RU2683032C1 - Способ определения дабигатрана в сыворотке крови человека - Google Patents
Способ определения дабигатрана в сыворотке крови человека Download PDFInfo
- Publication number
- RU2683032C1 RU2683032C1 RU2018121391A RU2018121391A RU2683032C1 RU 2683032 C1 RU2683032 C1 RU 2683032C1 RU 2018121391 A RU2018121391 A RU 2018121391A RU 2018121391 A RU2018121391 A RU 2018121391A RU 2683032 C1 RU2683032 C1 RU 2683032C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- dabigatran
- human serum
- sample
- quantitative determination
- promethazine
- Prior art date
Links
- YBSJFWOBGCMAKL-UHFFFAOYSA-N dabigatran Chemical compound N=1C2=CC(C(=O)N(CCC(O)=O)C=3N=CC=CC=3)=CC=C2N(C)C=1CNC1=CC=C(C(N)=N)C=C1 YBSJFWOBGCMAKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 55
- 229960003850 dabigatran Drugs 0.000 title claims abstract description 50
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 title claims abstract description 33
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 25
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 20
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 15
- PWWVAXIEGOYWEE-UHFFFAOYSA-N Isophenergan Chemical compound C1=CC=C2N(CC(C)N(C)C)C3=CC=CC=C3SC2=C1 PWWVAXIEGOYWEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 14
- 229960003910 promethazine Drugs 0.000 claims abstract description 14
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 claims abstract description 11
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 9
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 claims abstract description 8
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 claims abstract description 8
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 claims abstract description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims abstract description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 5
- 238000007865 diluting Methods 0.000 claims abstract description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims abstract 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 11
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 11
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 9
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 6
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 claims description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 3
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 claims 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 230000006920 protein precipitation Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 37
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 7
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 6
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 5
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 5
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 5
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 5
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 4
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 4
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 4
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 3
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 3
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 2
- 238000004807 desolvation Methods 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 239000012716 precipitator Substances 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 238000004704 ultra performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- VZTDIZULWFCMLS-UHFFFAOYSA-N ammonium formate Chemical compound [NH4+].[O-]C=O VZTDIZULWFCMLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 150000001793 charged compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000007820 coagulation assay Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 229940066336 pradaxa Drugs 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 1
- 238000001195 ultra high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
- G01N30/72—Mass spectrometers
Landscapes
- Physics & Mathematics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
Abstract
Изобретение относится к фармации, фармакологии и клинической фармакологии. Способ количественного определения дабигатрана в сыворотке крови человека включает приготовление калибровочных и анализируемых образцов путем добавления прометазина в качестве внутреннего стандарта, осаждение белков метанолом, перемешивание, центрифугирование с дальнейшим отбором супернатанта, его разбавление деионизированной водой, перемешивание с последующим хроматографическим разделением компонентов пробы, регистрацию сигнала масс-спектрометрического детектора, полученного в режиме мониторинга множественных реакций при положительной ионизации. 3 з.п. ф-лы, 6 ил., 4 табл., 3 пр.
Description
Изобретение относится к фармации, фармакологии и клинической фармакологии, исследованию биологических материалов, в частности к способам количественного определения дабигатрана в сыворотке крови человека при терапевтическом лекарственном мониторинге и исследованиях фармакокинетики.
Известен способ определения дабигатрана в плазме крови человека методом сверхвысокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием (СВЭЖХ МС/МС) [1]. В данной работе пробоподготовку проводили осаждением белков плазмы крови смесью метанол-0,1 н раствор HCl (90:10), содержащей 13С6-аналог дабигатрана (внутренний стандарт) с концентрацией 50 мкг/л. Хроматографическое разделение проводили с использованием колонки Acquity UPLC ВЕН С8, 100 мм × 1 мм, 1,7 мкм (Waters). Недостатками способа являются:
- элюирование анализируемого соединения двумя отдельными зонами, что говорит о некорректном выборе условий пробоподготовки;
- избыточное разбавление осадителем аликвоты образца (в 7 раз);
- нежелательное использование в растворе осадителя хлористоводородной кислоты, обладающей значительным коррозионным эффектом для масс-спектрометрического оборудования;
-узкий линейный диапазон (1-500 нг/мл), в случае высоких концентраций (10000 нг/мл) авторы разбавляют пробу интактной плазмой крови человека, что увеличивает время на пробоподготовку.
Также известен способ совместного определения дабигатрана и ривороксабана в сыворотке крови человека методом СВЭЖХ МС/МС [2].
Пробоподготовка и используемый внутренний стандарт аналогичны описанным выше в работе Delavenne X. и др. [1]. Однако хроматографическое разделение проводили с использованием колонки Acquity UPLC ВЕН С18, 100 мм × 2,1 мм, 1,7 мкм (Waters).
К недостаткам этого способа следует отнести:
- узкий аналитический диапазон 2,5 - 500 нг/мл;
- избыточное разбавление осадителем аликвоты образца (в 7 раз);
- нежелательное использование в растворе осадителя хлористоводородной кислоты, обладающей значительным коррозионным эффектом для масс-спектрометрического оборудования;
- отсутствие описания используемого линейного градиента затрудняет возможность воспроизведения способа и требует дополнительного времени для разработки новых условий хроматографического разделения.
В качестве прототипа выбран способ определения дабигатрана в сыворотке крови человека методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием (ВЭЖХ МС/МС) [3]. При анализе дабигатрана методом ВЭЖХ МС/МС необходима предварительная пробоподготовка, заключающаяся в добавлении к образцу D3-аналога дабигатрана (внутренний стандарт), в удалении белков сыворотки крови путем осаждения ацетонитрилом с последующим центрифугированием, в разбавлении образцов подвижной фазой и повторном центрифугировании. Хроматографическое разделение проводится в режиме градиентного элюирования с подвижной фазой А (10 мМоль формиат аммония, рН 4,5) / В (0,1% раствор муравьиной кислоты в ацетонитриле) на колонке (С 18, 50 мм × 2,1 мм, 1,7 мкм) с масс-спектрометрическим детектором. Предел количественного определения - 1,1 нг/мл.
К недостаткам прототипа следует отнести:
- узкий аналитический диапазон 1,1 - 412 нг/мл;
- дополнительная стадия центрифугирования, увеличивающая время, затрачиваемое на пробоподготовку;
- избыточное разбавление исходного образца в процессе пробоподготовки (в 8 раз);
- отсутствие описания используемого линейного градиента;
- необходимость оборудования, обеспечивающего работу при сверхвысоком давлении, из-за использования сорбента с диаметром частиц 1,7 мкм;
- не указана концентрация рабочего раствора внутреннего стандарта.
Задачей изобретения является упрощение пробоподготовки, расширение аналитического диапазона, повышение точности и воспроизводимости количественного определения дабигатрана в сыворотке крови человека, замена изотопно-меченых аналогов дабигатрана на более дешевый и доступный внутренний стандарт, а также расширение спектра аналитического оборудования, пригодного для количественного определения дабигатрана в сыворотке крови человека.
Поставленная задача решается благодаря:
- оптимизации процедуры пробоподготовки биологических образцов и, соответственно, существенному снижению затрачиваемого времени на пробоподготовку за счет одного этапа центрифугирования;
- уменьшению разбавления образцов, что позволяет расширить аналитический диапазон;
- включению в процедуру пробоподготовки стадии осаждения белков метанолом (более слабый элюент по сравнению с ацетонитрилом), разбавления супернатанта деионизированной водой (слабый элюент), что улучшает хромотаграфическое разделение компонентов полученных образцов и позволяет повысить точность и воспроизводимость результатов;
- применению прометазина как более дешевого и доступного внутреннего стандарта вместо изотопно-меченых аналогов дабигатрана;
- проведению хроматографического разделения на сорбенте с диаметром частиц 3,5 мкм с целью снижения рабочего давления, что позволяет расширить спектр аналитического оборудования, пригодного для количественного определения дабигатрана в сыворотке крови человека.
В заявляемом изобретении способ определения дабигатрана (Фиг. 1) в сыворотке крови человека осуществляется методом ВЭЖХ МС/МС.
Калибровочные образцы готовят путем прибавления к 180 мкл интактной сыворотки крови 20 мкл стандартных растворов дабигатрана до получения концентраций в диапазоне от 1 до 1000 нг/мл.
Пробоподготовку калибровочных и анализируемых образцов сыворотки крови проводят методом осаждения белков следующим образом: к 200 мкл образца, помещенным в центрифужные микропробирки типа «эппендорф» вместимостью 2 мл, прибавляют 5 мкл рабочего раствора внутреннего стандарта прометазина (100,00 нг/мл), затем прибавляют 400 мкл метанола, перемешивают на смесителе типа «вортекс» в течение 15 с, затем центрифугируют в течение 15 мин при 16873 g. Далее 500 мкл супернатанта переносят в хроматографические виалы, прибавляют 200 мкл деионизированной воды, перемешивают на смесителе типа «вортекс» в течение 15 с и помещают в автоматический пробоотборник хроматографа. Разбавление анализируемого образца производят с целью повышения точности и воспроизводимости. Суммарное разведение образца на всех стадиях пробоподготовки происходит в 4,2 раза. Исключение стадии разбавления анализируемого образца может привести к появлению пиков не сорбируемых компонентов, снижению точности и воспроизводимости результатов количественного определения дабигатрана в сыворотке крови человека.
Разбавление образца на стадии пробоподготовки слабым растворителем незначительно и необходимо для элюирования дабигатрана в виде одной зоны. Такая пробоподготовка при последующем хроматографическом разделении обеспечивает элюирование дабигатрана в виде одного симметричного пика, расширяет аналитический диапазон и повышает точность и воспроизводимость результатов. После добавления слабого растворителя (в данном случае воды) не требуется дополнительное центрифугирование, достаточно встряхнуть образец на смесителе типа «вортекс», что позволяет сэкономить время на стадии пробоподготовки.
Условия хроматографического разделения и детектирования
Количественное определение дабигатрана проводят на высокоэффективном жидкостном хроматографе Nexera (Shimadzu, Япония), оснащенном градиентным насосом, термостатом колонок, дегазатором, термостатируемым автоматическим пробоотборником и тандемным масс-спектрометрическим детектором (тройным квадруполем) LCMS-8040 (Shimadzu, Япония). Обработку первичных данных проводят при помощи программного обеспечения LabSolutions (Ver. 5.3), SHIMADZU CORPORATION, Япония.
Колонка (неподвижная фаза): Waters XBridge™ 50 мм × 4,6 мм с сорбентом С18, диаметр частиц 3,5 мкм.
Примечание. Использование сорбента С18 с размером частиц 3,5 мкм позволяет проводить количественное определение дабигатрана при рабочем давлении в системе, не превышающем 17 МПа, что обеспечивает возможность воспроизведения заявляемого изобретения при помощи наиболее широко распространенного аналитического оборудования при сохранении скорости анализа.
Температура термостата колонок: 40°С.
Подвижная фаза:
- элюент А: 0,1% раствор муравьиной кислоты в деионизированной воде (по объему),
- элюент В: 0,1% раствор муравьиной кислоты в ацетонитриле (по объему).
Режим элюирования с градиентом по составу подвижной фазы представлены в Таблице 1.
Объем вводимой пробы: 20 мкл.
Время регистрации хроматограммы по масс-спектрометрическому детектору: 0-2,5 мин.
Время удерживания дабигатрана: около 1,958 мин.
Время удерживания прометазина: около 2,462 мин.
Параметры источника ионизации: распыляющий газ 3 л/мин, осушающий газ 20 л/мин, блок нагрева 400°С, линия десольватации 200°С, напряжение на капилляре +5 кВ.
Масс-спектр дабигатрана, полученный в режиме сканирования полного ионного тока (Фиг. 2), позволяет определить ион-предшественник, соответствующий [М+Н]+. Выбор дочернего (фрагментного) иона производят на основании данных регистрации сигнала дабигатрана с помощью масс-спектрометрического детектора в режиме сканирования дочерних ионов (Фиг. 3). Выбранные ионы-предшественники (молекулярные ионы) и дочерние (фрагментные) ионы используют для детектирования дабигатрана и прометазина в режиме мониторинга множественных реакций.
Условия детектирования дабигатрана и прометазина (внутренний стандарт) в режиме мониторинга множественных реакций представлены в Таблице 2.
Аналитический диапазон составляет от 1 до 1000 нг/мл дабигатрана в сыворотке крови человека, коэффициент корреляции>0,99 (Фиг. 4). Точность и воспроизводимость результатов рассчитывают в соответствии с требованиями Руководства по экспертизе лекарственных средств [4]. Относительная ошибка, характеризующая точность измерений, не превышает 8,94%, а относительное стандартное отклонение, позволяющее оценить воспроизводимость результатов, имеет значения не более 9,20% (Таблицы 3 и 4).
Изобретение позволяет:
1. Упростить пробоподготовку за счет уменьшения количества проводимых операций.
2. Расширить аналитический диапазон (1-1000 нг/мл), уменьшив степень разбавления образцов до 4,2 раз.
3. Повысить точность и воспроизводимость количественного определения дабигатрана в сыворотке крови человека за счет разбавления образца слабым элюентом и, как следствие, элюирования дабигатрана в виде одной зоны на хроматограмме.
4. Заменить изотопно-меченые аналоги дабигатрана в качестве внутреннего стандарта и применять для этой цели прометазин.
5. Расширить спектр аналитического оборудования, пригодного для количественного определения дабигатрана в сыворотке крови человека за счет проведения хроматографического разделения на сорбенте с размером частиц 3,5 мкм, что обеспечивает рабочее давление в системе не более 17 МПа при сохранении скорости анализа.
Краткое описание чертежей и иных материалов (Приложения 1-6):
Фиг. 1. Структурная формула дабигатрана.
Фиг. 2. Регистрация сигнала дабигатрана с помощью масс-спектрометрического детектора в режиме полного ионного тока.
Фиг. 3. Регистрация сигнала дабигатрана с помощью масс-спектрометрического детектора в режиме сканирования дочерних ионов, получаемых при фрагментации иона-предшественника.
Фиг. 4. Калибровочная зависимость отношения площади пика дабигатрана к площади пика прометазина от отношения концентрации дабигатрана к концентрации прометазина.
Фиг. 5. Хроматограмма образца сыворотки крови пациента с содержанием дабигатрана 99,02 нг/мл и рабочего стандартного раствора прометазина в концентрации 2,50 нг/мл
Фиг. 6. Хроматограмма образца интактной сыворотки крови человека, не содержащей дабигатран
Возможность осуществления заявляемого изобретения показана следующими примерами:
Пример 1. Определение содержания дабигатрана в сыворотке крови человека
Возраст 62 года, женский пол, назначен препарат «Прадакса» в дозировке 150 мг 2 р/д.
Забор крови проводится 27.02.17 г. в 7:00 и в 11:00 (через 4 ч после приема препарата).
Проведение анализа
1. Получение сыворотки крови человека. Кровь в объеме 4,9 мл инкубируют при 37°С в течение 30 мин, затем центрифугируют 10 мин при 2000 g, отбирают сыворотку крови, разливают на аликвоты и используют для дальнейшего анализа.
2. Калибровочные образцы готовят путем прибавления к 180 мкл интактной сыворотки крови 20 мкл стандартных растворов дабигатрана до получения концентраций в диапазоне от 1 до 1000 нг/мл.
3. Пробоподготовку калибровочных и анализируемых образцов сыворотки крови проводят методом осаждения белков следующим образом: к 200 мкл образца, помещенным в центрифужные микропробирки типа «эппендорф» вместимостью 2 мл, прибавляют 5 мкл рабочего раствора внутреннего стандарта прометазина (100,00 нг/мл), затем прибавляют 400 мкл метанола, перемешивают на смесителе типа «вортекс» в течение 15 с, затем центрифугируют в течение 15 мин при 16873 g. Далее 500 мкл супернатанта переносят в хроматографические виалы, прибавляют 200 мкл деионизированной воды и перемешивают на смесителе типа «вортекс» в течение 15 с.
4. Полученную пробу помещают в автоматический пробоотборник хроматографа.
Количественное определение дабигатрана проводят на высокоэффективном жидкостном хроматографе Nexera (Shimadzu, Япония), оснащенном градиентным насосом, термостатом колонок, дегазатором, термостатируемым автоматическим пробоотборником и тандемным масс-спектрометрическим детектором (тройным квадруполем) LCMS-8040 (Shimadzu, Япония). Обработку первичных данных проводят при помощи программного обеспечения LabSolutions (Ver. 5.3), SHIMADZU CORPORATION, Япония
Колонка: Waters XBridge™C18, 50 мм × 4,6 мм, 3,5 мкм.
Температура термостата колонок: 40°С.
Подвижная фаза:
- элюент А: 0,1% раствор муравьиной кислоты в деионизированной воде (по объему),
- элюент В: 0,1% раствор муравьиной кислоты в ацетонитриле (по объему).
Условия хроматографирования по составу подвижной фазы представлены в Таблице 1.
Объем вводимой пробы: 20 мкл.
Время регистрации хроматограммы по масс-спектрометрическому детектору: 0-2,5 мин.
Время удерживания дабигатрана: около 1,958 мин.
Время удерживания прометазина: около 2,462 мин.
Параметры источника ионизации: распыляющий газ 3 л/мин, осушающий газ 20 л/мин, блок нагрева 400°С, линия десолъватации 200°С, напряжение на капилляре +5 кВ.
Параметры детектирования в режиме мониторинга множественных реакций при положительной ионизации: m/z 472,15→m/z 289,10 для дабигатрана и m/z 285,10→m/z 86,10 для прометазина.
В результате анализа обнаружено 32,80 и 99,02 нг/мл (Фиг. 5) дабигатрана соответственно. От момента забора крови у пациента до предоставления результатов затрачивается не более 1 ч.
Следующий забор крови проводится 27.02.17 г. в 19:00 и в 23:00 (через 4 ч после приема препарата). Анализ проводят способом описанным выше. Обнаружено 23,25 и 25,79 нг/мл дабигатрана соответственно. От момента забора крови у пациента до предоставления результатов затрачивается не более 1 ч.
Данный пример показывает возможность количественного определения дабигатрана в сыворотке крови человека заявляемым способом.
Пример 2. Определение содержания дабигатрана в интактной сыворотке крови человека
Анализ интактной сыворотки крови человека, достоверно не содержащей дабигатран, проводят способом, описанным в Примере 1.
На хроматограмме (Фиг. 6) полученного образца отсутствует пик, соответствующий дабигатрану по времени удерживания.
Таким образом, данный пример демонстрирует селективность заявляемого способа и отсутствие риска предоставления ложноположительных результатов количественного определения дабигатрана в сыворотке крови человека.
Пример 3. Определение точности и воспроизводимости результатов определения дабигатрана в сыворотке крови человека
При оценке точности и воспроизводимости результатов проводят анализ образцов интактной сыворотки крови человека, а также интактной сыворотки крови человека с добавлением стандартных растворов до получения концентраций дабигатрана: 1 нг/мл, 5 нг/мл, 500 нг/мл, 1000 нг/мл. Анализ проводят способом, описанным в Примере 1, в рамках 3 аналитических циклов, включающих по 5 образцов для каждого уровня концентраций. Точность и воспроизводимость определяют внутри одного аналитического цикла (n=5) и между тремя циклами (n=15). Рассчитывают величины относительной ошибки (Е, %) и относительного стандартного отклонения (RSD, %), приведенные в Таблицах 3 и 4. 
Данный пример показывает возможность количественного определения дабигатрана в сыворотке крови человека с приемлемой точностью и воспроизводимостью в концентрации от 1,00 до 1000,00 нг/мл, что соответствует заявленному аналитическому диапазону.
Представленные примеры не ограничивают объем притязаний настоящего изобретения и служат только для цели иллюстрации.
Список литературы
1. Delavenne X. et al. UPLC MS/MS assay for routine quantification of dabigatran - a direct thrombin inhibitor - in human plasma // Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 2012. V. 58. P. 152-156.
2. Korostelev M. et al. Simultaneous determination of rivaroxaban and dabigatran levels in human plasma by high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry // Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 2014. V. 100. P. 230-235.
3. Antovic J.P. et al. Evaluation of coagulation assays versus LC-MS/MS for determinations of dabigatran concentrations in plasma // European Journal of Clinical Pharmacology. 2013. V. 69. №11. P. 1875-1881.
4. Руководство по экспертизе лекарственных средств. Под ред. проф. А.Н. Миронова. Том I. М.: Гриф и К, 2013. С. 204-205.
Claims (4)
1. Способ количественного определения дабигатрана в сыворотке крови человека, характеризующийся линейным аналитическим диапазоном и включающий приготовление калибровочных и анализируемых образцов путем добавления прометазина в качестве внутреннего стандарта, осаждения белков метанолом, перемешивания, центрифугирования с дальнейшим отбором супернатанта, его разбавлением деионизированной водой, перемешиванием с последующим хроматографическим разделением компонентов пробы, регистрацией сигнала масс-спектрометрического детектора, полученного в режиме мониторинга множественных реакций при положительной ионизации.
2. Способ по п. 1, характеризующийся разбавлением супернатанта после центрифугирования деионизированной водой в соотношении 2,5:1.
3. Способ по п. 1, характеризующийся использованием сорбента с размером частиц 3,5 мкм и рабочим давлением в системе не более 17 МПа при сохранении скорости анализа.
4. Способ по п. 1, характеризующийся линейным аналитическим диапазоном 1-1000 нг/мл.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018121391A RU2683032C1 (ru) | 2018-06-09 | 2018-06-09 | Способ определения дабигатрана в сыворотке крови человека |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018121391A RU2683032C1 (ru) | 2018-06-09 | 2018-06-09 | Способ определения дабигатрана в сыворотке крови человека |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2683032C1 true RU2683032C1 (ru) | 2019-03-26 |
Family
ID=65858643
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2018121391A RU2683032C1 (ru) | 2018-06-09 | 2018-06-09 | Способ определения дабигатрана в сыворотке крови человека |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2683032C1 (ru) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114264749A (zh) * | 2021-12-27 | 2022-04-01 | 卓和药业集团股份有限公司 | 一种达比加群酯的分析检测方法 |
| CN114740125A (zh) * | 2022-05-12 | 2022-07-12 | 杭州度安医学检验实验室有限公司 | 一种基于lc-ms的10种心血管药物血清的检测方法及其试剂盒 |
-
2018
- 2018-06-09 RU RU2018121391A patent/RU2683032C1/ru not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| J.P. Antovic et al. Evaluation of coagulation assays versus LC-MS/MS for determinations of dabigatran concentrations in plasma / Eur J Clin Pharmacol, 2013, 69 (11), pages 1875-1881 [Найдено в Интернете он-лайн 05.02.2019 https://www.endotell.ch/files/dokumente/Antovic%20HPLC-Dabigatran%20I%20E%20J%20C%20Pharm%202013.pdf]. * |
| J.P. Antovic et al. Evaluation of coagulation assays versus LC-MS/MS for determinations of dabigatran concentrations in plasma / Eur J Clin Pharmacol, 2013, 69 (11), pages 1875-1881 [Найдено в Интернете он-лайн 05.02.2019 https://www.endotell.ch/files/dokumente/Antovic%20HPLC-Dabigatran%20I%20E%20J%20C%20Pharm%202013.pdf]. M.Schmohl et al. Measurement of dabigatran plasma concentrations by calibrated thrombin clotting time in comparison to LC-MS/MS in human volunteers on dialysis / Thrombosis Research, 2015, 135, pages 532-536. А.Л. БЕРКОВСКИЙ и др. Лабораторный контроль действия дабигатрана / КОНСИЛИУМ. ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА, 2016, N 8 (148) [Найдено в Интернете он-лайн 05.02.2019 file:///C:/Users/otd1442/Downloads/laboratornyy-kontrol-deystviya-dabigatrana%20(1).pdf]. * |
| M.Schmohl et al. Measurement of dabigatran plasma concentrations by calibrated thrombin clotting time in comparison to LC-MS/MS in human volunteers on dialysis / Thrombosis Research, 2015, 135, pages 532-536. * |
| А.Л. БЕРКОВСКИЙ и др. Лабораторный контроль действия дабигатрана / КОНСИЛИУМ. ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА, 2016, N 8 (148) [Найдено в Интернете он-лайн 05.02.2019 file:///C:/Users/otd1442/Downloads/laboratornyy-kontrol-deystviya-dabigatrana%20(1).pdf]. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114264749A (zh) * | 2021-12-27 | 2022-04-01 | 卓和药业集团股份有限公司 | 一种达比加群酯的分析检测方法 |
| CN114740125A (zh) * | 2022-05-12 | 2022-07-12 | 杭州度安医学检验实验室有限公司 | 一种基于lc-ms的10种心血管药物血清的检测方法及其试剂盒 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Schleicher et al. | Isotope dilution ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for simultaneous measurement of 25-hydroxyvitamin D2, 25-hydroxyvitamin D3 and 3-epi-25-hydroxyvitamin D3 in human serum | |
| US20170328921A1 (en) | Methods for detecting hormones and other analytes | |
| Helfer et al. | Direct analysis of the mushroom poisons α-and β-amanitin in human urine using a novel on-line turbulent flow chromatography mode coupled to liquid chromatography–high resolution-mass spectrometry/mass spectrometry | |
| RU2749566C1 (ru) | Способ определения амиодарона и его основного метаболита дезэтиламиодарона в сыворотке крови человека | |
| US20220349897A1 (en) | Amyloid beta detection by mass spectrometry | |
| RU2683032C1 (ru) | Способ определения дабигатрана в сыворотке крови человека | |
| CN116973464A (zh) | 一种17种抗癫痫药物及2种代谢物的检测方法 | |
| CN112014509A (zh) | 同步测定样品中血管紧张素i和醛固酮的方法 | |
| CN111337615A (zh) | 液质联用技术同时检测人血浆中奥美拉唑、雷贝拉唑、兰索拉唑和泮托拉唑对映体的浓度 | |
| CN109900841B (zh) | 一种同时测定血浆中氨基糖苷类抗生素药物浓度的hplc-ms/ms方法 | |
| Li et al. | A comparison of liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) and enzyme-multiplied immunoassay technique (EMIT) for the determination of the cyclosporin A concentration in whole blood from Chinese patients | |
| CN112782322A (zh) | 基于lc-ms同时测定人血浆中8种抗结核药物的方法 | |
| CN113820424A (zh) | 一种同时测定人血浆中14种抗抑郁药浓度的hplc-ms/ms方法 | |
| Adamowicz et al. | Simple approach for evaluation of matrix effect in the mass spectrometry of synthetic cannabinoids | |
| Vicente et al. | Measurement of serum testosterone using high-performance liquid chromatography/tandem mass spectrometry | |
| Varga et al. | Rapid liquid chromatography tandem mass spectrometry determination of rivaroxaban levels in human plasma for therapeutic drug monitoring | |
| CN113341027A (zh) | 高效液相色谱串联质谱检测唾液中睾酮的方法及试剂盒 | |
| Sun et al. | Quantitative determination of human serum testosterone via isotope dilution ultra‑performance liquid chromatography tandem mass spectrometry | |
| Tang et al. | A tandem liquid chromatography and tandem mass spectrometry (LC/LC–MS/MS) technique to separate and quantify steroid isomers 11β-methyl-19-nortestosterone and testosterone | |
| CN105092733B (zh) | Lc‑ms测试物中不挥发性缓冲盐含量的降低方法和装置 | |
| CN110726799A (zh) | 同时检测血液中25羟基-维生素d3和25羟基-维生素d2含量的方法 | |
| Fernández et al. | High-Throughput Analysis of Amphetamines in Blood and Urine with Online Solid-Phase Extraction-Liquid Chromatography—Tandem Mass Spectrometry | |
| CN110849981A (zh) | 维生素d定量检测的样本前处理溶液及其使用方法 | |
| WO2020148394A1 (en) | High speed sample workflow for lc-ms based hba1c measurement | |
| Nalini et al. | New validated LC-MS/MS simultaneous estimation of Lopinavir and Ritonavir in human plasma positive ion mode using Deuterated internal standards |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20200610 |