CN111220733A - 高效毛细管电泳测定l-肌肽的方法及其应用于聚普瑞锌的质量评价 - Google Patents

高效毛细管电泳测定l-肌肽的方法及其应用于聚普瑞锌的质量评价 Download PDF

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Abstract

本发明属于分析化学技术领域，涉及一种高效毛细管电泳测定L‑肌肽的方法，包括：（1）取L‑肌肽溶解于缓冲液中制得对照品原液，分别量取对照品原液若干于10 mL量瓶中，定容得到系列浓度对照品溶液，4℃储存；（2）采用高效毛细管电泳对系列浓度对照品溶液进样检测，记录色谱图，以分析物的峰面积A为纵坐标，对照品溶液的浓度C为横坐标，绘制标准曲线；（3）待测样品经预处理后经高效毛细管电泳测得峰面积，根据标准曲线测得L‑肌肽的含量。本发明所公开方法高效、简便、灵敏度高，快捷准确，不使用有机溶剂，环保高效，测定结果快速准确、重复性好，可在10min内完成测定，为聚普瑞锌原料药及其制剂的质量评价提供了经济、环保、高效的技术手段。

Description

高效毛细管电泳测定L-肌肽的方法及其应用于聚普瑞锌的质 量评价
技术领域
本发明属于分析化学技术领域，涉及L-肌肽的测定，尤其涉及一种高效毛细管电泳测定L-肌肽的方法及其应用于聚普瑞锌的质量评价。
背景技术
聚普瑞锌(Polaprezinc，PZ)是锌和L-肌肽的螯合物，属于促进防御因子类药，由日本Hamari新药工业株式会社开发的抗胃溃疡药物。锌及L-肌肽均可加速胃黏膜损伤愈合，锌主要通过促进细胞增殖和蛋白合成加速各类型组织的伤口愈合进程，L-肌肽是一种由β-丙氨酸和L-组氨酸组成的二肽，具有抗氧化作用，对自由基和金属离子引起的脂质氧化具有显著抑制作用。
作为锌与L-肌肽组成的不溶性复合物，相较于单独的锌或L-肌肽而言，聚普瑞锌在胃液中分解缓慢，能够在胃内长时间停留，持续发挥胃黏膜修复与保护作用以促进胃溃疡黏膜愈合。研究表明聚普瑞锌能明显降低炎症因子如IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α的水平，提高抗氧化酶的表达，如超氧化物歧化酶-1(SOD-1)、SOD-2、血红素加氧酶(HO-1)、谷胱甘肽转移酶、PRX-1、PRX-5及生长因子(血小板源生长因子、血管内皮生长因子、神经生长因子)等。同时提高HSP90、70、60、47、27、10的表达水平发挥黏膜保护作用。其中，HSP70作为代表性热休克蛋白，通过抑制JNK信号通路、细胞凋亡蛋白酶活性、线粒体细胞色素C的释放及凋亡复合体的形成来发挥抗细胞凋亡的功能。临床试验显示，单独使用本品8周后，胃溃疡的痊愈率高达72.97％，总有效率为84.68％。
聚普瑞锌的溶解度实验表明其在0.1mol/L HCl中略溶，在0.1mol/L NaOH中极微溶解，在水、甲醇、乙醇、异丙醇、乙醚、四氢呋喃、丙酮、乙腈、N，N-二甲基甲酰胺中几乎不溶。由于聚普瑞锌在大多数溶剂中的不溶性，其中万能溶剂也不例外，故截至目前，国内外尚未见直接测定聚普瑞锌含量的方法。
酸性条件下聚普瑞锌可水解为L-肌肽和锌离子，可通过测定L-肌肽的含量从而实现对聚普瑞锌的定量分析。目前，针对L-肌肽的分析检测方法多采用氨基酸分析仪法和高效液相色谱法。氨基酸分析仪从本质上来说是液相色谱的特殊应用，用氨基酸分析仪进行氨基酸分析前必须将蛋白质及肽水解成单个氨基酸，然后用缓冲溶液推动氨基酸混合物流经装有阳离子交换树脂的色谱柱，各氨基酸与树脂中的交换基团进行离子交换，当用不同的pH缓冲溶液进行洗脱时因交换能力的不同而将氨基酸混合物分离，分离出的单个氨基酸组分与茚三酮试剂反应，生成紫色化合物或黄色化合物，用可见光检测器检测其在570nm、440nm的吸光度。这些有色产物对应的吸收强度与洗脱出来的各氨基酸浓度之间的关系符合朗伯-比尔定律，从而实现对氨基酸的定量测定。但是离子交换树脂易压缩，流动相流速的加快不与压力的增加成比例，故所需的样品测定时间较长；且氨基酸经离子交换柱分离，在柱后与水合茚三酮衍生剂混合进行反应，造成柱后扩散比较大，峰形变宽，分辨率降低；另外由于氨基酸分析仪结构复杂，价格相对昂贵，并不是测定L-肌肽的首选方法。传统的反相液相色谱(RPLC)是目前应用最广泛的色谱分离技术，能够满足大部分非极性化合物的分离要求，但L-肌肽作为强极性化合物，在色谱柱上保留较弱甚至不保留，只能对其进行衍生化或加入离子对试剂。不可避免的是在衍生化过程中，容易引入新的杂质或衍生不完全造成样品的损失，另外形成的衍生副产物可能对色谱分离造成更大的困难。离子对试剂容易与固定结合产生不可逆吸附，进而影响固定相活性位点。而且离子对试剂很难从色谱柱上冲洗干净，造成色谱柱寿命大幅缩短的严重后果。
高效毛细管电泳法是以弹性石英毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的电泳分离分析方法。本发明利用高效毛细管电泳技术实现对L-肌肽的定量分析，不使用有机溶剂，样品处理操作简便，水解后产生的锌离子无需进行特殊处理不会对毛细管柱造成损伤，且样品分析时间短，经济效益高。
发明内容
针对上述现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种高效毛细管电泳测定L-肌肽的方法及其应用于聚普瑞锌的质量评价。
技术方案：
一种高效毛细管电泳测定L-肌肽的方法，包括以下步骤：
(1)取L-肌肽溶解于缓冲液中制得对照品原液，分别量取对照品原液0.1、0.2、0.4、0.8、1.0、1.5mL于10mL量瓶中，用上述缓冲液定容至刻度，混合均匀，得到系列浓度对照品溶液，4℃储存，所述对照品原液中L-肌肽的浓度为1.0mg/mL；
(2)采用高效毛细管电泳对系列浓度对照品溶液进样检测，记录色谱图，以分析物的峰面积A为纵坐标，对照品溶液的浓度C为横坐标，绘制标准曲线；
(3)取聚普瑞锌原料药约10mg，精密称定，置于10mL量瓶中，加稀盐酸3mL，超声提取30min，放冷后加水稀释至刻度，摇匀，微孔滤膜过滤，精密量取续滤液1mL，置于10mL量瓶中，加缓冲液稀释至刻度，摇匀，作为原料药供试品溶液；
取5袋聚普瑞锌颗粒制剂倒出内容物混匀，取约0.3g，精密称定，置于50mL量瓶中，加稀盐酸3mL，超声提取30min，放冷后加水稀释至刻度，摇匀，微孔滤膜过滤，精密量取续滤液1mL，置于10mL量瓶中，加缓冲液稀释至刻度，摇匀，作为制剂供试品溶液；
(4)将供试品溶液按照步骤(2)所述高效毛细管电泳法进样分析，记录其峰面积，根据标准曲线计算所述样品溶液中L-肌肽的含量。
本发明较优公开例中，步骤(1)与(3)中所述缓冲液为100mmol/L的Na2B4O7-H3BO3缓冲溶液，pH 5.6。
本发明较优公开例中，步骤(2)中所述高效毛细管电泳检测条件：采用未涂层石英毛细管，缓冲液为100mmol/L的Na2B4O7-H3BO3缓冲溶液，pH 5.6，重力进样，进样高度20cm，进样时间10s，检测波长200nm，分离电压10kV。
本发明较优公开例中，步骤(3)中所述超声提取的频率为50kHZ。
本发明较优公开例中，步骤(3)中所述稀盐酸浓度为6mol/L。
本发明利用高效毛细管电泳法(HPCE)来测定L-肌肽，不同于HPLC法存在的消耗成本高、分析时间长、有机试剂用量大等缺陷，本发明方法简便、成本低、测定结果快速准确、重复性好，可在10分钟内完成测定，能够为聚普瑞锌原料药及其制剂的质量控制提供实用简便的评价方法。
有益效果
本发明公开了一种利用高效毛细管电泳技术实现聚普瑞锌原料药及其制剂中L-肌肽含量测定的方法，简便、快捷准确，不使用有机溶剂，环保高效，为聚普瑞锌原料药及其制剂的质量评价提供了经济、环保、高效的技术手段。本发明所公开方法高效、简便、灵敏度高。
附图说明
图1-(A).标准品的HPCE色谱图，
图1-(B).聚普瑞锌原料药的HPCE色谱图，
图1-(C).聚普瑞锌颗粒剂的HPCE色谱图，
其中，1为L-肌肽。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细说明，以使本领域技术人员更好地理解本发明，但本发明并不局限于以下实施例。
除非另外限定，这里所使用的术语(包含科技术语)应当解释为具有如本发明所属技术领域的技术人员所共同理解到的相同意义。还将理解到，这里所使用的术语应当解释为具有与它们在本说明书和相关技术的内容中的意义相一致的意义，并且不应当以理想化或过度的形式解释，除非这里特意地如此限定。
实施例
高效毛细管电泳测定L-肌肽的方法及应用于聚普瑞锌原料药及制剂的质量评价
1、仪器与试药
CL-1030型高效毛细管电泳仪(北京华阳利民仪器有限公司)，配有二极管阵列检测器，石英毛细管柱(40cm×50μm，有效长度32cm，河北永年县锐沣色谱器件有限公司)；数据采集和谱图处理采用HW-2000型色谱工作站；聚普瑞锌原料药(批号为20190918，20190919，20190920为实验室自制)；聚普瑞锌颗粒剂(批号为20190921，20190922，20190923为实验室自制，规格：每袋0.5g，含聚普瑞锌75mg)，L-肌肽对照品购自上海麦克林生化科技有限公司。
2、分离条件的优化
通过优化紫外检测波长，并对缓冲体系、缓冲液pH、分离电压、进样时间进行分析。L-肌肽的检测波长的选择是利用二极管阵列检测，通过最大峰面积和稳定的基线作为考察指标，选定最优的紫外检测波长200nm。最佳色谱图见图1。
3、实验方法
步骤(1)制备对照品溶液：取L-肌肽适量，加100mmol/L的Na2B4O7-H3BO3缓冲溶液(pH 5.6)溶解，制得对照品原液，然后量取对照品原液0.1、0.2、0.4、0.8、1.0、1.5mL于10mL量瓶中，用上述缓冲液定容至刻度，混合均匀，得到系列浓度对照品溶液，4℃储存。对照品原液中L-肌肽的浓度为1.0mg/mL。
步骤(2)制备供试样品溶液：取聚普瑞锌原料药约10mg，精密称定，置10mL量瓶中，加稀盐酸3mL，超声提取30分钟，放冷后加水稀释至刻度，摇匀，微孔滤膜过滤，精密量取续滤液1mL，置于10mL量瓶中，加缓冲液稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；
取5袋聚普瑞锌颗粒剂倒出内容物混匀，取约0.3g，精密称定，置50mL量瓶中，加稀盐酸3mL，超声提取30分钟，放冷后加水稀释至刻度，摇匀，微孔滤膜过滤，精密量取续滤液1mL，置于10mL量瓶中，加缓冲液稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
所述超声提取的频率为50kHZ，盐酸浓度为6mol/L。
步骤(3)采用高效毛细管电泳对所述对照品溶液和供试品溶液分别进行检测，并记录对照品溶液和供试品溶液的色谱图。
高效毛细管电泳检测条件是采用未涂层石英毛细管，缓冲液为100mmol/L的Na2B4O7-H3BO3缓冲溶液(pH 5.6)，重力进样，进样高度20cm，进样时间10s，检测波长200nm，分离电压10kV。新柱处理用1.0mol/L氢氧化钠溶液冲洗30分钟后再用0.1mol/L氢氧化钠溶液和2次重蒸水依次冲洗20分钟；以后每次开机前用0.1mol/L氢氧化钠溶液冲洗10分钟，二次重蒸水冲洗10分钟；连续进样间用0.1mol/L氢氧化钠溶液、2次重蒸水、缓冲液依次冲洗3分钟。在选定实验条件下进行分离，分离进行3-5次后，更换缓冲液，样品及缓冲液均在4℃储存，在使用前都需经0.45μm滤膜进行过滤并超声脱气。
步骤(4)制定标准曲线及计算结果：将系列浓度对照品溶液分别进样检测，以分析物的峰面积A为纵坐标，分析物的浓度C(μg/mL)为横坐标，绘制标准曲线。将供试品溶液进样分析，记录其峰面积，根据标准曲线计算样品中L-肌肽的含量。
4、线性回归方程的建立
精密量取L-肌肽对照品原液0.1、0.2、0.4、0.8、1.0、1.5mL置10mL量瓶，用缓冲溶液稀释至刻度，将定容后的溶液在步骤(3)的色谱条件下分析，以峰面积A为纵坐标，质量浓度C为横坐标，绘制标准曲线，见表1。
表1线性回归方程
Figure BDA0002390334630000051
5、精密度试验
取步骤(1)中对照品溶液，按照步骤(3)的色谱条件连续测定6次，分别记录迁移时间和峰面积，分别记录日内精密度和日间精密度，见表2。
表2L-肌肽的日间、日内精密度
Figure BDA0002390334630000052
6、稳定性试验
取步骤(2)中同一供试品溶液，按照步骤(3)的色谱条件，分别在放置0、2、4、6、8、12、24h后进行测定，记录保留时间和峰面积值，RSD均小于1.41％，表明供试品溶液在24h内稳定性良好。
7、重复性试验
精密称取同一批号的聚普瑞锌原料药6份，按照步骤(2)的供试品溶液制备方法和步骤(3)的色谱条件分别进样，测定峰面积，代入L-肌肽标准曲线的回归方程，计算得L-肌肽的平均含量为标示量的99.55％，RSD为1.03％(n＝6)，表明该方法稳定可行。
8、加样回收率试验
精密称取已知含量的聚普瑞锌原料药，加入对照品溶液，按供试品溶液的制备方法操作，包括高、中、低三个不同的浓度并且每个浓度一式三份，按照步骤(3)的色谱条件分别进样，对其峰面积进行测定，结果发现，该组溶液的平均回收率为99.94％，RSD值为0.65％(n＝9)。
精密称取已知含量的聚普瑞锌颗粒剂，加入对照品溶液，按供试品溶液的制备方法操作，包括高、中、低三个不同的浓度并且每个浓度一式三份，按照步骤(3)的色谱条件分别进样，对其峰面积进行测定，结果发现，该组溶液的平均回收率为100.05％，RSD值为0.77％(n＝9)。
9、样品测定结果
分别取聚普瑞锌原料药及颗粒剂各3批，按照步骤(2)的供试品溶液制备方法和步骤(3)的色谱条件分别进样，测定峰面积，代入L-肌肽标准曲线的回归方程，计算L-肌肽的含量，结果见下表3。
表3样品测定结果(％，n＝3)
Figure BDA0002390334630000061
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (6)

1.一种高效毛细管电泳测定L-肌肽的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）取L-肌肽溶解于缓冲液中制得对照品原液，分别量取对照品原液0.1、0.2、0.4、0.8、1.0、1.5 mL于10 mL量瓶中，用上述缓冲液定容至刻度，混合均匀，得到系列浓度对照品溶液，4℃储存，所述对照品原液中L-肌肽的浓度为1.0 mg/mL；
（2）采用高效毛细管电泳对系列浓度对照品溶液进样检测，记录色谱图，以分析物的峰面积A为纵坐标，对照品溶液的浓度C为横坐标，绘制标准曲线；
（3）取聚普瑞锌原料药约10 mg，精密称定，置于10 mL量瓶中，加稀盐酸3 mL，超声提取30min，放冷后加水稀释至刻度，摇匀，微孔滤膜过滤，精密量取续滤液1 mL，置于10 mL量瓶中，加缓冲液稀释至刻度，摇匀，作为原料药供试品溶液；
取5袋聚普瑞锌颗粒制剂倒出内容物混匀，取约0.3 g，精密称定，置于50 mL量瓶中，加稀盐酸3 mL，超声提取30min，放冷后加水稀释至刻度，摇匀，微孔滤膜过滤，精密量取续滤液1 mL，置于10 mL量瓶中，加缓冲液稀释至刻度，摇匀，作为制剂供试品溶液；
（4）将供试品溶液按照步骤（2）所述高效毛细管电泳法进样分析，记录其峰面积，根据标准曲线计算所述样品溶液中L-肌肽的含量。
2.根据权利要求1所述高效毛细管电泳测定L-肌肽的方法，其特征在于：步骤（1）中所述缓冲液为100 mmol/L的Na2B4O7-H3BO3缓冲溶液，pH 5.6。
3.根据权利要求1所述高效毛细管电泳测定L-肌肽的方法，其特征在于，步骤（2）中所述高效毛细管电泳检测条件：采用未涂层石英毛细管，缓冲液为100 mmol/L的Na2B4O7-H3BO3缓冲溶液，pH 5.6，重力进样，进样高度20 cm，进样时间10 s，检测波长200 nm，分离电压10kV。
4.根据权利要求1所述高效毛细管电泳测定L-肌肽的方法，其特征在于：步骤（3）中所述缓冲液为100 mmol/L的Na2B4O7-H3BO3缓冲溶液，pH 5.6。
5.根据权利要求1所述高效毛细管电泳测定L-肌肽的方法，其特征在于：步骤（3）中所述超声提取的频率为50 kHZ。
6.根据权利要求1所述高效毛细管电泳测定L-肌肽的方法，其特征在于：步骤（3）中所述稀盐酸浓度为6 mol/L。
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