、可靠，能大幅度提高检测效率，具有很强的实用性与推广价值。
Description
技术领域
本发明属于制剂分析领域，具体涉及一种用HPLC测定土霉素注射液中土霉素含量的方法。
背景技术
目前对于土霉素注射液中土霉素含量的测定方法有如下几种：
方法一：国内现行质量标准的检测方法为抗生素生物检定法为：精密称取本品适量，加灭菌水稀释制成每1ml中约含1000单位的溶液，照抗生素微生物检定法测定，另取本品，同时测其相对密度，将供试品量换算成毫升计数，计算。
方法二：精密称取土霉索标准品50mg于100mL容量瓶中，加0.1mol/L盐酸溶液10mL使之溶解，并用水稀释成0.5mg/mL，摇匀，作为标准储备液。绘制标准曲线分别精密量取上述标准储备液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL至100mL容量瓶中，用0.01mol/L盐酸溶液分别稀释成5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、30.0ug/mL标准溶液。以0.01mol/L盐酸溶液为空白，照紫外分光光度法，在268nm波长处测定其吸光度。精密量取长效土霉素注射液1mL，置200mL容量瓶中，用0.01mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀；再精密量取3mL，置200mL容量瓶中加0.01mol/L盐酸溶液稀释成15ug/mL，摇匀，以0.01mol/L盐酸溶液为空白，在268nm处测定其吸收，并计算。(《紫外分光光度法测定长效土霉素注射液含量方法的建立》，冯学忠等，动物医学进展，2009，30(9)，65-68)。
方法三：色谱条件：流动相为0.05mol/L草酸铵溶液一二甲基甲酰胺-0.2mo]/L磷酸氢二铵溶液(75+20+5)，用氨水调pH8.0±0.2，流速为每分钟0.8mL，柱温35℃，检测波长为280nm，进样量20uL。
样品检测：取本品约0.6g(精确至0.0002g)，置人200ml量瓶中，加0.01moL盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，精密量取10ml，置50mL容量瓶中，用0.01moL盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。另取土霉素化学对照品约25mg(精确至0.0002g)。置入50mL容量瓶中，加0.1moL盐酸溶液5mL使溶解后，加水稀释至刻度，摇匀，作为贮备液(须当日使用或放冰箱保存)。精密量取贮备液10ml，置50mL量瓶中，用0.01mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液，上机，按外标法进行计算。(《高效液相色谱法测定土霉素注射液含量》，韦勤等，福建分析测试，2010,19(3),26-29)。
方法一的不足之处在于抗生素生物检定法测定耗时且准确度低，方法二的不足之处在于紫外可见分光光度法检测准确度低，灵敏度差，方法三的不足之处在于色谱柱使用范围应选择pH大于8.0的宽泛色谱柱，成本偏高。
发明内容
针对于上述介绍的三种方法的不足之处，本发明解决了土霉素注射液含量检测效率和准确度的问题。采用HPLC方法替代传统的生物检定法的检测土霉素含量的方法，通过进行流动相和提取液的配比，达到将制剂中的主要成分逐一分离并进行含量的测定。本发明提高了主成分与2-乙酰-2-去酰胺土霉素峰的分离，提高了溶液放置稳定性。该测定方法稳定、准确度高，能很好的指导兽药临床对药物有效成分含量的检测，能大幅度提高监测效率。
本发明的技术方案为：提供一种用HPLC测定土霉素注射液中土霉素含量的方法，包括以下步骤：
步骤一，配制供试样品溶液，称量相当于0.36-0.44g土霉素的土霉素注射液，用0.01mol/L盐酸溶液作为提取液溶解提取并稀释；较优选的稀释配比为用0.01mol/L盐酸溶液稀释土霉素注射液，所述土霉素：盐酸溶液的质量体积比为0.36-0.44mg：200ml，继续取该溶液适量用0.01mol/L盐酸溶液稀释至5倍体积，摇匀，作为供试品溶液；
步骤二，配制土霉素对照品溶液，加0.01mol/L盐酸溶液制成每1ml中约含土霉素0.36-0.44mg的溶液；
步骤三，设置HPLC检测条件：所述HPLC采用流动相等度洗脱方法，所述流动相包括流动相A、流动相B和流动相C，流动相A为醋酸铵-乙二胺四醋酸二钠溶液；流动相B为乙腈；流动相C为乙醇胺，所述流动相A、流动相B和流动相C等度洗脱比例为90：10：1；
步骤四，进行系统适应性检测；
步骤五，精密量取供试样品溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图1；另取土霉素对照品溶液，注入液相色谱仪，记录色图谱2，按外标法以峰面积计算供试品中土霉素含量。
本发明涉及的等度洗脱比例为：
| 流动相A(％) | 流动相B(％) | 流动相C(％) |
| 90％ | 10％ | 1％ |
本发明涉及的流动相为：流动相A醋酸铵-乙二胺四醋酸二钠溶液，为0.25mol/L醋酸铵溶液和0.05mol/L乙二胺四醋酸二钠溶液按照体积比100：10配制成的混合液，摇匀后，再用醋酸调节pH值至6.5-7.2，优选为7.0。流动相B为乙腈；流动相C为乙醇胺。
本发明所使用的提取液的配制方法为：取盐酸9ml加水定容至100ml，混合均匀后，取10ml到1L容量瓶中，加水定容至刻度，混合均匀。
本发明的技术方案中HPLC色谱条件为：采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(C18，4.6mm×250mm，5μm)；检测波长为280nm；柱温40℃；进样量为10μl；采用流动相等度洗脱方法，以醋酸铵溶液-乙腈-乙醇胺为流动相，按照90：10：1比例等度洗脱方法。
HPLC系统适应性检测方法：
(1)取4-差向四环素对照品适量，加入0.01mol/L盐酸溶液溶解并稀释制成每1ml中含4-差向四环素0.5mg的4-差向四环素溶液；
(2)取约含3％的2-乙酰-2-去酰胺土霉素的土霉素对照品(市售)适量，加少量0.1mol/L盐酸溶液溶解，用水稀释制成每1ml中含土霉素0.5mg的土霉素溶液；
(3)取上述(1)和(2)中配制的4-差向四环素溶液和土霉素溶液按照体积比1：24的比例混合制成混合溶液作为系统适应性溶液。所配制的系统适应性检测溶液中每1ml溶液中约含4-差向四环素20μg，土霉素480μg，约含2-乙酰-2-去酰胺土霉素14.5μg。
(4)按照预先设置的HPLC检测条件，取系统适应性溶液10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，出峰顺序为差向四环素峰(与土霉素峰相对保留时间约为0.9)、土霉素峰、2-乙酰-2-去酰胺土霉素峰(与土霉素峰相对保留时间约为1.1)。
系统适应性检测结果为4-差向四环素峰与土霉素峰间的分离度应大于2.0，土霉素峰与2-乙酰-2-去酰胺土霉素峰间的分离度应大于2.5，符合要求。
优选的检测步骤为：
步骤一，配制供试样品，称量相当于0.36-0.44g土霉素的土霉素注射液，置于200ml量瓶中，加入0.01mol/L盐酸溶液溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取5ml，置25ml量瓶中，用0.01mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；
步骤二，配制土霉素对照品，取土霉素标准品，加人0.01mol/L盐酸溶液作为提取液制成每1ml中含0.36-0.44mg土霉素的溶液；
步骤三，设置HPLC检测条件，设置HPLC检测条件为用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，规格为4.6mm×250mm，流速为5μm；检测波长为280nm；柱温40℃；进样量为10μl；HPLC流动相为等度洗脱方法，流动相包括流动相A、流动相B和流动相C，流动相A为醋酸铵-乙二胺四醋酸二钠溶液；流动相B为乙腈；流动相C为乙醇胺，所述流动相A、流动相B和流动相C等度洗脱比例为90：10：1；所述流动相A醋酸铵-乙二胺四醋酸二钠的配制方法为将0.25mol/L醋酸铵溶液和0.05mol/L乙二胺四醋酸二钠溶液按照体积比100：10配制成的混合液，摇匀后，用醋酸调节pH值至7.0；
步骤四，进行系统适应性检测，(1)取4-差向四环素对照品，加入0.01mol/L盐酸溶液溶解并稀释制成每1ml中含4-差向四环素0.5mg的4-差向四环素溶液；(2)取土霉素对照品，加少量0.1mol/L盐酸溶液溶解，用水稀释制成每1ml中含土霉素0.5mg的土霉素溶液；(3)将所述(1)和)(2)配制的4-差向四环素溶液和土霉素溶液按照体积比1：24混合制成的混合溶液作为系统适应性检测溶液；(4)取系统适应性检测溶液10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，出峰顺序依次为差向四环素峰、土霉素峰、2-乙酰-2-去酰胺土霉素峰，所述差向四环素峰与土霉素峰相对保留时间约为0.9，所述2-乙酰-2-去酰胺土霉素峰与土霉素峰相对保留时间约为1.1；系统适应性检测的结果应为4-差向四环素峰与土霉素峰间的分离度应大于2.0，土霉素峰与2-乙酰-2-去酰胺土霉素峰间的分离度应大于2.5，符合系统适应性要求；
步骤五，精密量取供试样品溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图1；另取土霉素对照品溶液，同法测定，记录色图谱2，另取本品，同时测定其相对密度，将供试品量换算成ml数计算，即得，按外标法以峰面积计算出供试品中土霉素(C22H24N2O9)的含量。
本发明的一种用HPLC测定土霉素注射液中土霉素含量的方法，用于检测0.05mg/ml到0.5mg/ml浓度范围的土霉素注射液，效果最佳。
本发明的有益效果是：
本发明为方法学发明，此方法基于HPLC法建立，采用HPLC方法替代传统的生物检定法的检测土霉素含量的方法，通过进行流动相和提取液的配比，达到将制剂中的主要成分逐一分离并进行含量的测定。该测定方法稳定、准确度高，能很好的指导兽药临床对药物有效成分含量的检测，能大幅度提高检测效率。并且与2-乙酰-2-去酰胺土霉素分离效果良好。
对比现有常规土霉素的检测方法，本发明采用通用型色谱柱和紫外检测器便可以达到检测的目的，且操作简单方便精确度较高，在耗材的使用上也大大的降低了成本，使用配有紫外检测器的高效液相色谱仪即可。相对背景技术中方法三的高效液相色谱检测方法，本发明在主成分与2-乙酰-2-去酰胺土霉素峰的分离和溶液放置稳定性方面与本发明也有显著优势，对比情况如下表；
| 方法三 | 本发明 | |
| 主成分与2-乙酰-2-去酰胺土霉素峰的分离 | ≥1.5 | ≥2.5 |
| 放置稳定性 | 5h | 12h |
附图说明：
图1流动相pH6.5的HLPC图谱；
图2流动性pH7.0的HLPC图谱；
图3流动性pH7.2的HLPC图谱；
图4流动相pH7.5的HLPC图谱；
图5动相柱温35℃的HLPC图谱；
图6流动相柱温45℃的HLPC图谱；
图7流动相流速0.8ml/min的HLPC图谱；
图8流动相流速1.2ml/min的HLPC图谱；
图9空白溶剂的HLPC图谱；
图10空白辅料的HLPC图谱；
图11土霉素对照品溶液的HLPC图谱；
图12土霉素供试品溶液的HLPC图谱；
图13土霉素浓度为0.05mg/ml的HLPC图谱；
图14土霉素浓度为0.1mμg/ml的HLPC图谱；
图15土霉素浓度为0.2mg/ml的HLPC图谱；
图16土霉素浓度为0.4mg/ml的HLPC图谱；
图17土霉素浓度为0.5mg/ml的HLPC图谱；
图18土霉素浓度和峰面积关系图。
具体实施方式
以下实施例是用以说明本发明的优选的实施方案，本领技术人员应当理解，以下描述不应用于限制本发明的保护范围。
实施例一：一种检测土霉素注射液含量的HPLC方法
待检样品：土霉素注射液(10ml：20g)。
照本发明方法进行测定。
色谱条件与系统适用性试验，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(C18，4.6mm×250mm，5μm)；以醋酸铵溶液[0.25mol/L醋酸铵溶液-0.05mol/L乙二胺四醋酸二钠溶液(100：10)，用醋酸调节pH值至7.0]-乙腈-乙醇胺(90：10：1)为流动相；检测波长为280nm；柱温40℃；取4-差向四环素对照品适量，加0.01mol/L盐酸溶液溶解并稀释制成每1ml中约含0.5mg的溶液；取土霉素对照品(约含3％的2-乙酰-2-去酰胺土霉素)适量，加少量0.1mol/L盐酸溶液溶解，用水稀释制成每1ml中约含土霉素0.5mg的溶液，取上述两种溶液(1：24)混合制成每1ml中约含4-差向四环素20μg和土霉素480μg(约含2-乙酰-2-去酰胺土霉素14.5μg)的混合溶液作为分离度溶液。取该溶液10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，出峰顺序为差向四环素峰(与土霉素峰相对保留时间约为0.9)、土霉素峰、2-乙酰-2-去酰胺土霉素峰(与土霉素峰相对保留时间约为1.1)。4-差向四环素峰与土霉素峰间的分离度应大于2.0，土霉素峰与2-乙酰-2-去酰胺土霉素峰间的分离度应大于2.5。
测定法，精密称定本品适量(约相当于土霉素0.4g)，置200ml量瓶中，加0.01mol/L盐酸溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，置25ml量瓶中，用0.01mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液，精密量取10μl注入液相色谱仪，记录色谱图；另取土霉素对照品适量，加0.01mol/L盐酸溶液制成每1ml中约含土霉素0.4mg的溶液。另取本品，同时测定其相对密度，将供试品量换算成ml数计算，即得，按外标法以峰面积计算出供试品中土霉素(C22H24N2O9)的含量。
实施例二：本发明耐用性的考察:
本发明在含量测定方法上选择250mm长的C18色谱柱，耐用性重点考察了流动相不同pH、柱温、流速以及流动相比例对测定方法的影响。
1.流动相pH值对含量测定方法的影响
为了考察流动相pH值对含量检测方法的影响，分别配制流动相ApH6.5、7.0、7.2、7.5四个流动相，其他条件相同，分别记录色谱图，比较理论塔板数、分离度、保留时间、含量，结果如下表1所示。
表1流动相不同pH对土霉素检测的影响
由表1得出，当流动相pH值达到6.5后，土霉素的保留时间显著提前，pH值达到7.5后，土霉素的保留时间后移，可以看出在流动相pH值在6.5-7.2范围内，分离度、含量均符合规定，pH值在7.5时分离度明显降低，不符合要求，说明流动相pH在6.5-7.2范围内，土霉素较稳定，保留时间、分离度、含量均达到最佳。以流动相pH值在7.0为最佳。
2.柱温对本发明的影响
为了考察柱温变化对本发明的影响，试验中通过柱温箱控制柱子温度，设定了35℃、40℃、45℃三个条件，分别采集相应温度下样品的色谱信号，比较不同温度下色谱图参数中分离度、理论塔板数、保留时间、含量，结果如下表2所示。
表2柱温对土霉素检测的影响
| 柱温(℃) | 保留时间(min) | 理论塔板数 | 分离度 | 含量(标示量的％) |
| 35 | 19.901 | 13574 | 2.63 | 99 |
| 40 | 18.763 | 14840 | 2.86 | 99 |
| 45 | 19.325 | 16348 | 3.04 | 100 |
通过上表2数据可以看出，随柱温的升高，土霉素的保留有所差异，但不显著；不同温度下，土霉素的塔板数、分离度和含量均符合规定；由此可以看出柱温对土霉素的影响较少。
3.流速对本发明的影响
为了考察流速对本发明的影响，试验中通过四元泵对流速进行控制，设定了0.8ml/min、1.0ml/min和1.2ml/min三个条件，分别采集相应流速下的样品色谱信号，比较不同流速下色谱图参数中的分离度、理论塔板数、保留时间和含量，结果如下表3所示。
表3流速对土霉素检测的影响
| 流速(ml/min) | 保留时间(min) | 理论塔板数 | 分离度 | 含量(标示量的％) |
| 0.8 | 23.899 | 16513 | 2.95 | 99 |
| 1.0 | 18.763 | 14840 | 2.86 | 99 |
| 1.2 | 15.593 | 13353 | 2.75 | 99 |
通过上表3数据可以看出，随着流速的增加，土霉素的保留提前较为显著，不同流速下，土霉素的塔板数、分离度含量均符合规定，由此可以看出流速对土霉素的影响较少。
流动相不同pH、柱温和流速的HLPC图谱分别见附图1-附图8。
实施例三、一种检测土霉素注射液含量的HPLC方法的专属性试验
分别将土霉素注射液所需的空白辅料、空白溶剂、土霉素对照品溶液、供试品溶液按照本发明的检测方法进行处理，上机。从图谱中可以看出，空白辅料及溶剂对土霉素未产生影响，得到的图谱分别见说明书附图9-附图12。
实施例四：一种检测土霉素注射液含量的HPLC方法的线性关系实验
由于本检测方法中土霉素考察浓度为0.4mg/mL，因此本实施例选择了将土霉素用提取液制成浓度分别为0.05mg/ml、0.1mμg/ml、0.2mg/ml、0.4mg/ml和0.5mg/ml的溶液，摇匀，分别精密量取10μl对照品溶液注入液相色谱仪中，记录色谱图，以峰面积为纵坐标，样品浓度为横坐标进行线性回归，得到的线性图谱分别见说明书附图12附图16。
表4线性关系试验结果
根据上述表格中的数值，得出了土霉素浓度和峰面积的回归方程y＝16740x+4.4086，线性关系数R2＝0.9999。浓度在0.05-0.5mg/ml范围内，土霉素浓度与峰面积呈良好的线性关系。
实施例五：一种检测土霉素注射液含量的HPLC方法的重复性考察
用0.01mol/L盐酸溶液将土霉素配制成浓度为0.4mg/ml的溶液；摇匀过滤，进10μl，注入液相色谱仪，连续进样5次，记录色谱图；结果见下表5所示。
表5重复性试验的考察
| 次数 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | RSD(％) |
| 土霉素面积 | 6747.6 | 6926.5 | 6908.6 | 6843.1 | 6905.8 | 1.1 |
实验结果表明，重复性中峰面积测量值的RSD小于2.0％说明该方法对本品具有适用性。
实施例六：一种检测土霉素注射液含量的HPLC方法的中间精密度试验
不同检测人员分别精密称定天津中升挑战生物科技有限公司土霉素注射液，本发明的方法进行方法的中间精密度试验，由不同操作者，使用不同仪器、于不同时间，照本发明含量测定项下方法操作，结果见表6。
表6土霉素注射液中间精密度试验
由上表得出，在不同人员，不同日期测定样品中土霉素含量，六次测定的结果相对标准偏差小于2.0％，说明本实验方法中间精密度符合要求。
实施例七：一种检测土霉素注射液含量的HPLC方法的准确度试验
精密称定天津中升挑战生物科技有限公司土霉素注射液所需的辅料成分，9份空白溶液，按照土霉素添加率为80％、100％和120％分别制成各3个制剂，共9份样品，按照本发明检测方法进行检测，结果见表7。
表7土霉素注射液准确度试验
实验结果表明添加量在80％～120％范围内，回收率均在98％～102％之间，方法准确、可靠。
Claims (10)
1.一种用HPLC测定土霉素注射液中土霉素含量的方法，其特征在于，包括以下步骤，
步骤一，配制供试样品溶液，称量含0.36-0.44g土霉素的土霉素注射液，用0.01mol/L盐酸溶液作为提取液进行溶解提取并稀释；
步骤二，配制土霉素对照品溶液，使用0.01mol/L盐酸溶液溶解并稀释制成每1ml中含0.36-0.44mg土霉素的土霉素对照品溶液；
步骤三，设置HPLC检测条件，所述HPLC采用流动相等度洗脱方法，所述流动相包括流动相A、流动相B和流动相C，流动相A为醋酸铵-乙二胺四醋酸二钠溶液；流动相B为乙腈；流动相C为乙醇胺，所述流动相A、流动相B和流动相C等度洗脱比例为90：10：1；
步骤四，进行系统适应性检测；
步骤五，精密量取供试样品溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图1；另取土霉素对照品溶液，注入液相色谱仪，记录色图谱2，按外标法以峰面积计算供试品中土霉素含量。
2.根据权利要求1所述的一种用HPLC测定土霉素注射液中土霉素含量的方法，其特征在于，流动相A醋酸铵-乙二胺四醋酸二钠，为0.25mol/L醋酸铵溶液和0.05mol/L乙二胺四醋酸二钠溶液按照体积比100：10配制成的混合液，摇匀后，用醋酸调节pH值至6.5-7.2。
3.根据权利要求2所述的一种用HPLC测定土霉素注射液中土霉素含量的方法，其特征在于，用醋酸调节pH值至7.0。
4.根据权利要求1所述的一种用HPLC测定土霉素注射液中土霉素含量的方法，其特征在于，步骤一中，用0.01mol/L盐酸溶液稀释土霉素注射液，所述土霉素与盐酸溶液的质量体积比为0.36-0.44mg：200ml，继续取该溶液适量用0.01mol/L盐酸溶液稀释至5倍体积，摇匀，作为供试品溶液。
5.根据权利要求1所述一种用HPLC测定土霉素注射液中土霉素含量的方法，其特征在于，所述HPLC的检测条件为：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，规格为4.6mm×250mm，流速为5μm；检测波长为280nm；柱温40℃；进样量为10μl。
6.根据权利要求1所述的一种用HPLC测定土霉素注射液中土霉素含量的方法，其特征在于，所述的系统适应性检测方法为：
(1)取4-差向四环素对照品，加入0.01mol/L盐酸溶液溶解并稀释制成0.5mg/ml的4-差向四环素溶液；
(2)取土霉素对照品，加入0.1mol/L盐酸溶液溶解，用水稀释制成0.5mg/ml的土霉素溶液；
(3)将所述(1)和(2)配制的4-差向四环素溶液和土霉素溶液按照体积比1：24混合制成的混合溶液作为系统适应性溶液；
(4)取系统适应性溶液10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，出峰顺序依次为差向四环素峰、土霉素峰、2-乙酰-2-去酰胺土霉素峰，所述差向四环素峰与土霉素峰相对保留时间为0.9，所述2-乙酰-2-去酰胺土霉素峰与土霉素峰相对保留时间为1.1。
7.根据权利要求6所述的一种用HPLC测定土霉素注射液中土霉素含量的方法，其特征在于，所述的系统适应性检测的结果为4-差向四环素峰与土霉素峰间的分离度大于2.0，土霉素峰与2-乙酰-2-去酰胺土霉素峰间的分离度大于2.5。
8.根据权利要求1所述的一种用HPLC测定土霉素注射液中土霉素含量的方法，其特征在于，步骤一中所述提取液的配制方法为：取盐酸9ml加水定容至100ml，混合均匀后，取10ml到1L容量瓶中，加水定容至刻度，混合均匀。
9.根据权利要求1至8中任一所述的一种用HPLC测定土霉素注射液中土霉素含量的方法，其特征在于，具体实施步骤如下：
步骤一，配制供试样品溶液，称量含0.36-0.44g土霉素的土霉素注射液，用0.01mol/L盐酸溶液稀释土霉素注射液，所述土霉素与盐酸溶液的质量体积比为0.36-0.44mg：200ml，继续取该溶液适量用0.01mol/L盐酸溶液稀释至5倍体积，摇匀，作为供试品溶液；
步骤二，配制土霉素对照品溶液，取土霉素标准品，加人0.01mol/L盐酸溶液制成每1ml中含土霉素0.36-0.44mg的溶液；
步骤三，设置HPLC检测条件，设置HPLC检测条件为用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，规格为4.6mm×250mm，流速为5μm；检测波长为280nm；柱温40℃；进样量为10μl；HPLC流动相为等度洗脱方法，流动相包括流动相A、流动相B和流动相C，流动相A为醋酸铵-乙二胺四醋酸二钠溶液；流动相B为乙腈；流动相C为乙醇胺，所述流动相A、流动相B和流动相C等度洗脱比例为90：10：1；所述流动相A醋酸铵-乙二胺四醋酸二钠的配制方法为将0.25mol/L醋酸铵溶液和0.05mol/L乙二胺四醋酸二钠溶液按照体积比100：10配制成的混合液，摇匀后，用醋酸调节pH值至7.0；
步骤四，进行系统适应性检测：(1)取4-差向四环素对照品，加入0.01mol/L盐酸溶液溶解并稀释制成每1ml中含4-差向四环素0.5mg的4-差向四环素溶液；(2)取土霉素对照品，加少量0.1mol/L盐酸溶液溶解，用水稀释制成每1ml中含土霉素0.5mg的土霉素溶液；(3)将所述(1)和(2)配制的4-差向四环素溶液和土霉素溶液按照体积比1：24混合制成的混合溶液作为系统适应性检测溶液；(4)取系统适应性检测溶液10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，出峰顺序依次为差向四环素峰、土霉素峰、2-乙酰-2-去酰胺土霉素峰，所述差向四环素峰与土霉素峰相对保留时间为0.9，所述2-乙酰-2-去酰胺土霉素峰与土霉素峰相对保留时间为1.1；系统适应性检测的结果应为4-差向四环素峰与土霉素峰间的分离度应大于2.0，土霉素峰与2-乙酰-2-去酰胺土霉素峰间的分离度应大于2.5，符合系统适应性要求；
步骤五，精密量取供试样品溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图1；另取土霉素对照品溶液，注入液相色谱仪，记录色图谱2，按外标法以峰面积计算供试品中土霉素的含量。
10.根据权利要求1所述的一种用HPLC测定土霉素注射液中土霉素含量的方法，其特征在于，用于检测0.05mg/ml到0.5mg/ml浓度范围的土霉素注射液。
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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