CN116973464A - 一种17种抗癫痫药物及2种代谢物的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于分析检测技术领域，具体涉及一种17种抗癫痫药物及2种代谢物的检测方法。本发明使用一套检测试剂，一致的蛋白沉淀样品处理方法，相同的检测系统，对所述抗癫痫药物和代谢物分批上机检测。试剂组成包括流动相(A/B)、萃取剂、内标、稀释剂、校准品及质控品。蛋白沉淀方法中使用有机试剂沉淀蛋白，去除蛋白后按两种稀释倍数稀释不同项目。检测方法共3批，在同一台仪器和相同色谱柱上实现。本发明中大部分药物使用化合物和同位素两个内标，存在于不同试剂中，创造了“双内标分析法”，节约试剂成本，监控整个测试过程，一次检测两个结果可作比对分析。

Description

一种17种抗癫痫药物及2种代谢物的检测方法
技术领域
本发明属于分析检测技术领域，具体涉及一种17种抗癫痫药物及2种代谢物的检测方法。
背景技术
临床常用抗癫痫药物往往需要开展血药浓度检测。学者认为癫痫药物需要开展血药浓度检测的原因有：1)抗癫痫药物的血药浓度与临床效果的相关性远远好于剂量与疗效的相关性；2)癫痫发作不规则，抗癫痫药物是预防性控制症状，所以治疗初期很难单凭临床疗效确定处方剂量是否合理；3)抗癫痫药物的临床中毒症状不容易发现；4)抗癫痫药物具有很大的药代动力学差异，因此不同患者需要有很大的剂量差异；5)抗癫痫药物的临床疗效或毒性没有实验室可测的标志物。
现有抗癫痫药物的血药浓度检测方法有液相色谱法、气相色谱法、光谱法、毛细管电泳法、液质联用法以及免疫法，其中免疫法有荧光偏振免疫法、均相酶免疫法和放射免疫法。气相色谱方法适用于沸点低的药物，毛细管电泳法适用于带电荷的药物，光谱法特异性差，免疫法需要特异型的抗体，因而抗干扰能力强、使用范围广的液相色谱法和液质联用法更适合用于分析种类较多的抗癫痫药物及其代谢物。液质联用方法的灵敏度高、特异型好、分析速度快，相比于液相色谱法更适用于分析治疗浓度范围波及广(每毫升几纳克到十万纳克)、部分药物极性差异小的抗癫痫药物。
针对国内常用抗癫痫药物，未见同一系统实现全部检测的研究报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种17种抗癫痫药物及2种代谢物的检测方法。本发明的检测方法可以实现17种抗癫痫药物及2种代谢物的同时检测，覆盖目前所有常用抗癫痫药物，满足临床需求。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种17种抗癫痫药物及2种代谢物的检测方法，包括以下步骤：
将待测样品与萃取剂混合后分离，得到上清液；所述萃取剂中含有化合物内标，所述化合物内标为17种抗癫痫药物及2种代谢物的有关物质、杂质或结构类似物；所述待测样品包括血清和/或血浆；
将所述上清液与稀释剂混合，得到供试品溶液；所述稀释剂中含有同位素内标；
将所述供试品溶液进行液相色谱-质谱分析，根据得到的质谱结果和预定的标准曲线，分别得到所述17种抗癫痫药物及2种代谢物的含量，所述标准曲线包括根据所述化合物内标得到的化合物内标标准曲线和根据所述同位素内标得到的同位素内标标准曲线；
所述液相色谱-质谱分析的液相色谱条件包括：色谱柱为氰基色谱柱；流动相A包括甲醇、水和乙酸铵，流动相B包括甲醇、乙腈和甲酸；流速：0.3～0.7mL/min，梯度洗脱，洗脱时间3～5min；进样量：5～20μL；柱温：30～40℃；
所述液相色谱-质谱分析的质谱条件包括：电喷雾离子源，14种抗癫痫药物和2种代谢物采用正离子模式，所述2种代谢物包括环氧卡马西平和10,11-二氢-10-羟基卡马西平，所述14种抗癫痫药物包括卡马西平、奥卡西平、拉莫三嗪、普瑞巴林、苯妥英、加巴喷丁、左乙拉西坦、氨己烯酸、卢非酰胺、拉考沙胺、吡仑帕奈、唑尼沙胺、扑米酮和氯硝西泮，3种抗癫痫药物采用负离子模式，所述3种抗癫痫药物包括丙戊酸、托吡酯和苯巴比妥，扫描方式：MRM，源参数：气帘气40～50psi，碰撞气6～7psi，电压4000～4500V，温度650℃，雾化气40psi，辅助气70psi。
优选的，所述萃取剂包括甲醇和/或乙腈。
优选的，所述萃取剂与待测样品的体积比为3～10:1。
优选的，所述化合物内标包括化合物单体和/或化合物单体的盐，所述化合物单体包括10-氯卡马西平、2-甲基拉莫三嗪、布瓦西坦、苯妥英EP杂质F、2-乙基戊酸、N-甲基托吡酯、4-氨基丁酸、6-脱氟卢非酰胺、N-去甲酰基甲基-N-甲酰基乙基拉考沙胺、N-甲基唑尼沙胺和普瑞巴林甲酯中的一种或多种。
优选的，所述同位素内标包括卡马西平-D2,15N、拉莫三嗪-13C3、奥卡西平-D4、(S)-普瑞巴林-D4、10,11-二氢-10-羟基卡马西平-D4、苯妥英-D10、加巴喷丁-D4、左乙拉西坦-D6、氨己烯酸-13C,D5、卢非酰胺-15N,D2、Rac-拉考沙胺-D3、吡仑帕奈-D5、唑尼沙胺-13C2,15N、丙戊酸-D6、托吡酯-D12、苯巴比妥-D5、扑米酮-D5和氯硝西泮-D4中的一种或多种。
优选的，所述稀释剂为甲醇的水溶液。
优选的，所述稀释剂中甲醇的体积分数为10～90％。
优选的，所述稀释剂与上清液的体积比为1～30:1。
优选的，所述液相色谱-质谱分析中液相色谱的洗针液为甲醇的水溶液，所述洗针液中甲醇的体积分数与稀释剂中甲醇的体积分数的比为1～2:1。
本发明还提供了一种试剂盒，包括流动相A添加剂、流动相B添加剂、内标、稀释剂、萃取剂、校准品和质控品；所述流动相A添加剂为甲醇、水和乙酸铵；所述流动相B添加剂为甲酸；所述内标为化合物内标的甲醇溶液，所述化合物内标为17种抗癫痫药物及2种代谢物的有关物质、杂质或结构类似物；所述稀释剂为同位素内标的甲醇溶液；所述萃取剂为甲醇和乙腈的混合液；所述校准品和质控品均为含17种抗癫痫药物及2种代谢物的溶液，所述17种抗癫痫药物包括丙戊酸、托吡酯、卡马西平、奥卡西平、拉莫三嗪、左乙拉西坦、苯妥英、唑尼沙胺、加巴喷丁、普瑞巴林、氨己烯酸、吡仑帕奈、卢非酰胺、拉考沙胺、扑米酮、苯巴比妥和氯硝西泮；所述2种代谢物包括环氧卡马西平和10,11-二氢-10-羟基卡马西平。
本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：
本发明采用液相色谱-质谱分析实现了17种抗癫痫药物及2种代谢物的同时检测，覆盖所有常用抗癫痫药物，满足国内临床需求，解决了目前少数抗癫痫药物无法检测的需求。
同时，本发明创造了“双内标分析法”，同一分析物使用两种内标，包括化合物内标和同位素内标，不同的内标在不同处理步骤中加入。本发明的双内标分析法有三种优势，其一，双内标的使用，可以使一个样品每个分析物一次获得两个检测结果，对两个检测结果进行分析进而可以筛选出异常结果，确保检测结果的准确可靠；其二，价格昂贵的同位素内标在仪器分析前的稀释剂中加入，使用量减少，可以节约成本；其三，液相色谱-质谱分析的定量方法中，本发明的双内标法可以监控整个测试过程，通过双内标法最大限度降低人为操作误差、同时减弱蛋白沉淀处理方法的最大问题基质效应的影响。
实施例的数据表明，参照国家药典中生物样品分析方法验证指导原则开展相应方法验证，验证内容包括线性、准确度与精密度、选择性、定量下限、残留、基质效应等均符合文件要求，稳定性可满足日常检测需求。本发明的检测方法，成功应用于临床检测。
本发明实现了一套系统可完成现阶段临床所需抗癫痫药物的检测，包括相同的试剂耗材(流动相、洗针液、校准品、质控品、萃取剂、内标、稀释剂、色谱柱)、相同的样品处理方法(取样、加标、离心、取上清、加稀释剂、混匀上机)、相同的流程和相同的仪器，系统统一的工作为目前需手工操作部分在未来转为自动化操作提供便利，为解决目前抗癫痫药物的血药浓度方法各异、质量参差不齐检测工作做好准备。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明使用的试剂作为临床检测试剂盒的产品图。
具体实施方式
本发明提供了一种17种抗癫痫药物及2种代谢物的检测方法，包括以下步骤：
将待测样品与萃取剂混合后分离，得到上清液；所述萃取剂中含有化合物内标，所述化合物内标为17种抗癫痫药物及2种代谢物的有关物质、杂质或结构类似物；所述待测样品包括血清和/或血浆；
将所述上清液与稀释剂混合，得到供试品溶液；所述稀释剂中含有同位素内标；
将所述供试品溶液进行液相色谱-质谱分析，根据得到的质谱结果和预定的标准曲线，分别得到所述17种抗癫痫药物及2种代谢物的含量，所述标准曲线包括根据所述化合物内标得到的化合物内标标准曲线和根据所述同位素内标得到的同位素内标标准曲线；
所述液相色谱-质谱分析的液相色谱条件包括：色谱柱为氰基色谱柱；流动相A包括甲醇、水和乙酸铵，流动相B包括甲醇、乙腈和甲酸；流速：0.3～0.7mL/min，梯度洗脱，洗脱时间3～5min；进样量：5～20μL；柱温：30～40℃；
所述液相色谱-质谱分析的质谱条件包括：电喷雾离子源，14种抗癫痫药物和2种代谢物采用正离子模式，所述2种代谢物包括环氧卡马西平和10,11-二氢-10-羟基卡马西平，所述14种抗癫痫药物包括卡马西平、奥卡西平、拉莫三嗪、普瑞巴林、苯妥英、加巴喷丁、左乙拉西坦、氨己烯酸、卢非酰胺、拉考沙胺、吡仑帕奈、唑尼沙胺、扑米酮和氯硝西泮，3种抗癫痫药物采用负离子模式，所述3种抗癫痫药物包括丙戊酸、托吡酯和苯巴比妥，扫描方式：MRM，源参数：气帘气40～50psi，碰撞气6～7psi，电压4000～4500V，温度650℃，雾化气40psi，辅助气70psi。
在本发明中，若无特殊说明，使用的试剂、耗材、仪器和设备均为本领域市售商品。
本发明将待测样品与萃取剂混合后分离，得到上清液；所述萃取剂中含有化合物内标，所述化合物内标为17种抗癫痫药物及2种代谢物的有关物质、杂质或结构类似物；所述待测样品包括血清和/或血浆。
在本发明中，所述萃取剂优选包括甲醇和/或乙腈，更优选为甲醇和乙腈的混合液，所述混合液中甲醇和乙腈的体积比优选为1:1，所述萃取剂中甲醇和乙腈的体积比优选与流动相B中甲醇和乙腈的体积比相同，所述甲醇和乙腈的体积比可以兼顾乙腈的蛋白沉淀效果和甲醇对抗癫痫药物的最佳溶解度，同时本发明的萃取剂与流动相B有相同的有机相组成可减轻试剂配制压力。
在本发明中，所述萃取剂的作用是沉淀蛋白、萃取及溶解待测血清/血浆中的分析物及内标，所述分析物是指17种抗癫痫药物及2种代谢物。
在本发明中，所述待测样品与萃取剂混合的方式优选为涡旋，所述涡旋的时间优选为10s。
在本发明中，所述17种抗癫痫药物包括丙戊酸、托吡酯、卡马西平、奥卡西平、拉莫三嗪、左乙拉西坦、苯妥英、唑尼沙胺、加巴喷丁、普瑞巴林、氨己烯酸、吡仑帕奈、卢非酰胺、拉考沙胺、扑米酮、苯巴比妥和氯硝西泮；所述2种代谢物包括环氧卡马西平和10,11-二氢-10-羟基卡马西平；所述2种代谢物为抗癫痫药物的代谢物，所述17种抗癫痫药物和2种代谢物是它们在人体内存在形式的通用名。
在本发明中，所述化合物内标优选包括化合物单体和/或化合物单体的盐，所述化合物单体包括10-氯卡马西平、2-甲基拉莫三嗪、布瓦西坦、苯妥英EP杂质F、2-乙基戊酸、N-甲基托吡酯、4-氨基丁酸、6-脱氟卢非酰胺、N-去甲酰基甲基-N-甲酰基乙基拉考沙胺、N-甲基唑尼沙胺和普瑞巴林甲酯中的一种或多种。
在本发明中，所述萃取剂与待测样品的体积比优选为3～10:1，更优选为10:1，所述萃取剂和待测样品的体积比可以确保在最大程度沉淀蛋白的同时避免溶剂的浪费。
本发明优选将萃取后的溶液进行固液分离，得到上清液，本发明对所述固液分离的方式没有特殊的限定，如采用离心或过滤，所述离心的转速优选为12000rpm，时间优选为10min，所述固液分离可去除大部分蛋白及部分脂类，获得含分析物和化合物内标的溶液。本发明将化合物内标和萃取剂混合使用，相对于分别加入来处理样品的操作更简易，可减少操作误差的几率。
得到上清液后，本发明将所述上清液与稀释剂混合，得到供试品溶液；所述稀释剂中含有同位素内标。
在本发明中，所述稀释剂优选为甲醇的水溶液，所述稀释剂中甲醇的体积分数优选为10～90％，更优选为50％，所述稀释剂的作用是改变上机分析时的溶剂组成，消除或减弱溶剂效应、改善峰形、兼顾将同位素内标加入分析系统，创造双内标分析法。
在本发明中，所述同位素内标优选为17种抗癫痫药物及2种代谢物的同位素内标，所述同位素内标优选包括卡马西平-D2,15N、拉莫三嗪-13C3、奥卡西平-D4、(S)-普瑞巴林-D4、10,11-二氢-10-羟基卡马西平-D4、苯妥英-D10、加巴喷丁-D4、左乙拉西坦-D6、氨己烯酸-13C,D5、卢非酰胺-15N,D2、Rac-拉考沙胺-D3、吡仑帕奈-D5、唑尼沙胺-13C2,15N、丙戊酸-D6、托吡酯-D12、苯巴比妥-D5、扑米酮-D5和氯硝西泮-D4中的一种或多种。
在本发明中，所述稀释剂与上清液的体积比为1～30:1，更优选为1～20:1。
本发明所述17种抗癫痫药物及2种代谢物、化合物内标和同位素内标的清单，如表1所示。
表117种抗癫痫药物及2种代谢物、化合物内标和同位素内标的清单
在本发明中，所述化合物内标的选择是需要经过方法验证和临床验证的。对于本发明暂缺内标化合物的项目，仍可以将对应的同位素内标放入稀释剂中，因同一的校准品(标准曲线)和质控品的使用，有内标化合物的项目无偶然误差和系统误差，缺少化合物内标的项目也不会出现误差。在本发明中，暂缺化合物内标的项目，优选出具同位素内标检测结果。
在本发明中，所述稀释剂与上清液的体积比EPI1优选为1:1，EPI 2和EPI 3均优选为20:1，所述EPI 1、EPI 2和EPI 3为分析批的分类命名。
在本发明中，将所述上清液与稀释剂混合，可以将上清液稀释后再上机分析，通过稀释剂来改变上机溶液中有机溶剂的比例，以消除溶剂效应，获得最佳的色谱峰形。
得到供试品溶液后，本发明将所述供试品溶液进行液相色谱-质谱分析，根据得到的质谱结果和预定的标准曲线，分别得到所述17种抗癫痫药物及2种代谢物的含量，所述标准曲线包括根据所述化合物内标得到的化合物内标标准曲线和根据所述同位素内标得到的同位素内标标准曲线；
所述液相色谱-质谱分析的液相色谱条件包括：色谱柱为氰基色谱柱；流动相A包括甲醇、水和乙酸铵，流动相B包括甲醇、乙腈和甲酸；流速：0.3～0.7mL/min，梯度洗脱，洗脱时间3～5min；进样量：5～20μL；柱温：30～40℃；
所述液相色谱-质谱分析的质谱条件包括：电喷雾离子源，14种抗癫痫药物和2种代谢物采用正离子模式，所述2种代谢物包括环氧卡马西平和10,11-二氢-10-羟基卡马西平，所述14种抗癫痫药物包括卡马西平、奥卡西平、拉莫三嗪、普瑞巴林、苯妥英、加巴喷丁、左乙拉西坦、氨己烯酸、卢非酰胺、拉考沙胺、吡仑帕奈、唑尼沙胺、扑米酮和氯硝西泮，3种抗癫痫药物采用负离子模式，所述3种抗癫痫药物包括丙戊酸、托吡酯和苯巴比妥，扫描方式：MRM，源参数：气帘气40～50psi，碰撞气6～7psi，电压4000～4500V，温度650℃，雾化气40psi，辅助气70psi。
在本发明中，所述氰基色谱柱的柱长优选为3～5cm，填料的粒径优选为2～3.5μm，所述氰基色谱柱优选为YMC-Pack CN(3μm，3.0mm×50mm)。
在本发明中，所述流动相A中甲醇的体积分数优选为10～30％，更优选为10％；所述流动相A中乙酸铵的浓度优选为5～10mM，更优选为5mM；所述流动相B中甲醇和乙腈的体积比优选为1:1，所述流动相B中甲酸的体积浓度优选为0.2％。
本发明优选将所述17种抗癫痫药物及2种代谢物分批检测，分成3批，具体分批如表1中的EPI 1～EPI 3。本发明的分批检测，可以有效的缩短分析时间，每批检测时间仅需3～5min。
在本发明中，所述梯度洗脱程序可根据色谱柱的规格进行流速的调整，使所述17种抗癫痫药物及2种代谢物检测到即可。在本发明的具体实施例中，所述梯度洗脱程序如表2所示。
在本发明中，所述进样量优选为5、10或20μL；所述柱温优选为30℃。
在本发明中，所述液相色谱-质谱分析中液相色谱的洗针液优选为甲醇的水溶液，所述洗针液中甲醇的体积分数与稀释剂中甲醇的体积分数的比值优选为1～2:1，更优选为1:1。
在本发明中，所述洗针液中甲醇的体积分数优选为50％，此时甲醇水溶液的粘度最高，且与上机溶剂组成较为接近，洗针效果最佳。
在本发明中，所述液相色谱-质谱分析的质谱采用MRM模式，母离子均为[M+H]+峰，绝大部分碎片离子是各分析物所有碎片中响应最强的，大部分碎片离子(≥60％)的碰撞能是最优的。
本发明根据得到的质谱结果和预定的标准曲线，分别得到所述17种抗癫痫药物及2种代谢物的含量，所述标准曲线包括根据所述化合物内标得到的化合物内标标准曲线和根据所述同位素内标得到的同位素内标标准曲线。
本发明对所述标准曲线的获得方法没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的方法即可。
在本发明中，所述根据得到的质谱结果和预定的标准曲线得到所述17种抗癫痫药物及2种代谢物的含量的方法优选为内标法。
在本发明中，所述17种抗癫痫药物及2种代谢物的含量优选大部分分析物包括两个结果，分别为化合物内标结果和同位素内标结果。
本发明优选对所述化合物内标结果和同位素内标结果进行分析，以筛选出异常值。本发明优选根据两个结果的相对百分偏差进行筛选，直观分析最大值与最小值相差超60％的结果，排除明显的异常值，通过剩余数据计算平均值，以均值±30％作为正常值评判范围，根据范围筛检需要复检的样品。
本发明还提供了一种试剂盒，包括流动相A添加剂、流动相B添加剂、内标、稀释剂、萃取剂、校准品和质控品；所述流动相A添加剂为甲醇、水和乙酸铵；所述流动相B添加剂为甲酸；所述内标为化合物内标的甲醇溶液，所述化合物内标为17种抗癫痫药物及2种代谢物的有关物质、杂质或结构类似物；所述稀释剂为同位素内标的甲醇溶液；所述萃取剂为甲醇和乙腈的混合液；所述校准品和质控品均为含17种抗癫痫药物及2种代谢物的溶液，所述17种抗癫痫药物包括丙戊酸、托吡酯、卡马西平、奥卡西平、拉莫三嗪、左乙拉西坦、苯妥英、唑尼沙胺、加巴喷丁、普瑞巴林、氨己烯酸、吡仑帕奈、卢非酰胺、拉考沙胺、扑米酮、苯巴比妥和氯硝西泮；所述2种代谢物包括环氧卡马西平和10,11-二氢-10-羟基卡马西平。
在本发明中，所述化合物内标和同位素内标的种类优选与上述技术方案所述的检测方法中相同，在此不再赘述。
本发明试剂组成部分可作为生产临床检测试剂盒使用，本发明试剂组成包括流动相、萃取剂、内标、稀释剂、校准品以及质控品。由于流动相日常消耗体积大，包装规格难以衡量，以流动相添加剂的形式提供，另外所需试剂比如甲醇、乙腈和水均可市场采购获得。因而本发明可作为试剂盒提供的产品如图1所示，包括流动相A添加剂、流动相B添加剂、内标、稀释液(稀释剂)、萃取液(萃取剂)、校准品1～8以及质控品1～3，所有产品以很小的包装满足96人份的检测。
在本发明中，所述校准品和质控品均优选为不同浓度的含基质标准溶液，所述基质优选为空白血清，所述校准品的浓度优选如表2所示，所述质控品的浓度优选如表2所示，其中PRN和CNZ单位为ng/mL，其余项目单位均为μg/mL。
表2校准品和质控品的浓度
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的检测方法进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
供试品溶液：
对于EPI 1中项目：取50μL待测血清于1.5mL带塞离心管中，加入500μL含内标的萃取剂(甲醇：乙腈体积比＝50:50)，密封涡旋混匀10s，以12000rpm的转速离心10min，取100μL的上清液，加入100μL含同位素内标的稀释剂(甲醇体积分数为50％的水溶液)，混匀，得到供试品溶液。
对于EPI 2和EPI 3中项目：取50μL待测血清于1.5mL带塞离心管中，加入500μL含内标的萃取剂(甲醇：乙腈体积比＝50:50)，密封涡旋混匀10s，以12000rpm的转速离心10min，取10μL的上清液，加入200μL含同位素内标的稀释剂(甲醇体积分数为50％的水溶液)，混匀，得到供试品溶液。
标准曲线的配制方法与供试品溶液的制备方法相同，标准曲线的样品(称校准品)等同于待测血清/血浆、是由含各分析物的标液和空白血清以1:19的体积比混匀而得，系列校准品的可获得的浓度区间(单位μg/mL，其中PRN和CNZ单位为ng/mL)分别为：VPA，3-150；TPM，0.3-30；PMD，0.3-30；PBB，0.5-50；CNZ，2-200；CBZ，0.25-25；CBZ-E，0.05-4.5；LTG，0.3-30；OXC，0.05-5；MHD，0.5-50；LVT，0.5-50；PHT，0.5-50；PRN，20-2000；RFN，0.5-50；LCS，0.3-30；VGB，0.3-30；GBP，0.3-30；ZNS，0.5-50；PGB，0.1-10。
测定：将所述供试品溶液注入高效液相色谱-串联四级杆质谱联用仪(LC-MS/MS)，得到检测结果。
液相色谱条件包括：色谱柱为氰基柱YMC-Pack CN(3μm，3.0mm×50mm)；流动相A中甲醇与水的体积比为1:9，其中含5mM醋酸铵；流动相B中甲酸的体积浓度为0.2％、甲醇和乙腈的体积比为1:1；洗针液中甲醇与水的体积比为1:1。流速：0.5～0.7mL/min，梯度洗脱，梯度洗脱程序如表3所示，洗脱时间3～4min；柱温30℃，自动进样器温度20℃，进样体积5μL。
表3梯度洗脱程序
质谱条件包括：电喷雾离子源，正离子模式(包括14种药物和2种代谢物：卡马西平、环氧卡马西平、10,11-二氢-10-羟基卡马西平、奥卡西平、拉莫三嗪、普瑞巴林、苯妥英、加巴喷丁、左乙拉西坦、氨己烯酸、卢非酰胺、拉考沙胺、吡仑帕奈、唑尼沙胺、扑米酮、氯硝西泮)，负离子模式(包括3种药物：丙戊酸、托吡酯、苯巴比妥)，扫描方式：MRM，具体源参数和质谱参数如表4所示。
表4源参数和质谱参数
第一批(EPI 1)
源参数：CUR 40psi，CAD 6psi，IS 4500V，TEM 650℃，GS140 psi，GS270psi。质谱参数(同一分析批正负离子切换)：
第二批(EPI 2)
源参数：CUR 40psi，CAD 6psi，IS 4500V，TEM 650℃，GS140 psi，GS270psi。质谱参数：
第三批(EPI 3)
源参数：CUR 40psi，CAD 6psi，IS 4500V，TEM 650℃，GS140 psi，GS270psi。质谱参数：
/>
根据得到的质谱结果和预定的标准曲线，得到17种抗癫痫药物及2种代谢物的含量，包括化合物内标结果和同位素内标结果。
实施例2方法学验证
本发明按照“生物样品定量分析方法验证指导原则”【中国药典2020年版.四部[S].2020:466】的要求，开展方法验证，验证内容包括线性、准确度与精密度、选择性(特异性)、定量下限、残留、基质效应、稳定性。最后，本发明也成功应用于临床检测。
1.选择性
选择6份不同的空白基质血清，使用前与临床沟通确认未服用抗癫痫药物，按供试品处理方法处理、但萃取剂不加化合物内标且稀释剂不含同位素内标，分析结果按文件要求，干扰组分的响应低于分析物定量下限响应的20％，并低于内标响应的5％。结果是除CNZ项目第6个空白中干扰不符合要求外，其余所有分析物和内标结果均符合选择性要求。
2.残留
按供试品处理方法高浓度(ULOQ校准品)样品，平行5份。同时按选择性下处理得到5份空白样品。进样分析时按高浓度样品→空白样品→高浓度样品→空白样品…的顺序提交，重复5次。文件要求高浓度样品在空白样品中的残留应不超过定量下限的20％，并且不超过内标的5％。分析结果，CNZ在5份空白中的残留均超过20％，不符合要求，其余项目均符合要求。
3.线性
通过将已知浓度的分析物加入到空白基质中制备8个浓度的校正标样，按供试品制备方法处理后上机分析，平行5次实验。文件要求校正标样回算的浓度在标示值的±l5％内，定量下限处在±20％内，且至少75％校正标样，含最少6个有效浓度，应满足上述标准。整体分析，所有项目的结果符合文件要求，如表5所示。
表5线性考察实验结果(n＝5)
/>
备注：“NA”表示无相应项下结果。
4.定量下限
将标液与空白基质混合配制定量下限浓度质控品，按供试品制备方法处理后上机分析。在不同工作日分3批次考察，平行处理5份，结果见下表6。按文件要求定量下限准确度应在标示值的±20％范围内，批内及批间的变异系数不得超过20％。结果，CNZ项目定量下限准确度和精密度的结果均不符合文件要求，其余项目综合分析均符合文件要求。
表6定量下限浓度质控品考察的准确度与精密度
/>
备注：“NA”表示无相应项下内容，浓度的单位是μg/mL，其中PRN和CNZ单位为ng/mL。
5.准确度与精密度
将标液加入空白基质中配制4个浓度水平的质控品，在不同工作日分3批次考察分析方法的准确度与精密度，每个浓度水平质控品每批平行处理5份，按供试品方法处理后上机分析，实验结果见下表7。按文件要求，批内及批间的准确度均值一般应在质控样品标示值的±15％之内，批内及批间的变异系数一般不得超过15％。按此要求，低浓度水平的CNZ项目不符合要求，其余项目均符合要求。
表7准确度与精密度考察实验结果
/>
/>
/>
备注：“NA”表示无相应项下内容，浓度的单位是μg/mL，其中PRN和CNZ单位为ng/mL。
6.基质效应
使用6份不同的空白基质，分3个浓度水平考察基质效应。实验中，每一浓度水平分含基质和不含基质的两份样品，以不含基质和含基质中峰面积比值分别计算分析物和内标的基质因子，然后再计算分析物和内标的基质因子比值得内标归一化的基质因子，处理结果见下表8。按文件要求6批基质计算的内标归一化的基质因子的变异系数不得大于15％，按此要求PGB和CNZ的低浓度水平基质效应明显，其余项目的基质效应均符合文件要求。
表8内标归一化的基质因子处理结果(n＝6)
备注：“NA”表示无相应项下内容。
7.稀释可靠性
将标液加入空白基质中配制ULOQ 2倍浓度的质控品，然后用空白血清稀释2倍和5倍，然后按供试品处理方法处理上机分析，每一稀释平行操作5份，结果见下表9。文件要求，稀释后样品分析结果的准确度偏差±15％内，精密度变异系数RSD％小于15％，按此要求所有项目均可以稀释2倍和5倍处理。
表9样品稀释2倍和5倍样品的准确度和精密度结果(n＝5)
/>
备注：“NA”标识无相应项下内容。
8.稳定性
将标液和空白基质混合配备高低浓度3浓度水平(2个低浓度水平)的质控品，分别在不同条件下存储(室温、冷藏、冷冻以及冻融3次处理)，而后按供试品制备上机分析，于此同时考察处理后的供试品室温放置后的稳定性，所有结果见下表10。按文件要求，稳定性试验结果准确度偏差±15％内，精密度小于15％，按此要求CNZ项目处理后不建议室温存放超过24h，OXC项目不建议室温和冷藏，其余项目均可以室温存放3天、冷藏7天、冷冻2月、冻融3次处理、处理后室温放置48h稳定。
表10样品在不同存储条件下和处理后室温放置稳定性的结果(n＝3或5)
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/>
/>
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备注：“NA”表示无相应项下内容。
实施例3临床检测
本发明成功应用于临床样品的检测，每一项目的检测结果均有化合物内标结果(IS)和同位素内标结果(IL)，计算每一样品每一项目两个结果的相对偏差值(IS-IL)/IL％，累计相对偏差的均值，然后以每一相对偏差值和累计均值的偏差来评判检测结果，评判标准是偏差在±25％内即符合，每一项目至少累计1月的检测结果，结果见下表11，表11中不含的项目均未收到临床样品。
表11样品临床检测和评判结果
由以上实施例可知，本发明实现了17种抗癫痫药物及2种代谢物的检测。实施例的数据表明，参照国家药典中生物样品分析方法验证指导原则开展相应方法验证，验证内容包括线性、准确度与精密度、选择性、定量下限、残留、基质效应等均符合文件要求，稳定性可满足日常检测需求。本发明的检测方法，成功应用于临床检测。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本发明实施例在不经创造性劳动前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (10)

1.一种17种抗癫痫药物及2种代谢物的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
将待测样品与萃取剂混合后分离，得到上清液；所述萃取剂中含有化合物内标，所述化合物内标为17种抗癫痫药物及2种代谢物的有关物质、杂质或结构类似物；所述待测样品包括血清和/或血浆；
将所述上清液与稀释剂混合，得到供试品溶液；所述稀释剂中含有同位素内标；
将所述供试品溶液进行液相色谱-质谱分析，根据得到的质谱结果和预定的标准曲线，分别得到所述17种抗癫痫药物及2种代谢物的含量，所述标准曲线包括根据所述化合物内标得到的化合物内标标准曲线和根据所述同位素内标得到的同位素内标标准曲线；
所述液相色谱-质谱分析的液相色谱条件包括：色谱柱为氰基色谱柱；流动相A包括甲醇、水和乙酸铵，流动相B包括甲醇、乙腈和甲酸；流速：0.3～0.7mL/min，梯度洗脱，洗脱时间3～5min；进样量：5～20μL；柱温：30～40℃；
所述液相色谱-质谱分析的质谱条件包括：电喷雾离子源，14种抗癫痫药物和2种代谢物采用正离子模式，所述2种代谢物包括环氧卡马西平和10,11-二氢-10-羟基卡马西平，所述14种抗癫痫药物包括卡马西平、奥卡西平、拉莫三嗪、普瑞巴林、苯妥英、加巴喷丁、左乙拉西坦、氨己烯酸、卢非酰胺、拉考沙胺、吡仑帕奈、唑尼沙胺、扑米酮和氯硝西泮，3种抗癫痫药物采用负离子模式，所述3种抗癫痫药物包括丙戊酸、托吡酯和苯巴比妥，扫描方式：MRM，源参数：气帘气40～50psi，碰撞气6～7psi，电压4000～4500V，温度650℃，雾化气40psi，辅助气70psi。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述萃取剂包括甲醇和/或乙腈。
3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，所述萃取剂与待测样品的体积比为3～10:1。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述化合物内标包括化合物单体和/或化合物单体的盐，所述化合物单体包括10-氯卡马西平、2-甲基拉莫三嗪、布瓦西坦、苯妥英EP杂质F、2-乙基戊酸、N-甲基托吡酯、4-氨基丁酸、6-脱氟卢非酰胺、N-去甲酰基甲基-N-甲酰基乙基拉考沙胺、N-甲基唑尼沙胺和普瑞巴林甲酯中的一种或多种。
5.根据权利要求1或4所述的检测方法，其特征在于，所述同位素内标包括卡马西平-D2,15N、拉莫三嗪-13C3、奥卡西平-D4、(S)-普瑞巴林-D4、10,11-二氢-10-羟基卡马西平-D4、苯妥英-D10、加巴喷丁-D4、左乙拉西坦-D6、氨己烯酸-13C,D5、卢非酰胺-15N,D2、Rac-拉考沙胺-D3、吡仑帕奈-D5、唑尼沙胺-13C2,15N、丙戊酸-D6、托吡酯-D12、苯巴比妥-D5、扑米酮-D5和氯硝西泮-D4中的一种或多种。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述稀释剂为甲醇的水溶液。
7.根据权利要求1或6所述的检测方法，其特征在于，所述稀释剂中甲醇的体积分数为10～90％。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述稀释剂与上清液的体积比为1～30:1。
9.根据权利要求1或7所述的检测方法，其特征在于，所述液相色谱-质谱分析中液相色谱的洗针液为甲醇的水溶液，所述洗针液中甲醇的体积分数与稀释剂中甲醇的体积分数的比为1～2:1。
10.一种试剂盒，其特征在于，包括流动相A添加剂、流动相B添加剂、内标、稀释剂、萃取剂、校准品和质控品；所述流动相A添加剂为甲醇、水和乙酸铵；所述流动相B添加剂为甲酸；所述内标为化合物内标的甲醇溶液，所述化合物内标为17种抗癫痫药物及2种代谢物的有关物质、杂质或结构类似物；所述稀释剂为同位素内标的甲醇溶液；所述萃取剂为甲醇和乙腈的混合液；所述校准品和质控品均为含17种抗癫痫药物及2种代谢物的溶液，所述17种抗癫痫药物包括丙戊酸、托吡酯、卡马西平、奥卡西平、拉莫三嗪、左乙拉西坦、苯妥英、唑尼沙胺、加巴喷丁、普瑞巴林、氨己烯酸、吡仑帕奈、卢非酰胺、拉考沙胺、扑米酮、苯巴比妥和氯硝西泮；所述2种代谢物包括环氧卡马西平和10,11-二氢-10-羟基卡马西平。
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