CN114460199A - 一种游离睾酮和总睾酮浓度的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种游离睾酮和总睾酮浓度的检测方法，包括使用试剂盒对血清样品进行游离睾酮和总睾酮的抗体偶联磁微富集，自动化前处理以及LC‑MS/MS检测，试剂盒包括睾酮分离纯化试剂条，睾酮定标曲线与睾酮质控品，睾酮分离纯化试剂条包括可分离纯化睾酮的睾酮抗体偶联磁微粒、睾酮稳定同位素内标、淋洗液和洗脱液。本发明结合了免疫法和质谱法的优点，将分离纯化睾酮的所需试剂制备成封闭试剂条，有效避免试剂较差污染带来的实验错误。将样品加入到试剂条中，前处理自动化完成，操作过程仅需要12min，完成样品中睾酮的提取，将处理好的样品取出检测，无需常规的检测方法中常用的各种试剂、耗材、仪器设备及其安置空间，简单高效，易于临床检测和应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种试剂盒，尤其涉及一种游离睾酮和总睾酮浓度的检测方法。
背景技术
游离睾酮是血液循环中以游离形式存在的睾酮，是有活性的状态。血液中的睾酮分为游离睾酮和总睾酮两种存在形式，睾酮分泌后在血液中只有约2％是以游离形式存在，大约65％与性激素结合蛋白结合，大约33％与白蛋白结合。游离睾酮测量对于男性生育和女性疾病诊断都有非常重要的意义，然而检测方法非常具有挑战性，金标准平衡透析法对于常规临床实验室来说过于复杂，分析方法不统一，没有共同的参考范围来帮助结果解释。
总睾酮检测在临床检测中也有重要的意义，如果体内睾酮增高，见于特发性男性性早熟、家族性男性性早熟、肾上腺皮质增生、肾上腺皮质肿瘤、睾丸肿瘤等疾病。睾酮水平降低见于男性睾丸发育不全、无睾征、下丘脑或者垂体性的性腺功能减低等。临床常用免疫法和液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)检测总睾酮浓度。
临床常用的游离睾酮检测方法是计算得到游离睾酮，即先分别测总睾酮浓度和性激素结合蛋白浓度，通过计算得到游离睾酮浓度。然而这种算法是不准确的，因为性激素结合蛋白不仅仅和睾酮结合，与皮质醇等其它类固醇激素也存在结合，而且与睾酮结合的比例也不是恒定的。该方法通常是通过免疫法实现，然而免疫法测睾酮还存在抗体特异性差的缺点，因为体内存在大量的和睾酮结构相似的其它类固醇激素，比如雄烯二酮、双氢睾酮和孕酮等其它类固醇激素，导致游离睾酮检测更加困难。
LC-MS/MS检测睾酮浓度逐渐被临床检测使用，是目前最可靠的检测方法，由于人体内源性睾酮含量很低，且存在复杂的血清基质干扰，因此，LC-MS/MS测定前，样品需要提取、纯化和浓缩。常用的方法有液液萃取和固相萃取(SPE)，液液萃取通常需要用有机试剂如甲基叔丁基醚、二乙醚、二氯甲烷、乙酸乙酯或正己烷等，萃取血清中的睾酮，然后浓缩复溶后再上质谱检测。但是液液萃取后提取物成分复杂，蛋白质等大分子物质难以去除干净，容易堵塞色谱柱和管路，且存在严重的基质效应。此外液液萃取因为用到的有机试剂都有毒性和腐蚀性，需要做好防护，在通风橱操作，且对环境污染严重。固相萃取是通过填充材料对睾酮及其物理性质相似的一类化合物吸附萃取，达到分离和纯化同时进行的目的。但是固相萃取操作复杂，固相萃取小柱或板价格高昂，处理一个样品成本需要十几二十块钱设置更高，临床检测成本太高，限制了其使用。且固相萃取批处理多个样品时，因为样品的不均匀性导致每个小柱中样品和各种液体的流速不一致，有的小柱已经流干了，有的小柱液体还剩余很多，流干的小柱在最后加洗脱液洗脱时会有损失，使得每个样品提取的效率不一致，影响结果检测。无论是液液萃取还是固相萃取都需要复杂的操作，每步操作都需要仔细，精确加入所需液体，极容易出现操作错误，轻则结果可能偏低或偏高，重则没有结果或样品拿混，不利于临床大规模应用。此外完成液液萃取或固相萃取需要高速离心、涡旋震荡、真空浓缩或氮吹、固相萃取还需要正压装置配套使用，这些操作需要配置专用的设备和安置空间，需要经常维护，无形中增加了成本。
中国专利申请公布号CN 113049719 A，发明名称为“一种检测游离睾酮的方法及其试剂盒”，采用了固相萃取方法检测游离睾酮浓度。中国专利申请公布号CN 113390978A，发明名称为“平衡透析合并LC-MS/MS技术测定人血清样本中游离睾酮含量的分析方法”，采用了衍生法检测游离睾酮浓度。这两个专利公开的方法都需要复杂的操作和较长的处理时间，无法实现自动化。
10kDa超滤管通过超滤浓缩，可将血清中大于10kDa的大分子蛋白和其它成分分离，性激素结合蛋白分子量95kDa，白蛋白分子量66kDa，结合态睾酮主要与这两个蛋白结合。通过超滤管浓缩，大于10kDa的蛋白截留在超滤管上边，与白蛋白和性激素结合蛋白结合的睾酮截留在超滤管上边，超滤管下方的液体为小于10kDa的成分，包括游离睾酮。超滤管浓缩可作为分离游离睾酮的一种有效方法，常见于文献报道，如游离激素检测现状及液相色谱串联质谱法的临床应用(中华检验医学杂志，2017年10月第40卷第10期748页-755页)中指出超滤法与平衡透析法结合LC-MS/MS法是检测游离睾酮的两种主要方法，但是这两种方法分离的游离睾酮血清样品需要复杂的样品处理，仍然无法实现自动化。
发明内容
为了解决现有游离睾酮和总睾酮浓度的检测方法复杂，免疫法检测睾酮存在抗体特异性的缺陷，本发明提供了一种游离睾酮和总睾酮浓度的检测方法，本发明基于免疫法和质谱法的结合，根据需要，可自动化分离纯化血清样品中的游离睾酮或总睾酮，整个前处理操作过程仅需要12min，即可完成样品中睾酮的提取，再上质谱检测，简单高效，易于临床检测和应用。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种游离睾酮和总睾酮浓度的检测方法，所述检测方法包括使用试剂盒对血清样品进行游离睾酮和总睾酮的抗体偶联磁微富集，自动化前处理以及LC-MS/MS检测；
其中，所述试剂盒包括睾酮分离纯化试剂条，睾酮定标曲线与睾酮质控品，所述睾酮分离纯化试剂条包括可分离纯化睾酮的睾酮抗体偶联磁微粒、睾酮稳定同位素内标、淋洗液和洗脱液。
在本发明中，本发明配制抗体偶联磁微粒、内标、洗涤液和洗脱液，加到单人份试剂条作为睾酮分离纯化试剂条。游离睾酮通过10kDa超滤管预分离，再通过试剂条提取结合LC-MS/MS检测游离睾酮浓度。总睾酮直接通过试剂条提取结合LC-MS/MS检测总睾酮浓度。通过一系列的性能验证实验，证明本发明所述方法能实现自动化、准确、稳定的检测睾酮浓度。
作为本发明的一种优选方案，所述睾酮抗体偶联磁微粒的制备方法包括以下步骤：
1)睾酮抗体多次离心，超滤，保存在PBS缓冲液中；
2)将磁微粒混合均匀；
3)将步骤2)的磁微粒加入去离子水，混合均匀后磁性分离去除上清液，重复多次；
4)使用PBS缓冲液重悬步骤3)得到的磁微粒，磁性分离去除上清液，重复多次；
5)使用PBS缓冲液重悬步骤4)得到的磁微粒，加入步骤1)的睾酮抗体，室温下混合；加入碳化二亚胺溶液，补足体系体积，在室温下涡旋偶联，磁性分离去除上清液；
6)使用PBS缓冲液重悬步骤5)得到的抗体偶联磁微粒，磁性分离去除上清液，重复多次；
7)重悬步骤6)得到的抗体偶联磁微粒，以去除内源性睾酮和其它类固醇激素；
8)使用由高到底梯度浓度的一元醇或乙腈水溶液，恢复步骤7)得到的抗体偶联磁微粒的活性，并保存在体积分数为1-20％甲醇溶液中。
作为本发明的一种优选方案，步骤8)的由高到低梯度浓度依次为：80-100％一元醇或乙腈、60-79％一元醇或乙腈、50-59％一元醇或乙腈、40-49％一元醇或乙腈、30-39％一元醇或乙腈、20-29％一元醇或乙腈以及0-19％一元醇或乙腈溶液。
作为本发明的一种优选方案，所述试剂条上设置有1号至15号的孔；其中，3号孔、4号孔与5号孔用于放置淋洗液；6号孔用于放置睾酮稳定同位素内标；7号孔用于放置睾酮抗体偶联磁微粒；9号孔用于放置洗脱液。
作为本发明的一种优选方案，所述淋洗液为100-400μL的PBS溶液。
作为本发明的一种优选方案，所述睾酮稳定同位素内标为30-100μL体积分数2-30％甲醇配制的5ng/mL睾酮-D3内标。
作为本发明的一种优选方案，所述洗脱液为100-300μL的体积分数为70-100％一元醇或乙腈溶液。
作为本发明的一种优选方案，所述睾酮定标曲线是将睾酮用2％一元醇或乙腈溶液98％PBS-30％一元醇或乙腈溶液70％PBS配制成0.005ng/mL、0.01ng/mL、0.02ng/mL、0.05ng/mL、0.2ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、5ng/mL与15ng/mL。
作为本发明的一种优选方案，所述睾酮质控品包括0.15ng/mL的低浓度质控品与10.5ng/mL的高浓度质控品。
作为本发明的一种优选方案，游离睾酮通过10kDa超滤管预分离，再通过试剂条提取结合LC-MS/MS检测游离睾酮浓度；总睾酮直接通过试剂条提取结合LC-MS/MS检测总睾酮浓度。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明结合了免疫法和质谱法的优点，将分离纯化睾酮的所需试剂制备成封闭试剂条，有效避免试剂较差污染带来的实验错误。只需要简单的将样品加入到试剂条中，前处理可通过杭州佰辰医学检验所的iMS-1000设备自动化完成，操作过程仅需要12min，即可完成样品中睾酮的提取，然后将处理好的样品取出上LC-MS/MS检测，无需常规的液相色谱串联质谱法检测中常用液液萃取和固相萃取等所需的各种试剂、耗材、仪器设备及其安置空间，简单高效，易于临床检测和应用。
附图说明
图1是本发明的睾酮定标曲线。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明中，如未特别说明，％是指代体积分数，所采用的试剂可从市场购得。
本发明中所用的质谱仪为Waters TQS，样品前处理所用的仪器是杭州佰辰医学检验所的iMS-1000设备。
实施例1
本实施例提供了游离睾酮和总睾酮浓度的检测方法，包括睾酮分离纯化试剂条，睾酮定标曲线与睾酮质控品，所述睾酮分离纯化试剂条包括可分离纯化睾酮的睾酮抗体偶联磁微粒、睾酮稳定同位素内标、淋洗液和洗脱液。
其中，睾酮抗体偶联磁微粒配制方法包括以下步骤：
1)抗体溶液预处理：使用30kD超滤管将1mg睾酮抗体于4℃，12000g离心10min超滤，加500μL PBS，12000g离心10min超滤，重复3次，使睾酮抗体保存液置换为PBS缓冲液；
2)磁微粒混合均匀，取1000μL(10mg)磁微粒加入到2mL EP管中，磁力架上磁性分离去除上清液；
3)加入去离子水，混合均匀，磁性分离去除上清液，再重复2次；
4)加入100μL PBS重悬磁微粒，磁性分离去除上清液，再重复2次；
5)加入50μL PBS重悬磁微粒，加入1mg睾酮抗体(提前溶于PBS)，室温旋转混合30min；
6)加入10μL现配的10mg/mL碳化二亚胺溶液，补充PBS使体系到总体积为1000μL，室温涡旋偶联1～3hr，磁性分离去除上清液；
7)加入100μL淬灭缓冲液(50mmol/L Tris-HCl，pH7.4)重悬磁微粒，涡旋混合30min，磁性分离去除上清液；
8)加入1000μL PBS，混合重悬磁微粒，磁性分离去除上清液，再重复2次；
9)偶联好的抗体偶联磁微粒加1mL 80-100％甲醇重悬，颠倒混匀3min，去除内源性睾酮和其它类固醇激素，抗体偶联磁微粒再用80-100％甲醇洗涤数次，直至上清液中检测不到睾酮和其它类固醇激素，弃掉80-100％甲醇；
10)加60-79％甲醇重悬抗体偶联磁微粒，颠倒混匀3min，弃掉60-79％甲醇。再依次用50-59％甲醇、40-49％甲醇、30-39％甲醇、20-29％甲醇、0-19甲醇梯度恢复抗体活性，并将抗体偶联磁微粒保存在1-20％甲醇溶液中，使得抗体偶联磁微粒浓度达到0.5-3mg/mL。
睾酮试剂条配制
试剂条包括1号孔至15号孔，3号孔，4号孔与5号孔分别加入100-400μL PBS，作为洗涤液。6号孔加入30-100μL 10％甲醇配制的5ng/mL睾酮-D3(Testosterone-D3)内标。7号孔加入5-50μL 1mg/mL睾酮抗体偶联磁微粒。9号孔加入100-300μL 70-100％甲醇，作为洗脱液。然后试剂条用封口铝膜密封，制成睾酮纯化试剂条，4℃保存。
睾酮定标曲线配制
睾酮(Testosterone)用2％甲醇98％PBS-30％甲醇70％PBS配制配置定标曲线，如表1所示，单位ng/mL，每管250μL封装，﹣80℃保存。
表1睾酮定标曲线浓度
睾酮质控品配制
血清用透析袋透析数次，直至睾酮浓度低于0.15ng/mL，加入睾酮标准品配制低、高浓度质控品，低浓度质控品理论值0.15ng/mL，高浓度质控品10.5ng/mL。每管250μL封装，﹣80℃保存。
免疫质谱法睾酮分离纯化试剂盒配制
将上述配制好的睾酮分离纯化试剂条、睾酮定标曲线和睾酮质控品组成睾酮分离纯化试剂盒。
实施例2
本实施例是采用实施例1所述的试剂盒，包括了以下的步骤：
样品处理
游离睾酮检测方法，10kD超滤管加200μL超纯水，12000g离心10min，弃去超滤管下方的废液，并吸去超滤管中液体。向超滤管中加入400μL人血清样品，12000g离心20min，取超滤管下方的血清220加入到睾酮分离纯试剂条1号孔中，将试剂条和样品放入iMS-1000仪器，放入对应数量的吸头，选择睾酮方法，点开始按钮处理，约12min后处理完成。从14号孔取出100μL前处理好的睾酮和雄烯二酮标线1-6、低、高质控品和待检样品到96孔板中，Waters TQS质谱仪检测。
总睾酮检测方法，直接取血清220加入到睾酮分离纯试剂条1号孔中，将试剂条和样品放入iMS-1000仪器，放入对应数量的吸头，选择睾酮方法，点开始按钮处理，约12min后处理完成。从14号孔取出100μL前处理好的睾酮和雄烯二酮标线1-6、低、高质控品和待检样品到96孔板中，Waters TQS质谱仪检测。
色谱参数
1、色谱柱：Waters CORTECS C18(2.1×50mm，2.7μm)。
2、流动相A：0.1％甲酸、2mmol/L乙酸铵水溶液；流动性B：0.1％甲酸、2mmol/L乙酸铵甲醇溶液。
3、液相色谱洗脱梯度：
表2液相色谱洗脱梯度
4、流速：0.5mL/min；柱温：45℃；进样：15μL。
质谱参数
1、质谱型号和扫描模式：I-class Waters TQS，正离子模式
2、毛细管电压：0.8kv；脱溶剂温度：350℃；脱溶剂气：800L/hr；锥孔气：150L/hr；
3、扫描模式：多反应监测(MRM)，各化合物质谱参数如下：
表3睾酮多反应监测(MRM)质谱参数
精密度
分别检测低、高2个浓度水平样品浓度，每天各进行3次重复，连续测5天。
正确度验证
选择实际病人血清作为回收实验基础样品，按照100μL低、中、高标准样品分别与900μL的基础样品混合，如表4所示，要求：低浓度为线性范围下限的3倍；中浓度为线性范围中间浓度；高浓度为线性范围上限的75％。将上述“基础样品”和“实验样品”重复平行测定6次，记录实验结果并进行统计分析低、中、高3个浓度水平的加标回收情况，回收率＝(检测值-基础样品值)/理论值×100％，85％＜回收率＜115％。
表4加标回收配制表
定量下限
定量下限为LC-MS/MS方法在满足实验室对准确度和精密度要求的前提下检测出的目标分析物的最低值。定量下限选择5个浓度接近检测限的样本，每个浓度样本分为5份进行处理，每份样本重复测定3次，连续测定3个批次，分别评估每个浓度样本的总精密度(CV)及其浓度测定均值与理论浓度的偏差，将CV≤20％、偏倚<15％的最低浓度样本的测定均值作为方法的定量下限。
基质效应
6份人血清样本分别处理处理，每份样本重复3次。10％甲醇配置睾酮低浓度(0.15ng/mL)、中浓度(7.5ng/mL)和高浓度(11.25ng/mL)三个浓度水平，低、中和高3个浓度与分别与6份人血清样本1∶1混合，质谱分析。基质效应＝(血清样品睾酮峰面积+10％甲醇配制样品峰面积)/1:1混合物峰面积×100％，基质效应<15％，则证明没有基质效应。
稀释可靠性
收集线性范围上限附近的病人血血样本，分别加水稀释2、4和8倍，质谱分析，要求：85％＜平均回收率＜115％。
进样盘72小时稳定性
选择低至高浓度10个样品，经前处理后，置于LC-MS/MS进样盘(8℃)中，分别与0、24、48和72小时分析处理好的样品在进样盘中72小时的稳定性。
携带污染
先重复进样低浓度样本，然后交替进样高浓度样本和低浓度样本。比较第1次进样的低浓度样本的检测结果与随后进样的低浓度样本检测结果差异，若低于预定标准(20％)，则认为在测定该高浓度及以下浓度样本时不存在明显的携带污染。
实际样品检测
选取本实验室检测的临床实际样品，8个女性和2个男性样品，分别检测游离睾酮和总睾酮。
实验试剂和材料
甲酸购自于阿拉丁，透析袋、10kD和30kD超滤管、甲醇、睾酮和睾酮-13C3购自于默克，超纯水购自于屈臣氏，睾酮抗体购自于Thermo，磁微粒和磁力架购自于英芮诚生化科技有限公司。
实施例3
本实施例提供的是通过实施例2的方法，得到的结果，具体为：
定标曲线线性测试结果
参见图1，定标曲线范围0.005～15ng/mL，R2＝0.9998，符合要求(要求R2≥0.99)。
精密度
表5睾酮5天精密度
正确度验证
表6睾酮正确度验证结果
定量下限
表7睾酮定量下限结果
基质效应
表8睾酮低浓度基质效应结果
表9睾酮中浓度基质效应结果
表10睾酮高浓度基质效应结果
稀释可靠性
表11睾酮稀释可靠性结果
处理好的样品进样盘3天稳定性
表12睾酮处理好的样品进样盘(8℃)3天稳定性结果
携带污染
表13睾酮携带污染结果
注：H为高浓度标本；L为低浓度标本。
实际样品游离睾酮和总睾酮检测结果
表14结果表明，本发明所述方法可检测到极低样品的睾酮浓度，尤其是大多数女性的游离睾酮浓度，游离睾酮占总睾酮比例符合理论值预期(理论占比约2％)。
表14实际样品睾酮和总睾酮检测结果
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。
Claims (10)
1.一种游离睾酮和总睾酮浓度的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括使用试剂盒对血清样品进行游离睾酮和总睾酮的抗体偶联磁微富集，自动化前处理以及LC-MS/MS检测；
其中，所述试剂盒包括睾酮分离纯化试剂条，睾酮定标曲线与睾酮质控品，所述睾酮分离纯化试剂条包括可分离纯化睾酮的睾酮抗体偶联磁微粒、睾酮稳定同位素内标、淋洗液和洗脱液。
2.根据权利要求1所述的一种游离睾酮和总睾酮浓度的检测方法，其特征在于，所述睾酮抗体偶联磁微粒的制备方法包括以下步骤：
1)睾酮抗体多次离心，超滤，保存在PBS缓冲液中；
2)将磁微粒混合均匀；
3)将步骤2)的磁微粒加入去离子水，混合均匀后磁性分离去除上清液，重复多次；
4)使用PBS缓冲液重悬步骤3)得到的磁微粒，磁性分离去除上清液，重复多次；
5)使用PBS缓冲液重悬步骤4)得到的磁微粒，加入步骤1)的睾酮抗体，室温下混合；加入碳化二亚胺溶液，补足体系体积，在室温下涡旋偶联，磁性分离去除上清液；
6)使用PBS缓冲液重悬步骤5)得到的抗体偶联磁微粒，磁性分离去除上清液，重复多次；
7)重悬步骤6)得到的抗体偶联磁微粒，以去除内源性睾酮和其它类固醇激素；
8)使用由高到低梯度浓度的一元醇或乙腈溶液，恢复步骤7)得到的抗体偶联磁微粒的活性，并保存在1-20％甲醇溶液中。
3.根据权利要求2所述的一种游离睾酮和总睾酮浓度的检测方法，其特征在于，步骤8)的由高到低梯度浓度依次为：80-100％一元醇或乙腈、60-79％一元醇或乙腈、50-59％一元醇或乙腈、40-49％一元醇或乙腈、30-39％一元醇或乙腈、20-29％一元醇或乙腈以及0-19％一元醇或乙腈溶液。
4.根据权利要求1所述的一种游离睾酮和总睾酮浓度的检测方法，其特征在于，所述试剂条上设置有1号至15号的孔；其中，3号孔、4号孔与5号孔用于放置淋洗液；6号孔用于放置睾酮稳定同位素内标；7号孔用于放置睾酮抗体偶联磁微粒；9号孔用于放置洗脱液。
5.根据权利要求4所述的一种游离睾酮和总睾酮浓度的检测方法，其特征在于，所述淋洗液为100-400μL的PBS溶液。
6.根据权利要求4所述的一种游离睾酮和总睾酮浓度的检测方法，其特征在于，所述睾酮稳定同位素内标为30-100μL体积分数2-30％甲醇配制的5ng/mL睾酮-D3内标。
7.根据权利要求4所述的一种游离睾酮和总睾酮浓度的检测方法，其特征在于，所述洗脱液为100-300μL的体积分数为70-100％一元醇或乙腈溶液。
8.根据权利要求1所述的一种游离睾酮和总睾酮浓度的检测方法，其特征在于，所述睾酮定标曲线是将睾酮用2％一元醇或乙腈溶液98％PBS-30％一元醇或乙腈溶液70％PBS配制依次配制成0.005ng/mL、0.01ng/mL、0.02ng/mL、0.05ng/mL、0.2ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、5ng/mL与15ng/mL。
9.根据权利要求1所述的一种游离睾酮和总睾酮浓度的检测方法，其特征在于，所述睾酮质控品包括0.15ng/mL的低浓度质控品与10.5ng/mL的高浓度质控品。
10.根据权利要求1所述的一种游离睾酮和总睾酮浓度的检测方法，其特征在于，游离睾酮通过10kDa超滤管预分离，再通过试剂条提取结合LC-MS/MS检测游离睾酮浓度；总睾酮直接通过试剂条提取结合LC-MS/MS检测总睾酮浓度。
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