JP2022514379A - Ｌｃ－ｍｓｍｓを使用してテストステロンを測定するための方法 - Google Patents

Ｌｃ－ｍｓｍｓを使用してテストステロンを測定するための方法 Download PDF

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Abstract

本明細書中の教示は、質量分析法を使用してテストステロンを分析する方法を提供する。上記方法は、バイアルまたはウェルの中で、テストステロンと反応するタグ化試薬、タンパク質を溶液から沈殿させる水性沈殿剤、および内部標準溶液を合わせる工程であって、上記内部標準溶液は、既知の濃度の同位体が富化されたテストステロンを含む工程、次いで、前記バイアルまたはウェルに、テストステロンを含むかまたは含むと疑われるサンプルを添加する工程を包含する。次いで、上記バイアルを混合して、タンパク質の沈殿および存在する任意のテストステロンと上記タグ化試薬との反応を同時に引き起こし、沈殿物および液体溶液の混合物を形成することができる。次いで、上記液体溶液を、任意の沈殿物から分離し、次いで、液体クロマトグラフィータンデム質量分析法を使用して、テストステロンに関して分析することができる。

Description

関連出願
本出願は、２０１８年１２月２１日出願の米国仮特許出願第６２／７８３，６５７号（その全体は、本明細書に参考として援用される）の優先権の利益を主張する。
分野
本教示は、一般に、テストステロンの質量分析法による分析のための方法に関する。
緒言
臨床診断検査アッセイは、単純で、費用効果が高く、迅速、かつロバストであるべきである。さらに、アッセイ結果（偏りおよび不正確さ）の、ＣＤＣ参照法（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｖｏｌ． ５９（２）， ｐｐ． ３７２－３８０（本明細書に参考として援用される））のような至適基準へのアラインメントは、患者の健康にとって重要な意味を有する。患者から、特に、小児および新生児集団から、可能な限り少なく採血する傾向は増加しつつあり、従って、小さなサンプルサイズおよび集団における所望の分析物の最も低い参照レベルの両方についての感度および精度の要件を満たすアッセイを必要としている。若年成人女性では、テストステロンレベルは、若年成人男性におけるレベルの１／１５より小さい（それぞれ、２～４５ｎｇ／ｄＬおよび２５０～１１００ｎｇ／ｄＬ）。小児サンプルでは、全テストステロンレベルは、２～１０歳齢の女児および男児において最も低く、＜２０ｎｇ／ｄＬであり得る。小児が思春期に到達するにつれ、そのレベルは、成人期までに有意に増加するが、タナーステージＩの間に、そのレベルは、≦５ｎｇ／ｄＬであり得る。小児では、テストステロンの測定は、性ステロイド代謝の先天性過誤および遅発または早発思春期の症例を同定するために重要である。成人女性および男性では、低テストステロンレベルは、不妊、性機能障害、疲労、筋量の喪失、および気分変動をもたらす。男性および女性におけるアンドロゲン欠乏の診断、ならびに小児サンプルにおけるテストステロンレベルの評価は、高度に特異的で、正確な、かつ高感度の測定手順を必要とする。
比較的少ないサンプル量（sample volumes）（＜１００／日）を分析する小規模から中規模の病院の検査室は、初心者レベルのオペレーターにとっては容易である手作業でのサンプル調製を利用する高感度の方法から利益を受け得る。迅速分析に伴う単純かつ経済的な自動化サンプル調製は、多くのサンプル量を分析する大規模または中核の臨床検査室にとって望ましい。
以前のテストステロン分析の刊行物（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｖｏｌ． ８４（２１）， ｐｐ． ９３１０－７（本明細書に参考として援用される））は、遊離テストステロン、乾燥血液スポット、女性および／または小児の血清サンプルの定量のために感度を高めるように設計された超高感度法を記載することを目的としたが、ここで示される方法は、単純さおよび頑健性を高めることを目的とする。
Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｖｏｌ． ５９（２）， ｐｐ． ３７２－３８０ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｖｏｌ． ８４（２１）， ｐｐ． ９３１０－７
要旨
本発明の方法は、低レベルテストステロン分析を行う全ての検査室にとっての単純で、ロバスト、かつ高感度の解決策を提供する。分析物抽出および誘導体化は、同時に行われる。
種々の実施形態において、サンプル中の全テストステロンを分析するための方法が開示され、上記方法は、ａ）テストステロンと反応するタグ化試薬、タンパク質を溶液から沈殿させる水性沈殿剤、および内部標準溶液であって、上記内部標準溶液は、既知の濃度の同位体が富化されたテストステロンを含む内部標準溶液、ならびにテストステロンを含むかまたは含むと疑われるサンプルを合わせる工程、ｂ）前記組み合わせ物を混合して、タンパク質の沈殿および存在する任意のテストステロンと上記タグ化試薬との反応を同時に引き起こして、沈殿物および反応した液体溶液の混合物を形成する工程、ｃ）上記沈殿物を、上記反応した液体溶液から分離する工程、ｅ）上記反応した液体溶液を、タンデム質量分析法を使用して分析して、上記サンプルテストステロンを同定および／または定量する工程を包含する。いくつかの局面において、上記反応した液体溶液は、タンデム質量分析計へと導入する前に、液体クロマトグラフィーを使用して処理され得る。
いくつかの実施形態において、上記タグ化試薬は、式：
Figure 2022514379000002
 の化合物を含む。
いくつかの実施形態において、上記水性沈殿剤は、硫酸亜鉛を含む。
いくつかの実施形態において、上記混合物中の沈殿物を分離する工程は、上記混合物を、フィルタープレートに含まれるフィルター媒体を通して濾過する工程、および上記液体溶液を濾液として収集プレートの中に集める工程を包含する。
種々の実施形態において、サンプル中の全テストステロンを分析するための方法が記載され、上記方法は、ａ）微小遠心分離バイアルの中に、式：
Figure 2022514379000003
 の化合物、硫酸亜鉛を含む水性溶液、および２，３，４，－１３Ｃ３－テストステロンを含む溶液を合わせる工程、ｂ）上記微小遠心分離バイアルに、ストステロンを含むかまたは含むと疑われる血清または血漿サンプルを添加する工程、ｃ）上記バイアルを混合する工程、ｄ）上記バイアルを遠心分離する工程、ｅ）上記バイアル中の上清を、任意の沈殿物から分離する工程、ｆ）上記上清を、タンデム質量分析法を使用してテストステロンに関して分析する工程を包含する。いくつかの局面において、液体クロマトグラフィー（ＬＣカラム）を使用して、上記上清を処理する工程および得られた、分離した上清を、ＬＣカラムから分析用の質量分析計に溶離する工程。
種々の実施形態において、サンプル中の全テストステロンを分析するための方法が記載され、上記方法は、ａ）フィルタープレートのウェルの中で、式：
Figure 2022514379000004
 の化合物、硫酸亜鉛を含む水性溶液、および２，３，４，－１３Ｃ３－テストステロンを含む溶液を合わせる工程、ｂ）上記ウェルに、キャリブレータ、コントロール、またはテストステロンを含むかもしくは含むと疑われる患者サンプルを添加する工程、ｃ）上記フィルタープレートを振盪して、混合を引き起こす工程、ｄ）遠心分離を使用することによって、上記フィルタープレートにおけるウェルからの内容物を、収集プレートの中へと濾過して、上記収集プレートの中で濾液を形成する工程、ｅ）上記濾液を、タンデム質量分析法を使用してテストステロンに関して分析する工程を包含する。
上記のうちのいくつかの実施形態において、上記分析する工程は、タンデム質量分析計において４０３．３／１６４．２または４０３．３／１５２．２のＭＲＭトランジションを測定する工程を包含する。
上記のうちのいくつかの実施形態において、上記分析する工程は、タンデム質量分析計において４０６．３／１６７．２または４０６．３／１５５．２のＭＲＭトランジションを測定する工程を包含し、上記同位体が富化されたテストステロンは、２，３，４ １３Ｃ３－テストステロンである。
種々の実施形態において、キットは、タグ化試薬と、沈降反応溶液（precipitation solution）の水性溶液および同位体が富化されたテストステロンのうちの少なくとも1つとの組み合わせを含む。いくつかの局面において、上記沈降反応溶液は、硫酸亜鉛を含む。いくつかの局面において、上記タグ化試薬は、式：
Figure 2022514379000005
 の化合物を含む。
図１は、単一チューブ法および９６ウェルプレート法の両方に適応する例示的なサンプル調製ワークフローを示す。
図２は、誘導体化テストステロン、エピテストステロンおよび１３Ｃ３ テストステロン内部標準のクロマトグラムを示す。
図３Ａは、キャリブレータのクロマトグラムを示す。
図３Ｂは、較正曲線を示す。
図４は、男性および女性のＮＩＳＴ参照標準の重ね合わせたクロマトグラムを示す。
図５は、参照とＣＤＣ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎプログラム（ＨｏＳｔ Ｔ）から４０の血清サンプルの計算されたテストステロン濃度との間の平均差プロットを示す。
図６は、参照とＣＤＣ ＨｏＳｔ Ｔプログラムからの４０の血清サンプルの計算されたテストステロン濃度との間のピアソンの相関を示す。
図７Ａおよび７Ｂは、ＣＤＣ参照値と１年間の期間にわたって決定された平均値との間の％差を示す。
図８は、２０のマッチした血清／血漿小児サンプルの計算されたテストステロン濃度およびその対応する相関プロットを示す。
図９は、１７の成人のマッチした血清／血漿（２タイプ）に関して計算したテストステロン濃度を示す。
実施形態の詳細な説明
単純なサンプル調製ワークフローならびに全性別および年齢群の血清もしくは血漿サンプルに関して十分な感度を伴い、ケトン官能基誘導体化を介する（例えば、ＡｍｐｌｉｆｅｘＴＭケト試薬を使用する）正確かつロバストな全テストステロンＥＳＩ－ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ定量法を、作り出した。サンプル中の全テストステロンを分析するための方法は、テストステロンと反応するタグ化試薬（例えば、ＡｍｐｌｉｆｅｘＴＭケト試薬）、タンパク質を溶液から沈殿させる水性沈殿剤、および既知の濃度の同位体が富化されたテストステロンを含む内部標準溶液を合わせることによって、サンプル溶液を作製する工程を包含する。テストステロンを含むかまたは含むと疑われるサンプルは、試験および分析のために、上記組み合わせ物に添加され得る。次いで、その得られたサンプル溶液は、タンパク質を沈殿させ、存在する任意のテストステロンと上記タグ化試薬とを反応させて、沈殿物および反応した液体溶液の混合物を形成するために混合される。次いで、上記沈殿物は、上記反応した液体溶液から、例えば、遠心分離によって分離される。他の公知の分離手段はまた、例えば、磁性ビーズを操作して、その沈殿したタンパク質を捕捉することによって使用され得る。その分離し、反応した液体溶液はまた、一般には上清といわれ得る。その反応した液体溶液、すなわち、上清は、次いで、タンデム質量分析計へと注入されて、上記サンプル中に存在する場合、上記サンプルテストステロンが同定および／または定量され得る。要件に依存して、および当該分野で公知であるように、液体クロマトグラフカラム（ＬＣカラム）が、タンデム質量分析計へと導入する前に、上記反応した液体溶液中の化合物を濾過、濃縮および分離するために使用され得る。上記反応した液体溶液を処理するための代替の手段はまた、ＬＣカラムの代わりに使用されてもよく、次いで、その処理されたサンプルは、フローインジェクション分析（ＦＩＡ）または当該分野で公知のとおりのシリンジポンプを使用する注入を使用する質量分析計へと導入され得る。
低サンプル量および高サンプル量に適応する単純なサンプル調製法を開発した。この方法は、タンパク質沈殿および質量タグ化試薬（例えば、ＡｍｐｌｉｆｅｘＴＭケト試薬）での誘導体化を同時に使用して、沈殿物および反応した液体溶液の混合物を作製する。いくつかの実施形態において、次いで、上記混合物は、上記沈殿物を、上記反応した液体から分離して、分離した上清を作製するために、遠心分離によって処理され得る。いくつかの実施形態において、上記上清は、分析のために液体クロマトグラフ（ＬＣ）タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）システム（ＳＣＩＥＸ ＴｏｐａｚＴＭ ＩＶＤ ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ。ここでＭＳは、性能がＳＣＩＥＸ ４５００ ＭＤに等価である）へと注入されて、テストステロンが検出および／または定量され得る。
以下で記載される具体的装置および工程の順序は、例示であり、当業者は、等価な既知の処理工程が、以下で記載される具体例および装置から置き換えられ得ることを理解する。
例示的実験において、ヒト血清または血漿サンプル中の全テストステロンを、ＮＩＳＴ ９７１ ＳＲＭに対して追跡可能な、約１～２０００ｎｇ／ｄＬ（１０～２０，０００ｐｇ／ｍＬ）の広い濃度範囲にわたるキャリブレータによって生成した外部較正曲線を使用して定量した。１３Ｃ３－富化テストステロン内部標準を、較正標準および未知のサンプルに対して一定量で添加して、サンプル調製の間の分析物喪失または分析の間のマトリクス効果を補正した。２つの方法（一方は、９６ウェルフィルタープレートを使用し、もう一方は、エッペンドルフチューブを使用する）を開発した。両方の方法はＣｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＣＤＣ）のテストステロンに関するホルモン標準化プログラム（ＨｏＳｔ Ｔ）によって認証された。血漿および血清サンプルに関する方法を実装することの実行可能性を、同じドナーに由来するマッチした小児血清と血清サンプルと間の小規模方法比較研究を介して試験した。さらに、２つの異なる抗凝固剤入りチューブタイプ（Ｌｉ－ヘパリンおよびＫ２ＥＤＴＡ）の中に収集した血漿サンプルを、同じドナーに由来するサンプルと比較した。
Figure 2022514379000006
社内で製剤化したＮＩＳＴ ９７１－追跡可能キャリブレータを使用したところ、上記方法は、１～２０００ｎｇ／ｄＬ（１０～２０，０００ｐｇ／ｍＬ）の間で線形的であった（ｒ２＞０．９９９）（検出限界は約１ｎｇ／ｄＬ（１０ｐｇ／ｍＬ））。ＣＤＣ ＨｏＳｔ Ｔ標準化プログラムからの４０個の参照サンプルに対する上記テストステロン濃度偏りは、＜３％であり、平均％ＣＶは、約４であった。サンプルのうちの８０％超が、±６．４％というＣＤＣ偏り基準に合格した。小児のマッチした血清サンプルと血漿サンプルとの間の比較は、高い相関（ｒ２＝０．９９７）および＜５％という偏りをもたらした。マッチした成人血清サンプルと血漿サンプルとの間の差異は、約１％であった。
全てのヒトサンプル中の全テストステロンを測定するために適した正確かつ能率化した方法の実行可能性を、低サンプル数または高サンプル数に合うように、サンプル調製ワークフローの選択で実証した。上記方法は、潜在的に、異なる採血チューブ（Ｌｉ－ヘパリンおよびＫ２ＥＤＴＡ）からの血漿マトリクスのために使用され得る。
ここで示される方法は、１００μＬという小さいサンプルサイズを使用して、およそ１ｎｇ／ｄＬ（１０ｐｇ／ｍＬ）という定量下限（ＬＬＯＱ）で、ヒト血清（または血漿）からの全テストステロンの定量を可能にする。本明細書中の教示は、小規模または大規模臨床検査室要件に適応するサンプル調製ワークフローの２つのバリエーションを記載する。第１のワークフローは、テストステロン抽出が、個々のチューブ中で行われる手作業操作を含む。それは、より小さなサンプル負荷（＜１００／日）のために設計される。第２のワークフローは、自動化ピペット操作プラットフォームが利用可能でなければ、手作業でのピペット操作でも使用され得る自動化サンプル調製プラットフォームで９６ウェルフィルタープレートを使用する。個々のチューブおよび９６ウェルフィルタープレートの両方の方法が、ＣＤＣのＨｏＳｔ Ｔ標準化プログラムによって認証された。
テストステロン（アセトニトリル中１００μｇ／ｍＬ、９９．８％純粋）、２，３，４－１３Ｃ３－テストステロン（アセトニトリル中１０μｇ／ｍＬ、９９．８％）、およびエピテストステロン（アセトニトリル中１ｍｇ／ｍＬ、９９．７％純粋）の認証された標準溶液を、Ｃｅｒｉｌｌｉａｎｔ（Ｒｏｕｎｄ Ｒｏｃｋ， ＴＸ）から購入した。システム適合性溶液（ｓｙｓｔｅｍ ｓｕｉｔａｂｉｌｉｔｙ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（ＳＳＴ）を、ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ １／１（Ｖ／Ｖ）中の上記のテストステロン、エピテストステロンおよび２，３，４ １３Ｃ３ テストステロンから社内で調製した。ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏを、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから購入し、超純水（１８ ＭΩ Ｅｌｇａ ＬａｂＷａｔｅｒ ｓｙｓｔｅｍ， ＵＳＡ）で０．４Ｍ溶液として調製した。さらなるｐＨ調整は不要であった。メタノール、アセトニトリルおよびギ酸、質量分析法グレードの溶媒を、ＶＷＲ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｒａｄｎｏｒ， ＰＡ）から購入した。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ， ｐａｒｔ ｎｕｍｂｅｒ Ａ２１５３）を、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）から凍結乾燥粉末として購入した。テストステロン標準参照物質（ＳＲＭ） ＮＩＳＴ ９７１を、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）から購入した。上記構成要素のうちの１またはこれより多くは、キットの中に組み込まれ得る。
ＣＤＣ血清サンプルを、ＨｏＳｔ Ｔ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎプログラム（ＣＤＣ Ａｔｌａｎｔａ， ＧＡ）の一部として分析した。小児血漿（リチウムヘパリン（ＬＨ）、Ｋ２ＥＤＴＡ）／血清マッチサンプルを、ｉＳｐｅｃｉｍｅｎ（Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ， ＭＡ）から購入した。ＡｍｐｌｉｆｅｘＴＭケト試薬キットを、ＳＣＩＥＸ（Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ， ＭＡ）から得た。試薬バイアルおよび希釈剤バイアルの内容物を、使用前に１：１（Ｖ／Ｖ）で混合して、最終のＡｍｐｌｉｆｅｘＴＭケト試薬溶液を得た。誘導体化手順、化学反応、および誘導体化の際の幾何異性体形成の詳細は、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｖｏｌ． ８４， ｐｐ． ９３１０－７（本明細書に参考として援用される）に記載される。
サンプル抽出のために、遠心分離チューブ、９６ウェルフィルタープレート、９６ウェル収集プレート、およびフィルタープレートカバーを、ＳＣＩＥＸから得た。ＬＣオートサンプラーチューブおよびスナップキャップを、ＶＷＲ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌから購入した。
キャリブレータおよびコントロールを、５％ ＢＳＡを使用してマトリクスとして社内で調製した。これにより、本発明者らのアッセイによって内因性テストステロンを含めないことが決定された。テストステロン作業用ストック溶液を、テストステロンの認証された標準溶液（アセトニトリル中１００μｇ／ｍＬ， Ｃｅｒｉｌｌｉａｎｔ）から調製した。この作業用溶液を使用して、５％ ＢＳＡ溶液へと添加して、約２０００ｎｇ／ｄＬ（約２０，０００ｐｇ／ｍＬ）の最高濃度キャリブレータを作製した。その最高濃度キャリブレータを５％ ＢＳＡでさらに希釈して、他のキャリブレータ濃度（１．８ｎｇ／ｄＬ、８ｎｇ／ｄＬ、１６ｎｇ／ｄＬ、５９．９ｎｇ／ｄＬ、１４４．７ｎｇ／ｄＬ、８４４．２ｎｇ／ｄＬ、および１８４２．６ｎｇ／ｄＬ）および品質コントロールレベル（４ｎｇ／ｄＬ、３２．７ｎｇ／ｄＬ、および４７６．８ｎｇ／ｄＬ）を調製した。上記キャリブレータおよびコントロールの濃度は、ＮＩＳＴ ９７１、ヒト血清マトリクスにおけるテストステロンの標準参照物質（ＳＲＭ）に対して追跡可能である。
システム適合性（ＳＳＴ）溶液
ＳＳＴを使用して、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳシステムの性能をモニターし、その後、キャリブレータおよび未知のサンプルを分析した。ＳＳＴは以下のように調製した。テストステロン、２，３，４－１３Ｃ３－テストステロン、およびエピテストステロン（それぞれ、１０μｇ、５μｇ、および３μｇ）の混合物を、１０００μＬの最終ＡｍｐｌｉｆｅｘＴＭ ケト試薬溶液を用い、微小遠心分離バイアルの中で周囲温度において１２０分間誘導体化した。その誘導体化した溶液を、１００ｍＬ メスフラスコに移し、その容積を１：１（Ｖ／Ｖ） メタノール－水を使用して１００ｍＬになるまで満たし、テストステロン、２，３，４－１３Ｃ３－テストステロン、およびエピテストステロンの、それぞれ、０．１μｇ／ｍＬ、０．０５μｇ／ｍＬ、および０．０３μｇ／ｍＬのストック溶液を得た。このストック溶液を、１：１（Ｖ／Ｖ） メタノール－水を使用して５００倍にさらに希釈して、最終ＳＳＴ： テストステロン、２００ｐｇ／ｍＬ（２０ｎｇ／ｄＬ）； ２，３，４－１３Ｃ３－テストステロン、１００ｐｇ／ｍＬ（１０ｎｇ／ｄＬ）；およびエピテストステロン、６０ｐｇ／ｍＬ（６ｎｇ／ｄＬ）を得た。そのＳＳＴを－２０℃で貯蔵した。
内部標準（ＩＳ）溶液
サンプル調製および分析における任意の変動性を補正するために、２，３，４－１３Ｃ３－テストステロンのメタノール溶液（２０ｎｇ／ｍＬ。１０μｇ／ｍＬの認証された標準を希釈することによって調製）を、ＩＳとして使用した。この溶液を、サンプル調製の前に、各サンプル、キャリブレータ、またはコントロールに添加した。
図１は、個々のサンプルチューブ（またはバイアル）または９６ウェルフィルタープレートのいずれかを使用するサンプル調製の例示的実施形態を示す。９６ウェルフィルタープレートの使用は、容易な自動化および多数の検査を可能にする。
１．５ｍＬ 微小遠心分離バイアルを使用してサンプルを調製する場合、８５μＬ 最終Ａｍｐｌｉｆｅｘケト試薬溶液、２５μＬ 沈降反応溶液（沈殿剤、硫酸亜鉛（ＺｎＳＯ４） ０．４Ｍを含む）、および２５μＬ ＩＳ溶液を、上記バイアルに添加した。１００μＬの血清または血漿サンプル、キャリブレータ、またはコントロールを、表示した微小遠心分離バイアルにそれぞれ個々に移した。１５～３０秒間ボルテックスで混合した後、タンパク質が沈殿したサンプルを、３０分間、室温においてインキュベートし、２分間、１５，０００ｒｐｍで遠心分離して、沈殿したタンパク質を、その反応した液体溶液から分離した。次いで、合計１４０μＬの上清、すなわち、反応した液体溶液を分離し、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析用のオートサンプラーバイアル（ポリプロピレン、３００μＬ 挿入）に移した。
９６ウェルプレートサンプル調製を利用する場合、以下のサンプル調製工程を、手作業でのピペット操作または自動化ロボットプラットフォームのいずれかで行い得る。その自動化サンプル調製を、一部分、収集プレートの上に積み重ねた９６ウェルフィルタープレートを使用するＴｏｐａｚＴＭ Ｐｒｅｐ Ｓｔａｔｉｏｎ（ＳＣＩＥＸ， Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ， ＭＡ）プラットフォームで行った。以下の試薬順序で、そのフィルタープレート上に手作業で分注した： ８５μＬのＡｍｐｌｉｆｅｘケト試薬溶液、沈殿剤を含む２５μＬの沈降反応溶液、２５μＬのＩＳ溶液、および１００μＬのキャリブレータ、コントロール、または患者サンプル。次に、カバーをしていないフィルタープレートを、上記prep stationの特定のラックの上に、および収集プレートを別個のラックの上に載せた。アッセイ特異的にプログラムされたスクリプトを、ロボットが６００ｒｐｍにおいて、周囲温度（２０～３０℃）において３０分間のプレート振盪、および４０００ｒｐｍ、４分間の遠心分離を行うように開始した（ロボットアームは、上記フィルタープレートおよび上記収集プレートを統合された遠心分離機内部に取り付ける）。上記収集プレートを（集めた濾液とともに）、接着性のシールで覆い、分析用ＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステムのオートサンプラーの中に入れた。
自動化プラットフォームが利用可能でない場合、上記フィルタープレートの振盪および遠心分離は、任意の標準的９６ウェルプレート振盪機（例えば、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ Ｒ）、およびプレートローター付き遠心分離（例えば、Ａ－２－ＭＴＰローター付きＥｐｐｅｎｄｏｒｆ ５４３０）で行われ得る。
誘導体化の間のインキュベーション時間は、抽出の際にサンプルをインキュベートするのが一般的な方法であるため、タンパク質沈殿およびテストステロン抽出効率の改善にも役立ち得る。
ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ法
調製したサンプル（個々のバイアルまたは９６ウェルフィルタープレート法のいずれかによって調製）を、Ｔｏｐａｚ ＩＶＤ ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ Ｓｙｓｔｅｍ（ＳＣＩＥＸ ４５００ＭＤ ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）で分析した。誘導体化テストステロン、エピテストステロン、および内部標準１３Ｃ３－テストステロンを含むＳＳＴを、分析の前に三連で注入して、図２に示されるクロマトグラムを生成するＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステム性能が適格であることを確認した。注入容積は、各未知のサンプル、キャリブレータ、コントロールおよびＳＳＴに関して５０μＬであった。ＬＣ勾配は、誘導体化後に形成したＡｍｐｌｉｆｅｘＴＭ ケト－テストステロンの幾何異性体（ＥおよびＺ異性体）のベースライン分離を可能にした。Ａｍｐｌｉｆｅｘケト－テストステロンオキシムの幾何異性体（Ｅ－Ｚ）を、二重ピークとして分離する。ＨＰＬＣ移動相は、水中０．１％ ギ酸（移動相Ａ）およびアセトニトリル中０．１％ ギ酸（移動相Ｂ）であった。Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｋｉｎｅｔｅｘビフェニルカラム（５０×３．０ｍｍ、５μｍ）を、４０℃において、分析用分離のために表１に示されるとおりの勾配プロフィールで使用した。質量分析計のダイバーターバルブを使用して、過剰な試薬溶離およびＬＣカラム洗浄を回避した。そのＬＣ実行時間は、過去に利用したものより短く、よりロバストな分析カラムが、分析ラボの要件により合うように、より大きな直径および粒径で使用される。
Figure 2022514379000007
定量イオン（ｑｕａｎｔｉｆｉｅｒ）および確認イオン（ｑｕａｌｉｆｉｅｒ）ＭＲＭトランジションとして使用したＭＳ／ＭＳフラグメントは、それぞれ、４０３．３→１６４．２および４０３．３→１５２．２であった。誘導体化した１３Ｃ３－テストステロンＩＳ定量イオンおよび確認イオンのトランジションは、それぞれ、４０６．３→１６７．２および４０６．３→１５５．２であった。デクラスタリング電位（ＤＰ）は８０Ｖ、衝突エネルギー（ＣＥ）は５７ｅＶ、イオンスプレーエネルギーは３０００Ｖ、およびセル出口電位（ｃｅｌｌ ｅｘｉｔ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）（ＣＸＰ）は５Ｖであった。ソース温度を６５０℃に、およびカーテンガス（ＣＵＲ）を２５ｐｓｉに設定した。
未知のサンプル濃度を、上記で記載されるキャリブレータで作成した較正曲線に基づいて計算した。Ａｍｐｌｉｆｅｘケト－テストステロン（分析物）とＡｍｐｌｉｆｅｘケト－１３Ｃ３－テストステロン（ＩＳ）との間の比に対する濃度を、線形回帰分析のために使用した。幾何異性体ピークを積分し、その分析物およびＩＳの両方に関して加えた。ＳＣＩＥＸ Ａｎａｌｙｓｔ（登録商標） ＭＤ １．６．２およびＭｕｌｔｉＱｕａｎｔ ＭＤ ３．０．２プログラムを、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ法最適化、データ獲得、データ処理および定量のために使用した。キャリブレータおよびコントロールに対して割り当てられた値からの許容できる精度は、最も低いキャリブレータ（これについては、許容できる精度は、±２０％であった）を除いて±１５％であった。
定量下限（ＬＬＯＱ）を、２７．７ｎｇ／ｄＬのＮＩＳＴ ９７１女性参照サンプルの、以下の濃度：希釈剤として５％ ＢＳＡを用いて６．９３ｎｇ／ｄＬ、２．７７ｎｇ／ｄＬ、１．３９ｎｇ／ｄＬ、０．６９ｎｇ／ｄＬおよび０．３４ｎｇ／ｄＬまでの段階希釈（三連で）の後に予測した。そのＬＬＯＱ基準は、％ＣＶ ≦１５（ｎ＝３）およびシグナル対ノイズ（Ｓ／Ｎ）比≧１０であった。さらに、そのＳ／Ｎ比を、４つの異なる日に最も低いキャリブレータレベルに関して評価し、そのＳ／Ｎ比が１０に等しい濃度を予測した。方法の干渉研究を、参考文献（１２）に詳細に記載する。
ＣＤＣ認証プロセスは、「Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｑｕａｌｉｔｙ Ａｓｓｕｒａｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ Ｐｒｏｇｒａｍｓ」（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｑｕａｌｉｔｙ Ａｓｓｕｒａｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ Ｐｒｏｇｒａｍｓ． Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ． Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２０１８． ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｃｄｃ．ｇｏｖ／ｌａｂｓｔａｎｄａｒｄｓ／ｈｓ＿ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ．ｈｔｍｌ（本明細書に参考として援用される））の下でＣＤＣウェブサイトに詳細に記載される。ＣＤＣのテストステロンに関するホルモン標準化プログラム（ＨｏＳｔ Ｔ）によるアッセイ認証は、両方のサンプル調製法（個々のバイアルおよび９６ウェルフィルタープレート）に関して得た。第１に、上記方法は、４０ ＨｏＳｔ Ｔ Ｐｈａｓｅ １サンプルおよび２つのＮＩＳＴ ９７１ ＳＲＭで較正した。これらの４２サンプルの参照濃度を、本発明者らの方法によって決定した濃度と、ピアソン相関およびパーセント偏り計算を使用して比較した。上記方法がいったん、±６．４％というＣＤＣの許容できる偏り基準に合格したら、本発明者らは、ＨｏＳｔ Ｔ認証プログラムのフェーズ２に登録し、ここで１０の目隠ししたサンプルは、３ヶ月ごとに（Ｑ１からＱ４まで）分析のために本発明者らの研究室まで輸送された。本発明者らの計算した濃度は、累積偏りおよび不正確予測に関してＣＤＣに報告を返した（ＣＤＣによる偏りの予測は、ＣＬＳＩガイドラインＥＰ９－Ａ２「Ｍｅｔｈｏｄ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ａｎｄ ｂｉａｓ ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｐａｔｉｅｎｔ ｓａｍｐｌｅｓ」に基づいた）。許容できる不正確さは、≦５．３％であり、全４０サンプルの平均％ ＣＶとして計算した（各サンプルにつきｎ＝４）。そのフェーズ２プログラムを、４四半期ごとに更新する。ここで提供されるデータは、第１の認証サイクルに由来する。方法の相関（ピアソン）およびパーセント差異プロットを、Ａｎａｌｙｓｅ－ｉｔソフトウェアパッケージおよびＥｘｃｅｌ ２０１６を使用して作成した。
個々のバイアルサンプル調製法を使用して、本発明者らは、同じ個体の採血から得た血清および血漿（マッチしたサンプル）に関して計算した濃度を比較した。２つの別個の研究を行った。一方の研究では、本発明者らは、２１～６５歳齢の成人ドナー（９名の女性および８名の男性）に由来するマッチしたサンプルを比較した。各ドナーの血液収集物を、３本の異なるチューブに分けた：（ｉ）血清、（ｉｉ）血漿リチウムヘパリン（ＬＨ）、および（ｉｉｉ）血漿Ｋ２ＥＤＴＡ。この研究において、本発明者らは、血清と血漿との間で計算された濃度のみならず、異なる一般的な血漿抗凝固剤入りチューブの間でも比較した。他方の研究では、本発明者らは、民族および人種が混在する、７～１８歳齢の２０名のおそらく健康な小児ドナー（１０名の女児および１０名の男児）からのマッチした血清および血漿ＬＨサンプルを比較した。
図３Ａは、１．８ｎｇ／ｄＬ（１８ｐｇ／ｍＬ） Ａｍｐｌｉｆｅｘケトテストステロンという本発明者らの最も低いキャリブレータの代表的クロマトグラムを示す。ＮＩＳＴ ９７１女性サンプルの反復された段階希釈に基づいて、および異なる日での最も低いキャリブレータレベルのＳ／Ｎ比から、ＬＬＯＱを、１ｎｇ／ｄＬ（１０ｐｇ／ｍＬ）であると予測した。そのＬＬＯＱは、臨床目的の大部分に関して、女性および小児供給源に由来する血清および血漿サンプル中でテストステロンを測定するために適している。４つの異なる日での各キャリブレータレベルの平均％ＣＶは、５．１（最も低いキャリブレータ）～２．８（最も高いキャリブレータ）の範囲に及んだ。タンパク質沈殿、分析物誘導体化および抽出が同時に伴う（サンプルを乾燥および再構成する必要性がない）この単純なサンプル調製手順は、１～２０００ｎｇ／ｄＬ（１０～２０，０００ｐｇ／ｍＬ）の間で線形であり、図３Ｂの較正曲線において示される１／ｘ 重み付けの後にｒ２＞０．９９であった。この較正曲線は、１．８～１８４３ｎｇ／ｄＬで６つの濃度レベルを含む。直線の式は、ｙ＝１．０４＋０．００１４６（ｒ＝０．９９９８）であった。
キャリブレータおよび品質コントロールは、ＮＩＳＴ ＳＲＭ ９７１に対して追跡可能であった。各々の分析日に、ＮＩＳＴ ９７１の２つの濃度レベルを、異なる供給源に由来する余分の品質コントロールとして追加した。図４は、男性および女性のＮＩＳＴ ９７１のクロマトグラムの代表的な重ね合わせを示す。ここでテストステロン濃度は、それぞれ、６４３．５ｎｇ／ｄＬおよび２７．７２ｎｇ／ｄＬである（ＮＩＳＴ ９７１の分析の認証から得られた値）。
ＣＤＣ標準化に伴うＨｏＳｔ Ｔ認証の方法のプロセスにおける第１の工程は、ＨｏＳｔ Ｔフェーズ１からの４０の値が割り当てられた血清サンプルに関して±６．４％の偏りである許容できる基準に合格することであった。教示の範囲内で利用される方法とＣＤＣ参照法（図５に示される平均差プロット）とを比較すると、測定範囲（１．８～１８４３ｎｇ／ｄＬ）に対する平均偏りは、－０．７３％であり、相関係数（ピアソン評価）ｒは、０．９９９であった（図６）。これは、高い相関およびＣＤＣ参照濃度との一致を示し、本発明者らがＨｏＳｔ Ｔプログラムのフェーズ２に進むことを可能にした。図５は、４０のフェーズ１ ＨｏＳｔ Ｔ血清サンプルを使用する、ＣＤＣ参照と本教示に従う手順との間の方法の比較を示す。平均差異プロットの下側の直線は、平均偏りを表す。
図６は、ＨｏＳｔ Ｔフェーズ１参照サンプル濃度と本教示を使用して計算した濃度（ｎｇ／ｄＬ）との間のピアソン相関を示す。相関係数ｒ＝０．９９９。直線は、９５％ 信頼区間を規定する。
ＣＤＣ法との比較を含む方法の性能結果のまとめを、表２に示す。本教示を使用して測定した濃度とＣＤＣ参照濃度との間の＜３％という平均偏り（％差異）は、許容できる±６．４％を遙かに下回る。さらに、＞８０％であるＣＤＣ偏り基準（Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ Ｔｏｔａｌ Ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ． Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２０１８． ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｃｄｃ．ｇｏｖ／ｌａｂｓｔａｎｄａｒｄｓ／ｐｄｆ／ｈｓ／ＣＤＣ＿Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ＿Ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ＿Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ－５０８．ｐｄｆ．）を満たすサンプルの割合は、高い方法精度の別の指標である。全サンプルの平均した％ＣＶとして表される再現性は、個々のバイアル法とプレート法との間で匹敵するようであり、それぞれ、３．６８％および３．９４％であった。女性サンプルのみの％ＣＶは、遙かに低いテストステロン濃度範囲に起因して男性のサンプルのものよりわずかに高かったが、両方のサンプル調製法において≦５．３％という許容できる値内に留まった。
図７ＡおよびＢは、サンプル調製法の各々に関して年周期全体での個々のサンプル偏りを図示する。全体として、個々のサンプル濃度は、参照値に非常に近かったが、方法の各々に関して、ＣＤＣ参照濃度に対する偏りが、その年の残りの四半期においてよりも高い、１つの四半期が存在した。特に、図７Ａおよび７Ｂは、年周期全体で、ＣＤＣ参照値と本教示を利用して決定した平均値との間の％差異を示す。図７Ａは、個々のチューブ／バイアルサンプル調製を利用する分析を示し、図７Ｂは、９６ウェルフィルタープレート自動化法を示す。
Figure 2022514379000008
ＣＤＣは、血漿サンプルに関して相当する認証プログラムを提示していない。本教示が、血漿サンプル中でテストステロンを確実に測定する能力を示すかどうか、および血漿収集チューブ中の抗凝固剤の間で差異が存在するかどうかを試験することを決定した。血漿サンプルはフィブリノゲンを含み、従って、より高いタンパク質含有量を有するので、血清および血漿中の分析物の濃度は、分析物に依存して異なり得る（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｖｏｌ． ５０， ｐｐ． １７０４－１７０５ ， Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｈｕｍａｎ Ｐｌａｓｍａ ａｎｄ Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ Ｐｒｏｆｉｌｅｓ． Ｚｈｏｎｇｈａｏ， Ｙ．ら， ７， ２０１１， ＦＬＯＳ Ｏｎｅ， Ｖｏｌ． ６（ともに本明細書に参考として援用される））。予備評価として、３７のサンプルを、２つの実験において両方の性別および広い年齢範囲に由来するマッチした血清／血漿サンプルにおいてテストステロンに関して測定した。図８は、７～１８歳齢の２０の小児サンプルの分析の結果を示し、これは、内因性の血清濃度と血漿濃度との間で高い相関を示した。その測定したテストステロン濃度は、１．７～９３４ｎｇ／ｄＬであり、その平均偏りは、＜５％であった。これは、血清サンプルと血漿サンプルとの間でテストステロン濃度に臨床上の有意差がないことを示す。血漿サンプルの測定した濃度は、図８において棒グラフの上に示される。
同様に、血漿ＬＨまたは血漿Ｋ２ＥＤＴＡに対する血清の１７のマッチした成人サンプルの分析は、匹敵するテストステロン濃度を生じた。１７のサンプルの各々に関して、血清、血漿ＬＨ、および血漿Ｋ２ＥＤＴＡの間の％ＣＶは、≦８（ｎ＝３）であり、全体の平均は４％であった（ｎ＝５１、１７名のドナーの各々に関して３つのマッチしたサンプル。各々１回測定した）。これらの結果を図９に示し、そこでは、１７のマッチした成人サンプル、特に、血清、血漿Ｌｉ－ヘパリン、および血漿Ｋ２ＥＤＴＡに関して計算したテストステロン濃度を示す。図９のＸ軸において、サンプル名は、性別および年齢に関する情報を含む（例えば、Ｆ－２７は、女性、年齢２７歳に由来した）。棒グラフでの示された濃度は、血清の計算された濃度に由来する。
さらに、各個々のドナーに由来する３つのサンプルの中での％差異をみると、血清と血漿との間、または血漿ＬＨと血漿Ｋ２ＥＤＴＡとの間の平均は、約１％であり、０．０４～１１．６％の範囲であった。
２０の小児血清サンプル（２～１５歳齢、性別および人種は混在（血漿はマッチしていない）を、分析した。計算したテストステロン濃度は、０．９～６６２ｎｇ／ｄＬの範囲に及んだ。最も低い濃度は、２歳齢の男児について、最も高い濃度は１３歳齢の男児について計算された。
本発明者らの目標は、正確で、特異的で、高感度で、かつロバストなサンプル調製およびＬＣ－ＭＳ／ＭＳ法を開発して、女性および小児供給源ならびに種々のサンプルタイプを含め、サンプル濃度の広い範囲においてテストステロンを測定することであった。血清からテストステロンを分析するための本発明者らが最初に公開したＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法（１２）は超高感度（≦０．１ｎｇ／ｄＬ）を意図した。なぜなら、その方法は、別個の誘導体化工程およびより多くのサンプル量を必要としたからである。ここに記載する方法についてのサンプル調製は、時間、抽出溶媒、サンプル容積、およびコストを低減しようと試みた。本発明者らはまた、特別なサンプル乾燥装置の必要性を排除した。高められた感度は、タグ化試薬（例えば、ＡｍｐｌｉｆｅｘＴＭケト試薬）を使用してテストステロンの炭素３に荷電部分を結合する誘導体化によって、可能になる。
しかし、別個の誘導体化工程を必要とする他の方法とは異なり、この方法では、質量タグ化試薬を含む誘導体化試薬溶液は、１つの単純な分析物抽出工程においてタンパク質沈殿に対して同時に使用される。この方法は、９６ウェルフィルタープレートを収集プレートに取り付けた自動化ロボットプラットフォームで容易に行われうる。両方のワークフロー、個々のバイアルおよび９６ウェルフィルタープレート（ＰｒｅｐＳｔａｔｉｏｎロボット）は、非常に高い精度スコアでＣＤＣ ＨｏＳｔ Ｔプログラムによって成功裡に認証された。両方法は、およそ１～２０００ｎｇ／ｄＬ（１０～２０，０００ｐｇ／ｍＬ）という広いダイナミックレンジ内で、ＳＣＩＥＸ Ｔｏｐａｚ ＩＶＤ ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ Ｓｙｓｔｅｍ（４５００ＭＤ）でテストステロンサンプルを定量するために適している。従って、上記方法は、不明瞭な結果のためにサンプルを反復する必要性を低減し、種々の検査室の間での測定の一貫性を担保するために必要とされる十分な感度および精度を示した。その方法は、抗凝固剤としてＬＨまたはＫ２ＥＤＴＡのいずれかを伴う血漿サンプルを分析するために使用され得るが、血漿サンプルに関しては、種々の抗凝固剤入りチューブに由来するマッチした多数の血清／血漿サンプル（＞４０、またはＣｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓにおいて推奨されるとおり）を評価することが必要であろう（ＣＬＳＩ ＥＰ９－Ａ２． Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ａｎｄ Ｂｉａｓ Ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ Ｕｓｉｎｇ Ｐａｔｉｅｎｔ Ｓａｍｐｌｅｓ， Ｖｏｌ． ２２． １９）。さらに、９６ウェルフィルタープレートワークフローとの血清／血漿濃度等価性を確認することが必要であろう。
当業者は、慣用的な実験法のみを使用して、本明細書で記載される実施形態および実施に対する多くの均等物を認識するか、または確認することができる。よって、本発明は、本明細書で開示される実施形態に限定されるべきではないが、法の下で許容されれば、可能な限り広く解釈されるべきである以下の請求項から理解されるべきであることが、理解される。
本明細書で使用される節の見出しは、構成目的に過ぎず、限定として解釈されるべきではない。出願人の教示は、種々の実施形態とともに記載されるが、出願人の教示が、このような実施形態に限定されることは意図されない。むしろ、出願人の教示は、当業者によって認識されるように、種々の代替、改変、および均等物を包含する。

Claims (18)

  1. サンプル中の全テストステロンを分析するための方法であって、前記方法は、
    テストステロンと反応するタグ化試薬、
    タンパク質を溶液から沈殿させる水性沈殿剤、
    既知の濃度の同位体が富化されたテストステロンを含む内部標準溶液、および
    サンプルテストステロンを含むかまたは含むと疑われるサンプル、
    を合わせることによってサンプル溶液を作製する工程、
    前記サンプル溶液を混合して、タンパク質を沈殿させ、存在する任意のテストステロンと前記タグ化試薬とを反応させて、沈殿物および反応した液体溶液の混合物を形成する工程、
    前記沈殿物を前記反応した液体溶液から分離する工程、
    前記反応した液体溶液を、タンデム質量分析法を使用して分析して、前記サンプルテストステロンを同定および／または定量する工程、
    を包含する方法。
  2. 前記タンデム質量分析法を使用して前記分析する工程の前に、前記方法は、
    前記反応した液体溶液を液体クロマトグラフィーカラムに導入して、前記反応した液体溶液中の化合物を分離する工程、および
    前記分離した、反応した液体溶液を、分析用の前記タンデム質量分析計へと溶離する工程、
    をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
  3. 前記タグ化試薬は、式：
    Figure 2022514379000009
     の化合物を含む、請求項１に記載の方法。
  4. 前記水性沈殿剤は、硫酸亜鉛を含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
  5. 前記沈殿物を前記分離する工程は、前記混合物を、フィルタープレートに含まれるフィルター媒体を通して濾過する工程、および前記反応した液体溶液を、濾液として収集プレートの中に集める工程を包含する、前記請求項のいずれかに記載の方法。
  6. 前記分析する工程は、４０３．３／１６４．２または４０３．３／１５２．２のＭＲＭトランジションを測定する工程を包含する、前記請求項のいずれかに記載の方法。
  7. 前記分析する工程は、４０６．３／１６７．２または４０６．３／１５５．２のＭＲＭトランジションを測定する工程を包含し、前記同位体が富化されたテストステロンは、２，３，４ １３Ｃ３－テストステロンを含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
  8. サンプル中の全テストステロンを分析するための方法であって、前記方法は、
    ａ）微小遠心分離バイアルの中に、式：
    Figure 2022514379000010
     の化合物、硫酸亜鉛を含む水性溶液、および２，３，４，－１３Ｃ３－テストステロンを含む溶液を合わせる工程
    ｂ）前記微小遠心分離バイアルに、テストステロンを含むかまたは含むと疑われる血清または血漿サンプルを添加する工程、
    ｃ）前記微小遠心分離バイアルを混合する工程、
    ｄ）前記微小遠心分離バイアルを遠心分離する工程、
    ｅ）前記微小遠心分離バイアル中の上清を、任意の沈殿物から分離する工程、
    ｆ）前記上清を、タンデム質量分析法を使用してテストステロンに関して分析する工程、
    を包含する方法。
  9. 前記分析する工程は、４０３．３／１６４．２または４０３．３／１５２．２のＭＲＭトランジションを測定する工程を包含する、請求項８に記載の方法。
  10. 前記分析する工程は、４０６．３／１６７．２または４０６．３／１５５．２のＭＲＭトランジションを測定する工程を包含する、請求項８または請求項９に記載の方法。
  11. サンプル中の全テストステロンを分析するための方法であって、前記方法は、
    ａ）フィルタープレートのウェルの中に、式：
    Figure 2022514379000011
     の化合物、硫酸亜鉛を含む水性溶液、および２，３，４，－１３Ｃ３－テストステロンを含む溶液を合わせる工程、
    ｂ）前記ウェルに、キャリブレータ、コントロール、またはテストステロンを含むかもしくは含むと疑われる患者サンプルを添加する工程、
    ｃ）前記フィルタープレートを振盪して、混合を引き起こす工程、
    ｄ）遠心分離を使用することによって、前記フィルタープレートの前記ウェルからの内容物を、収集プレートの中へと濾過して、前記収集プレートの中で濾液を形成する工程、
    ｅ）前記濾液を、タンデム質量分析法を使用してテストステロンに関して分析する工程、
    を包含する方法。
  12. 前記分析する工程は、４０３．３／１６４．２または４０３．３／１５２．２のＭＲＭトランジションを測定する工程を包含する、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記分析する工程は、４０６．３／１６７．２または４０６．３／１５５．２の前記ＭＲＭトランジションを測定する工程を包含する、請求項１１または１２に記載の方法。
  14. 前記分析する工程の前に、前記方法は、
    前記反応した液体溶液を液体クロマトグラフィーカラムに導入して、前記反応した液体溶液中の化合物を分離する工程、および
    前記分離した、反応した液体溶液を、分析用の前記タンデム質量分析計へと溶離する工程、
    をさらに包含する、請求項１１，１２、または１３に記載の方法。
  15. 式：
    Figure 2022514379000012
     の化合物を含むタグ化試薬、ならびに
    沈降反応溶液の水性溶液、および
    同位体が富化されたテストステロン、
    のうちの少なくとも1つ、
    を含むキット。
  16. 前記沈降反応溶液は、硫酸亜鉛を含む、請求項１５に記載のキット。
  17. 前記キットは、前記タグ化試薬、沈降反応溶液の前記水性溶液、および前記同位体が富化されたテストステロンを含む、請求項１５から１６のいずれか１項に記載のキット。
  18. バイアル、またはウェルを含むプレートをさらに含む、請求項１５～１７のいずれか１項に記載のキット。
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