CN110849981A - 维生素d定量检测的样本前处理溶液及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种维生素D定量检测的样本前处理溶液，包括生理盐水、硫酸葡聚糖钠盐与β‑异嗜性阻断剂，本发明使用的硫酸葡聚糖钠盐和β‑异嗜性抗体在一定程度上能很好的使得待分析物25‑羟基维生素D与结合蛋白充分分离，同时降低血清基质中非特异性的干扰作用，在样本的进一步分离纯化过程中能够很好的得以分离，经过处理的样本可以得到高质量的待分析物，提高了维生素D的定量检测的准确度。

Description

维生素D定量检测的样本前处理溶液及其使用方法
技术领域
本发明涉及维生素D的定量检测领域，具体涉及一种维生素D定量检测的样本前处理溶液及其使用方法。
背景技术
维生素D是一种类固醇激素,包括2种类型：维生素D2和维生素D3。通过吸收在机体内转化为25-羟基维生素D2[25-hydroxyvitamin D2，25(OH)D2]和 25-羟基维生素D3[25-hydroxyvitamin D3，25(OH)D3]，总称25-羟基维生素D[25-hydroxyvitamin D，25(OH)D]。机体系统循环中的25(OH)D被认为是反映人体内维生素D水平的重要指标。
维生素D是参与机体生理功能重要微量元素，主要生理功能是参与机体钙磷代谢和免疫调节。有骨质疏松、骨软化、佝偻病、高甲状旁腺激素血症、做过甲状腺手术、长期腹泻的患者，发生骨折或近期经常跌倒的老年人，长期卧床、日光照射减少或深色皮肤人群，肥胖、怀孕和哺乳期、激素治疗、吸收不良综合征、肝功能衰竭、肉芽肿、慢性肾病患者和肾移植患者，都属于维生素D 缺乏的高危人群。若存在明显维生素D缺乏，可补充维生素D补充剂。由于人体对维生素D补充剂吸收的个体差异性很大，盲目补充可能存在潜在风险，为避免补充不足或补充过量造成维生素D中毒，服用前后进行检测十分必要。
临床实验室中使用的检测方法包括竞争性维生素D蛋白结合试验(CPBA)，免疫试验(酶联免疫、化学发光等)，高效液相色谱(HPLC)和液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)等。酶免疫分析法曾经是检测血清中25(OH)D浓度的最主要方法，酶免疫分析法的主要缺陷是抗体之间的交叉反应导致的方法特异性不足。而色谱分析法可对这些分析物进行有效分离，从而获得足够的特异性。液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)法有很大的优势：高选择性、特异性和灵敏度。该分析技术已越来越广泛地用于临床检验实验室中对25(OH)D的分析。
目前用于体外定量人体维生素D的样本类型有：唾液样本、血清或血浆样本、干血斑(DBS)样本等。样本的前处理方式有液液萃取、固相萃取和利用分析物专属性的提取技术等，处理过程主要目的是将待分析物从复杂的样本组成中有效提取出来，得到高质量的待分析物。以临床主要的待测样本类型(血清样本)为例，血循环中25(OH)D与结合蛋白的紧密结合，准确定量维生素D 必须先将其与结合蛋白彻底分离，同时有效控制基质中其他蛋白对带分析物25 (OH)D的非特异性结合作用。尤其在一些特殊类型血清样本，如类风湿因子阳性样本，类风湿因子作为一类自身抗体会对测试产生干扰作用。目前市售的免疫学方法都有各自的专利方法分离维生素D和结合蛋白。最新的检测方法甚至包含特殊阻断剂,能够有效减少样本中嗜异性抗体对检测结果的干扰。而对于 LC-MS/MS而言,沉淀样本中的结合蛋白，降低基质的干扰作用，使用有机溶剂萃取维生素D是检测的必须步骤。
液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)技术作为小分子生物分析的标准检测手段，如今，也正在成为生物基质中大分子化合物(多肽类、核苷酸类及蛋白质类)定量分析的重要工具之一，LC-MS/MS作为功能强大且精细复杂的分析工具，其分析效果可能受待分析样品特性的影响。大部分生物样品在没有预处理的情况下，不能直接进行LC-MS/MS分析。不管采用何种质谱检测器进行分析，样本预处理的原则相同。满足LC-MS/MS分析两部分要求：液相色谱部分用来分析液态样品，进入色谱系统的样品应该是液态的，重要的是要没有颗粒，蛋白质一般也不能注入液相色谱仪；质谱部分用来产生气态离子，并且在高真空条件下检测，为确保良好的离子化效率不能将非挥发性酸、碱或盐导入到离子源中。离子化过程中基质成分对目标物的基质效应(即干扰效应：离子增强或离子抑制)在分析时也广受关注。基质效应经常很难预测，如果处理不当会导致定量不准确。在大多数情况下，使用稳定同位素标记内标(SIL-IS)可以矫正一定基质效应的影响。如何提高检测的准确性，降低基质的干扰作用，样本的前处理过程会起到非常关键的作用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种维生素D定量检测的样本前处理溶液及其使用方法，能够有效降低基质的干扰作用，提高检测的准确性。
为了解决上述技术问题，本发明的技术方案为：
一种维生素D定量检测的样本前处理溶液，包括生理盐水、硫酸葡聚糖钠盐与β-异嗜性阻断剂。
作为优选，以生理盐水为基准，每毫升生理盐水先后添加80-100mg硫酸葡聚糖钠盐和1.5-2.0mgβ-异嗜性阻断剂，并混合均匀。
作为优选，所述生理盐水的氯化钠浓度为0.9％。
本发明提供的降低基质干扰作用的维生素D定量检测的样本前处理溶液的使用方法，包括以下步骤：
S1、取本发明溶液100μL，取200μL血清样本，混合后进行涡旋混匀1min，静置5min；
S2、将S1中得到的样本，放入离心机，在13000rpm、4℃的条件下离心10min；
S3、离心后取上清液，加入200μL乙醇，涡旋混匀1min，然后静置5min；
S4、将S3中得到的样本在13000rpm、4℃的条件下离心10min；
S5、离心后取上清液于新的离心管，使用氮气吹干，加分离流动相复溶混匀后即可用于LC-MS/MS检测。
本发明采用上述技术方案，具有以下有益效果：
本发明使用的DSS(硫酸葡聚糖钠盐)和β-异嗜性抗体在一定程度上能很好的使得待分析物25-羟基维生素D与结合蛋白充分分离，同时降低血清基质中非特异性的干扰作用，在样本的进一步分离纯化过程中能够很好的得以分离，经过处理的样本可以得到高质量的待分析物，提高了维生素D的定量检测的准确度。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
实施例
一种维生素D定量检测的样本前处理溶液，取浓度为0.9％的生理盐水10ml，以生理盐水为基准，添加800mg硫酸葡聚糖钠盐和15mgβ-异嗜性阻断剂，充分混合均匀后，取100μL前处理溶液与200μL血清样本混合后，涡旋混匀1min，静置5min，然后将混合溶液放入离心机，在13000rpm、4℃的条件下离心10min，完成离心后，取溶液中的上清液加入200μL乙醇，然后涡旋混匀1min后静置5min，将混合后的溶液在13000rpm、4℃的条件下离心10min，离心后取上清液置入新的离心管，使用氮气吹干仪吹干，然后加入分离流动相复溶混匀后即可用于LC-MS/MS检测，该种检测方法能够使25-羟基维生素D与结合蛋白充分分离，在样本进一步分离纯化过程中能够很好的得以分离，同时降低血清基质中非特异性的干扰作用，有效提高维生素D的检测精度。
以上本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。

Claims (4)

1.一种维生素D定量检测的样本前处理溶液，其特征在于：包括生理盐水、硫酸葡聚糖钠盐与β-异嗜性阻断剂。
2.根据权利要求1所述的维生素D定量检测的样本前处理溶液，其特征在于：以生理盐水为基准，每毫升生理盐水先后添加80-100mg硫酸葡聚糖钠盐和1.5-2.0mgβ-异嗜性阻断剂，并且混合均匀。
3.根据权利要求1所述的维生素D定量检测的样本前处理溶液，其特征在于：所述生理盐水的氯化钠浓度为0.9％。
4.一种如权利要求1-3任一项所述的维生素D定量检测的样本前处理溶液的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、取本发明溶液100μL，取200μL血清样本，混合后进行涡旋混匀1min，静置5min；
S2、将S1中得到的样本，放入离心机，在13000rpm、4℃的条件下离心10min；
S3、离心后取上清液，加入200μL乙醇，涡旋混匀1min，然后静置5min；
S4、将S3中得到的样本在13000rpm、4℃的条件下离心10min；
S5、离心后取上清液于新的离心管，使用氮气吹干，加分离流动相复溶混匀后即可用于LC-MS/MS检测。
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