CN113544514A

CN113544514A - 使用lc-msms测量睾酮的方法

Info

Publication number: CN113544514A
Application number: CN201980084883.XA
Authority: CN
Inventors: S·N·德伊; M·温斯托克
Original assignee: DH Technologies Development Pte Ltd
Current assignee: DH Technologies Development Pte Ltd
Priority date: 2018-12-21
Filing date: 2019-12-23
Publication date: 2021-10-22
Also published as: WO2020129032A1; US20220057412A1; US11879898B2; EP3899548A1; JP2022514379A

Abstract

本发明提供了使用质谱分析睾酮的方法。该方法需要将与睾酮反应的标记试剂、从溶液中沉淀蛋白质的水性沉淀剂和内标溶液(内标溶液含有已知浓度的同位素富集睾酮)组合于小瓶或孔中，然后向小瓶或孔中添加含有或怀疑含有睾酮的样本。然后可将小瓶混合以引起蛋白质同时沉淀以及存在的任何睾酮与标记试剂反应，形成沉淀物和液体溶液的混合物。然后可将液体溶液与任何沉淀物分离，然后用液相色谱‑串联质谱分析睾酮。

Description

使用LC-MSMS测量睾酮的方法

相关申请

本申请要求于2018年12月21日提交的美国临时申请第62/783,657号的优先权，其全部内容通过引用并入本文。

技术领域

本发明一般涉及睾酮的质谱分析方法。

背景技术

临床诊断实验室测定应简单、经济、快速、可靠。此外，将测定结果(偏差和不精确性)与金标准(例如CDC参考方法)(Clinical Chemistry,Vol.59(2),pp.372-380，通过引用并入本文)校准，对患者健康具有重要影响。越来越多的趋势是从患者身上，特别是从儿童和新生儿人群中，尽可能少地抽取血液，从而要求测定满足小样本量和人群中所需分析物最低参考水平的敏感性和准确性要求。在年轻成年女性中，睾酮水平比年轻成年男性低15倍以上(分别为2-45ng/dL和250-1100ng/dL)。在儿童样本中，2-10岁的女性和男性的总睾酮水平最低，可以<20ng/dL。随着儿童进入青春期，该水平显著增加，直到成年，但在青春期前期间，该水平可以≤5ng/dL。在儿童中，睾酮的测量对于鉴定先天性类固醇代谢异常和青春期延迟或性早熟的病例很重要。在成年女性和男性中，低睾酮水平导致不孕、性功能障碍、疲劳、肌肉耗失和情绪波动。诊断男性和女性雄激素缺乏症，以及评估儿童样本中的睾酮水平，需要一个高度特异、准确和灵敏的测量程序。

分析相对较少样本量(<100/天)的中小型医院实验室可以受益于使用人工制备样品的高灵敏度方法，这对于初级水平的操作员来说很容易。快速分析的简单、经济的自动化制备样品适合分析大量样本的大型或核心临床实验室。

尽管先前的睾酮分析出版物(Analytical Chemistry,Vol.84(21),pp.9310-7,通过引用并入本文)旨在描述一种超高灵敏度方法，该方法设计提高游离睾酮、干血斑、女性和/或儿童血清样本的定量灵敏度，本文提出的方法旨在提高简单性和鲁棒性(robustness)。

发明概述

本方法为所有进行低水平睾酮分析的实验室提供一种简单、可靠、灵敏的解决方案。分析物提取和衍生化同时进行。

在各种实施方案中，公开了一种分析样本中总睾酮的方法，其包括以下步骤：a)组合与睾酮反应的标记试剂、从溶液中沉淀蛋白质的水性沉淀剂，和内标溶液，该内标溶液含有已知浓度的同位素富集睾酮，和含有或怀疑含有睾酮的样本，b)混合该组合，导致同时发生蛋白质沉淀和任何存在的睾酮与标记试剂反应，形成沉淀物和反应的液体溶液的混合物，c)将沉淀物与反应的液体溶液分离，e)使用串联质谱法分析反应的液体溶液以鉴定和/或定量样本睾酮。在一些方面，反应的液体溶液可在引入串联质谱仪之前使用液相色谱进行处理。

在一些实施例中，标记试剂包含下式化合物：

在一些实施方案中，水性沉淀剂包含硫酸锌。

在一些实施方案中，分离混合物中的沉淀物包括通过包含在滤板中的过滤介质过滤混合物并在收集板中收集作为滤液的液体溶液。

在各种实施方案中，描述了一种分析样本中总睾酮的方法，其包括以下步骤：a)将下式化合物：

含有硫酸锌的水溶液和含有2,3,4,-¹³C₃-睾酮的溶液组合于微量离心瓶中，b)向微量离心瓶中加入含有或怀疑含有睾酮的血清或血浆样本，c)混合小瓶，d)离心小瓶，e)将小瓶中的上清液与任何沉淀物分离，f)使用串联质谱法分析上清液中的睾酮。在一些方面，使用液相色谱(LC柱)处理上清液并将所得经分离的上清液从LC柱洗脱至质谱仪用于分析。

含有硫酸锌的水溶液和含有2,3,4,-¹³C₃-睾酮的溶液组合于滤板的孔中，b)向孔中加入校准液(calibrator)、对照或含有或怀疑含有睾酮的患者样本，c)摇动滤板引起混合，d)通过离心将滤板孔中的内容物过滤到收集板中以在收集板中形成滤液，e)使用串联质谱法分析滤液中的睾酮。

在上述的一些实施方案中，分析包括在串联质谱仪中测量403.3/164.2或403.3/152.2的MRM跃迁。

在上述的一些实施方案中，分析包括在串联质谱仪中测量406.3/167.2或406.3/155.2的MRM跃迁，并且其中同位素富集的睾酮为2,3,4 ¹³C₃-睾酮。

在各种实施方案中，试剂盒，包含标记试剂与沉淀溶液的水溶液和同位素富集的睾酮中的至少一种的组合。在一些方面，其中沉淀溶液包含硫酸锌。在一些方面，标记试剂包含下式化合物：

附图简述

图1描绘了适用于单管和96孔板方法的示例性样本制备工作流程。

图2描绘了衍生化睾酮、表睾酮和¹³C₃睾酮内标的色谱图。

图3A描绘了校准液的色谱图。

图3B描绘了校准曲线

图4描绘了男性和女性NIST参考标准的叠加色谱图。

图5描绘了CDC激素标准化程序(HoSt T)的40份血清样本的参考和计算睾酮浓度之间的平均差异图。

图6描绘了来自CDC HoSt T程序的40个血清样本的参考和计算睾酮浓度之间的Pearson相关性。

图7A和7B描绘了一年内CDC参考值和确测的平均值之间的差异百分比。

图8描绘了计算出的20个匹配的血清/血浆儿童样本的睾酮浓度和相应的相关性图。

图9描绘了为17个成人匹配的血清/血浆(两种类型)计算出的睾酮浓度。

具体实施方案

通过酮官能团衍生化(例如，使用Amplifex^TM酮试剂)，创建了一种准确、稳健的总睾酮ESI-LC-MS/MS定量方法，该方法具有简单的样本制备工作流程和对所有性别和年龄组的血清或血浆样本具有足够的灵敏度。分析样本中总睾酮的方法包括以下步骤：通过将与睾酮反应的标记试剂(例如Amplifex^TM酮试剂)、从溶液中沉淀蛋白质的水性沉淀剂和含有已知浓度的同位素富集睾酮的内标溶液组合制备样本溶液。可以将含有或怀疑含有样本睾酮的样本加入到组合中进行测试和分析。然后将所得样本溶液混合以沉淀蛋白质并使存在的任何睾酮与标记试剂反应形成沉淀物和反应的液体溶液的混合物。然后将沉淀物与反应的液体溶液分离，例如通过离心。也可以采用其他已知的分离方式，例如通过操控磁珠来捕获沉淀的蛋白质。分离和反应的液体溶液通常也可称为上清液。然后可将反应的液体溶液，即上清液注入串联质谱仪，以鉴定和/或定量样本中的睾酮(如果存在)。根据需要，并且如本领域已知的，在引入串联质谱仪之前可采用液相色谱柱(LC柱)以过滤、浓缩和分离反应的液体溶液中的化合物。也可以使用用于处理反应的液体溶液的替代装置来代替LC柱，然后可以使用流动注射分析(FIA)或使用本领域已知的注射泵输注将处理过的样本引入质谱仪。

通过采用同时进行的蛋白质沉淀和用质量标记试剂(例如Amplifex^TM酮试剂)衍生化以产生沉淀物和反应的液体溶液的混合物，开发了一种适用于较少样本量和大量样本量的简单样本制备方法。在一些实施方案中，然后可通过离心处理混合物将沉淀物与反应的液体分离，产生分离的上清液。在一些实施方案中，然后可将上清液注入液相色谱(LC)串联质谱(MS/MS)系统(SCIEX-Topaz^TMIVD LC-MS/MS，其中MS在性能上等同于SCIEX 4500MD)，用于检测和/或定量睾酮的分析。

以下列举的具体设备和步骤顺序是举例说明，并且本领域技术人员将理解，可以用等效的已知处理步骤替换以下所述的具体实例和设备。

在示例实验中，使用通过约1-2000ng/dL(10-20000pg/mL)宽浓度范围(NIST971SRM可示踪的)的校准液生成的外校准曲线，定量测定人血清或血浆样本中的总睾酮。将富含¹³C₃的睾酮内标以恒定量添加到校准标准和未知样本中，以校正样本制备过程中分析物的损失或分析过程中的基质效应。开发了两种方法，一种使用96孔滤板，另一种使用Eppendorf管。这两种方法都获得了疾病控制中心(CDC)睾酮激素标准化程序(HoSt T)的认证。通过对源自同一供体的匹配儿童血清和血浆样本进行小规模方法比较研究，测试了对血浆和血清样本实施该方法的可行性。此外，将在两种不同的抗凝管类型(肝素锂和K2EDTA)中收集的血浆样本与源自同一供体的样本进行比较。

使用内部配制的NIST 971可示踪的校准液(traceable calibrators)，该方法在1至2000ng/dL(10至20000pg/mL)之间呈线性(r2>0.999)，检测限约为1ng/dL(10pg/mL)。来自CDC HoSt T标准化程序的40份参考样本的睾酮浓度偏差<3％，平均％CV为约4。超过80％的样本通过了±6.4％的CDC偏差标准。儿童匹配的血清和血浆样本之间的比较导致高相关性(r2＝0.997)和<5％的偏差。匹配的成人血清和血浆样本之间的差异约为1％。

选择适合少量或大量样本的样本制备工作流程，证明了适用于测量所有人类样本中总睾酮的准确和简化方法的可行性。该方法可有效用于来自不同采血管(Li-肝素和K2EDTA)的血浆基质。

本文给出的方法使得可以使用100μL的小样本量对人血清(或血浆)中的总睾酮进行定量，定量下限(LLOQ)约为1ng/dL(10pg/mL)。本文的教导描述了样本制备工作流程的两种变体，以适应小型或大型临床实验室的要求。第一个工作流程涉及手动操作，通过人工操作在单个试管中进行睾酮提取。它设计用于较小的样本量(<100/天)。第二个工作流程在自动化样本制备平台上使用96孔滤板，万一不能获得自动化移液平台，其也可以与手动移液一起使用。单个试管和96孔滤板方法均已通过CDC HoSt T标准化程序的认证。

睾酮(100μg/mL乙腈溶液，纯度99.8％)、2,3,4-¹³C₃-睾酮(10μg/mL乙腈溶液，99.8％)和表睾酮(1mg/mL乙腈溶液，纯度99.7％)的经认证的标准溶液购自Cerilliant(Round Rock,TX)。系统适用性溶液(SST)由上述睾酮、表睾酮和2,3,4-¹³C₃-睾酮在MeOH/H₂O 1/1(V/V)中内部制备。ZnSO₄·7H₂O购自Sigma Aldrich，并用超纯水(18MΩElgaLabWater system，美国)制成0.4M溶液。无需进一步调节pH。甲醇、乙腈和甲酸，质谱级溶剂购自VWR International(Radnor,PA)。牛血清白蛋白(BSA，料号A2153)作为冻干粉购自Sigma Aldrich(St.Louis,MO)。睾酮标准参考物质(SRM)NIST 971购自美国国家标准与技术研究所(Gaithersburg,MD)。上述一个或多个组分可并入一个试剂盒中。

CDC血清样本作为HoSt T激素标准化程序(CDC Atlanta,GA)的一部分进行分析。儿童血浆(肝素锂(LH)、K2EDTA)/血清匹配样本购自iSpecimen(Lexington,MA)。Amplifex^TM酮试剂试剂盒得自SCIEX(Framingham,MA)。使用前，将试剂瓶和稀释剂瓶的内容物以1:1(V/V)混合以获得最终Amplifex^TM酮试剂溶液。衍生化过程、化学和衍生化后几何异构体形成的细节描述于Analytical Chemistry,第84卷第9310-7页，其通过引用并入本文。

对于样本提取，微量离心管、96孔滤板、96孔收集板以及滤板盖均得自SCIEX。LC自动进样管和卡扣帽(snap caps)购自VWR International。

校准液和对照使用5％BSA作为基质内部制备，该基质经我们分析测定不含内源性睾酮。睾酮工作储液由经认证的睾酮标准溶液(100μg/mL乙腈溶液，Cerilliant)制备。该工作溶液用于加标到5％BSA溶液中，以制成约2000ng/dL(约20000pg/mL)的最高浓度校准液。该最高浓度校准液用5％BSA进一步稀释，以制备其他校准液浓度(1.8、8、16、59.9、144.7、844.2和1842.6ng/dL)和质量控制水平(4、32.7和476.8ng/dL)。校准液和对照的浓度是NIST 971可示踪的，即人血清基质中睾酮的标准参考物质(SRM)。

系统适用性(SST)溶液

SST用于在分析校准液和未知样本之前监测LC-MS/MS系统的性能，其制备如下。将睾酮、2,3,4-¹³C₃-睾酮和表睾酮(分别为10、5和3μg)的混合物在微量离心瓶中用1000μL最终Amplifex^TM酮试剂溶液在室温下衍生化120分钟。将衍生化后的溶液转移到100mL容量瓶中，并使用1:1(V/V)甲醇-水将体积加至100mL，得到睾酮、2,3,4-¹³C₃-睾酮和表睾酮水平分别为0.1、0.05和0.03μg/mL的储液。使用1:1(V/V)甲醇-水将该储液进一步稀释500倍以获得最终SST：睾酮，200pg/mL(20ng/dL)；2,3,4-¹³C₃-睾酮，100pg/mL(10ng/dL)；和表睾酮，60pg/mL(6ng/dL)。将SST在-20℃下储存。

内标(IS)溶液

为了校正样本制备和分析中的任何变异性，使用2,3,4-¹³C₃-睾酮(20ng/mL，通过稀释10μg/mL认证标准制备)的甲醇溶液作为内标。在样本制备前，将此溶液加标至每个样本、校准液或对照中。

图1显示了使用单个样本管(或小瓶)或96孔滤板的样本制备的示例性实施方案。使用96孔滤板可以轻松实现自动化和大量测试。

使用1.5mL微量离心瓶制备样本时，将85μL最终Amplifex酮试剂溶液、25μL沉淀溶液(含有沉淀剂、硫酸锌(ZnSO₄)0.4M)和25μL内标溶液加入该瓶。然后将100μL血清或血浆样本、校准液或对照移入各单个标记的微量离心瓶。涡旋混合15-30秒后，将蛋白质沉淀的样本在室温下孵育30分钟，以15000rpm离心2分钟以将沉淀的蛋白质与反应的液体溶液分离。然后将共计140μL的上清液(即反应的液体溶液)分离并转移到自动进样瓶(聚丙烯，带有300μL内插管(insert))进行LC/MS/MS分析。

使用96孔板样本制备时，可以使用手动移液或自动机器人平台执行以下样本制备步骤。自动化样本制备部分在Topaz^TMPrep Station(SCIEX，Framingham，MA)平台上进行，使用堆叠在收集板上部的96孔滤板。将以下顺序的试剂手动分配到滤板上：85μL Amplifex酮试剂溶液、25μL含有沉淀剂的沉淀溶液、25μL内标溶液、100μL校准液、对照或患者样本。接下来，将未覆盖的滤板加载到制备站的特定机架上，并将收集板加载到单独的机架上。启动一个分析特定的编程脚本，让机器人在环境温度(20-30℃)下以600rpm摇动平板30分钟和以4000rpm离心4分钟(机械臂将滤板和收集板连接在一体式离心机内)。收集板(连同收集的滤液)用粘合密封件封盖并放置在LC/MS/MS系统的自动进样器中用于分析。

如果没有自动化平台，滤板的摇动和离心可以在任何标准的96孔板振荡器(例如Eppendorf Thermomixer R)和带有孔板转子的离心机(如带有A-2-MTP转子的Eppendorf5430)上进行。

衍生化过程中孵育时间也有助于提高蛋白质沉淀和睾酮提取效率，因为在提取时孵育样本是常见的做法。

LC-MS/MS方法

在Topaz IVD LC-MS/MS系统(SCIEX 4500MD LC-MS/MS)上分析制备(通过单个小瓶或96孔滤板法制备)的样本。含有衍生化睾酮、表睾酮和内标¹³C₃-睾酮的SST在分析前一式三份进样，以鉴定LC/MS/MS系统性能，产生图2中描绘的色谱图。每个未知样本、校准液、对照和SST的进样体积为50μL。LC梯度使得衍生化后形成的Amplifex^TM酮-睾酮几何异构体(E和Z异构体)基线分离。Amplifex酮-睾酮肟的几何异构体(E-Z)分离为双峰。HPLC流动相为0.1％甲酸/水溶液(流动相A)和0.1％甲酸/乙腈溶液(流动相B)。Phenomenex Kinetex联苯柱(50x3.0mm，5μm)在40℃下使用，梯度分布如表1所示，用于分析分离。质谱仪上的分流阀用于分流过量的试剂洗脱和LC柱洗涤。LC运行时间比过去所使用的那些更短，并且使用更稳健的分析柱，具有更大的直径和粒径，以更好地满足分析实验室的要求。

表1：LC梯度特征

用作定量和定性MRM跃迁(transitions)的MS/MS碎片分别为403.3→164.2和403.3→152.2。用于衍生化的¹³C₃-睾酮IS定量和定性的跃迁分别为406.3→167.2和406.3→155.2。去簇电压(DP)为80V，碰撞能量(CE)为57eV，离子喷雾能为3000V，碰撞室出口电压(cell exit potential)(CXP)为5V。离子源温度设置为650℃，气帘气(CUR)设置为25psi。

未知样本浓度基于使用上述校准液生成的校准曲线计算。浓度与Amplifex酮-睾酮(分析物)和Amplifex酮-¹³C₃-睾酮(IS)之间的比率用于线性回归分析。对分析物和IS的几何异构体峰进行积分和求和。SCIEX

MD 1.6.2和MultiQuant MD 3.0.2程序用于LC-MS/MS方法优化、数据采集、数据处理和量化。对于校准液和对照所给定的值可接受准确度为±15％，最低校准液除外，其可接受准确度为±20％。

定量下限(LLOQ)是在将27.7ng/dL的NIST 971女性参考样本(一式三份)连续稀释至以下浓度后估算的：6.93、2.77、1.39、0.69和0.34ng/dL，其中用5％BSA作为稀释剂。LLOQ标准是％CV≤15(n＝3)和信噪比(S/N)≥10。此外，在四个不同的日子评估了最低校准物水平的S/N比，并估计了S/N比等于10的浓度。方法干扰研究在参考文献(12)中有详细描述。

CDC认证流程在CDC网站上“Laboratory Quality Assurance andStandardization Programs”(Laboratory Quality Assurance and StandardizationPrograms.Centers for Disease Control and Prevention.September 2018.https://www.cdc.gov/labstandards/hs_standardization.htm，通过引用并入本文)有详细说明。两种样本制备方法，即单个小瓶和96孔滤板均获得了CDC激素标准化程序的睾酮(HoSt T)测定认证。首先，使用40个HoSt T第1阶段样本和两个NIST 971SRM校准该方法。使用Pearson相关性和百分比偏差计算，将这42个样本的参考浓度与通过我们的方法确定的那些进行比较。一旦该方法通过了±6.4％的CDC可接受偏差标准，我们就参加了HoSt T认证计划的第2阶段，其中每3个月(第一季度到第四季度)将10个盲样运送到我们的实验室进行分析。我们计算的浓度被报告给CDC进行累积偏差和不精确性评估(CDC的偏差估计基于CLSI指南EP9-A2“使用患者样本的方法比较和偏差评估”)。可接受的不精确度为≤5.3％，计算为所有40个样本(每个样本n＝4)的平均％CV。第2阶段程序每四个季度更新一次。此处提供的数据来自第一个认证周期。方法相关性(Pearson)和百分比差异图使用Analyse-it软件包和Excel 2016生成。

使用单个小瓶的样本制备方法，我们比较了从同一个体的血样(匹配样本)中获得的血清和血浆的计算浓度。进行了两项独立的研究。在一项研究中，我们比较了来自21-65岁的成人供体(9名女性和8名男性)的匹配样本。每个供体的血液采集被分入三个不同的管：(i)血清，(ii)血浆肝素锂(LH)和(iii)血浆K2EDTA。在本研究中，我们不仅比较了血清和血浆之间的计算浓度，而且还比较了不同的常用血浆抗凝管之间的计算浓度。在另一项研究中，我们比较了来自20名年龄在7-18岁、不同民族和种族的大概健康的儿童供体(10名女性和10名男性)的匹配血清和血浆LH样本。

图3A描绘了我们的1.8ng/dL(18pg/mL)Amplifex酮睾酮最低校准液的代表性色谱图。根据NIST 971女性样本的重复序列稀释和不同日子的最低校准液水平的S/N比，估计LLOQ为1ng/dL(10pg/mL)。所述LLOQ足以测量来自女性和儿童来源的血清和血浆样本中的睾酮，用于绝大多数临床用途。四个不同日子的每个校准液水平的平均％CV为5.1(最低校准液)至2.8(最高校准液)。这种简单的样本制备过程涉及同时进行的蛋白质沉淀、分析物衍生化和提取(无需干燥和重构样本)，在1至2000ng/dL(10-20000pg/mL)之间呈线性，1/x加权后r2>0.99，如图3B的校准曲线所示。该校准曲线包括六个浓度水平，1.8-1843ng/dL。直线方程为y＝1.04+0.00146(r＝0.9998)。

校准液和质量控制是NIST SRM 971可示踪的。在分析的每一天，添加两个浓度水平的NIST 971，作为来自不同来源的额外质量控制。图4显示了男性和女性NIST 971的代表性叠加色谱图，其中睾酮浓度分别为643.5ng/dL和27.72ng/dL(得自Certificate ofAnalysis of NIST 971的值)。

CDC标准化的HoSt T认证方法过程的第一步是通过对来自HoSt T第1阶段的40个赋值的血清样本的可接受标准，其为±6.4％的偏差。将使用内部教导的方法与CDC参考方法(图5所示的平均差异图)进行相比，测量范围(1.8-1843ng/dL)内的平均偏差为-0.73％，相关系数(Pearson评估)r为0.999(图6)，表明与CDC参考浓度高度相关且一致，这使我们能够进入HoSt T计划的第2阶段。图5示出了使用40个第1阶段HoSt T血清样本的CDC参考方法和根据本教导的过程之间的方法比较。平均差异图的下面的线表示平均偏差。

图6描绘了HoSt T第1阶段参考样本浓度与使用本教导计算的浓度(ng/dL)之间的Pearson相关性。相关系数r＝0.999。这些线定义95％的置信区间。

表2中给出了方法性能结果的总结，包括与CDC方法的比较。使用本教导的测量浓度与CDC参考浓度之间的<3％的平均偏差(％偏差)远低于可接受的±6.4％。此外，符合CDC偏差标准(Certified Total Testosterone Procedures.September 2018.https://www.cdc.gov/labstandards/pdf/hs/CDC_Certified_Testosterone_Procedures-508.pdf.)的样本比例>80％是方法准确度高的另一个指标。以所有样本的平均％CV表示的再现性似乎在单个小瓶和平板法之间具有可比性，分别为3.68％和3.94％。由于睾酮浓度范围低得多，仅女性样本的％CV略高于男性样本，但在两种样本制备方法中均保持在≤5.3％的可接受值内。

图7A和B说明了每种样本制备方法在整个周期年内的单个样本偏差。总体上看，单个样本浓度非常接近参考值，但是对于每一种方法，有四分之一与CDC的参考浓度的偏差高于一年中的其余时间。尤其是图7A和7B描绘了整个周期年CDC参考值和利用本教导确定的平均值之间的百分比差异。图7A显示了利用单个管/小瓶样本制备的分析，图7B显示了96孔滤板自动方法。

表2.第2阶段Host T标准化的第一个周期年之后的方法性能。

CDC不提供血浆样本的平行认证程序。还确定了本教导是否显示出可靠地测量血浆样本中的睾酮以及测试血浆收集管中的抗凝剂之间是否存在差异的能力。由于血浆样本包含纤维蛋白原，因此具有较高的蛋白质含量，血清和血浆中分析物的浓度可能因分析物而异(Clinical Chemistry,Vol.50,pp.1704-1705,Differences between Human Plasmaand Serum Metabolite Profiles.Zhonghao,Y.,et al.7,2011,FLOS One,Vol.6,两者均通过引用并入本文)。作为初步评估，在两个实验中，对37个样本进行了睾酮测定，这些样本来自男女两性和宽年龄段的匹配血清/血浆样本。图8描述了20个7-18岁儿童样本的分析结果，表明内源性血清和血浆浓度之间存在高度相关性。测得的睾酮浓度为1.7-934ng/dL，平均偏差<5％，表明血清和血浆样本的睾酮浓度在临床上没有显著差异。图8中条形图的顶部示出了血浆样本的测量浓度。

同样，对17个匹配的成人血清样本与血浆LH或血浆K2EDTA的分析得出可比的睾酮浓度。对于17个样本中的每一个，血清、血浆LH和血浆K2EDTA之间的％CV为≤8例(n＝3)，总平均值为4％(n＝51，17名供体中每名供体3个匹配样本，各测量一次)。这些结果如图9所示，图9示出了为17个匹配的成人样本计算的睾酮浓度，特别是血清、血浆肝素锂和血浆K2EDTA。在图9的X轴上，样本名称包括性别和年龄信息(例如，F-27源自女性，年龄27岁)。条形图中显示的浓度来自血清计算浓度。

此外，从每个个体供体的三个样本之间的百分偏差来看，血清和血浆之间，或血浆LH和血浆K2EDTA之间的平均值为约1％，范围为0.04％至11.6％。

分析了20份年龄在2-15岁，不同性别和种族(不是血浆匹配的)儿童血清样本。计算出的睾酮浓度范围为0.9-662ng/dL。计算的最低浓度为2岁男性，最高浓度为13岁男性。

我们的目标是开发一种精准的、特异性的、灵敏和稳健的样本制备和LC-MS/MS方法，以测量宽范围样本浓度中的睾酮，包括女性和儿童来源以及各种样本类型。我们首次发表的分析血清睾酮的LC/MS/MS方法(12)旨在实现超高灵敏度(≤0.1ng/dL)，因为它涉及一个单独的衍生化步骤和更大的样本量。本文所述方法的样本制备试图减少时间、提取溶剂、样本体积和成本。我们还消除了对特殊的样本干燥设备的需求。通过使用标记试剂(例如Amplifex^TM酮试剂)衍生化以将带电部分连接到睾酮的碳3上，使得能够提高灵敏度。

然而，与涉及单独衍生化步骤的其他方法不同，在本方法中，包含质量标记试剂的衍生化试剂溶液在一个简单的分析物提取步骤中同时用于蛋白质沉淀。本方法可以很容易地在自动机器人平台上用连接于收集板的96孔滤板进行。两种工作流程，单个小瓶和96孔滤板(PrepStation机器人)均成功地通过了CDC HoSt T程序的认证，准确度得分非常高。这两种方法都适用于在SCIEX Topaz IVD LC-MS/MS系统(4500MD)上在约1-2000ng/dL(10-20000pg/mL)的宽动态范围内定量睾酮样本。因此，所述方法表现出足够的灵敏度和精确度，这对于减少由于结果不明确而重复取样的需要，以及确保不同实验室的测量一致性是需要的。所述方法可用于分析使用LH或K2EDTA作为抗凝剂的血浆样本，但对于血浆样本，需要评估来自各种抗凝剂管的较大数量的匹配的血清/血浆样本(>40，或按照Clinical andLaboratory Standard Institute指南的建议)(CLSI EP9-A2。Measurement ProcedureComparison and Bias Estimation Using Patient Samples,第22.19卷)。此外，有必要确认血清/血浆浓度与96孔滤板工作流程的等效性。

本领域技术人员将知道或能够仅使用常规实验来确定本文描述的实施方案和实践的许多等同情形。因此，将理解本发明不限于本文公开的实施方案，而是应从以下权利要求中理解，这些权利要求都应在法律允许的范围内进行广泛的解释。

本文使用的章节标题仅用于组织目的，不应被解释为限制性的。尽管结合各种实施方案描述了申请人的教导，但并不意图使申请人的教导限于这些实施方案。相反，如本领域技术人员将理解的，申请人的教导包含各种替代、修改和等同物。

Claims

1.一种分析样本中总睾酮的方法，包括以下步骤：

通过组合以下各项创建样本溶液：

与睾酮反应的标记试剂，

从溶液中沉淀蛋白质的水性沉淀剂，

含有已知浓度的同位素富集睾酮的内标溶液，和

含有或怀疑含有样本睾酮的样本，

混合所述样本溶液以沉淀蛋白质并使存在的任何睾酮与标记试剂反应，形成沉淀物和反应的液体溶液的混合物，

将沉淀物与反应的液体溶液分离，

使用串联质谱法分析反应的液体溶液以鉴定和/或定量样本睾酮。

2.权利要求1所述的方法，其中在使用串联质谱分析之前，所述方法还包括：

将反应的液体溶液引入液相色谱柱以分离反应的液体溶液中的化合物，和

将经分离的反应的液体溶液洗脱至串联质谱仪进行分析。

3.权利要求1所述的方法，其中所述标记试剂包括下式化合物：

4.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述水性沉淀剂包含硫酸锌。

5.前述权利要求中任一项所述的方法，其中分离所述沉淀物包括通过包含在滤板中的过滤介质过滤所述混合物并且在收集板中收集作为滤液的所述反应的液体溶液。

6.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述分析包括测量403.3/164.2或403.3/152.2的MRM跃迁。

7.权利要求中任一项所述的方法，其中所述分析包括测量406.3/167.2或406.3/155.2的MRM跃迁，并且其中所述同位素富集的睾酮包含2,3,4 ¹³C₃-睾酮。

8.一种分析样本中总睾酮的方法，包括以下步骤：

a)将下式化合物：

含有硫酸锌的水溶液和含有2,3,4,-¹³C₃-睾酮的溶液组合于微量离心瓶中，

b)向微量离心瓶中添加含有或怀疑含有睾酮的血清或血浆样本，

c)混合微量离心瓶，

d)离心微量离心瓶，

e)将微量离心瓶中的上清液与任何沉淀物分离，

f)使用串联质谱法分析上清液中的睾酮。

9.权利要求8所述的方法，其中所述分析包括测量403.3/164.2或403.3/152.2的MRM跃迁。

10.权利要求8或权利要求9所述的方法，其中所述分析包括测量406.3/167.2或406.3/155.2的MRM跃迁。

11.一种分析样本中总睾酮的方法，包括以下步骤：

a)将下式化合物：

含有硫酸锌的水溶液和含有2,3,4,-¹³C₃-睾酮的溶液组合于滤板的孔中，

b)向孔中添加校准液、对照或含有或怀疑含有睾酮的患者样本，

c)摇动滤板引起混合，

d)通过使用离心将滤板孔中的内容物过滤到收集板中，在收集板中形成滤液，

e)使用串联质谱法分析滤液中的睾酮。

12.权利要求11所述的方法，其中所述分析包括测量403.3/164.2或403.3/152.2的MRM跃迁。

13.权利要求11或12所述的方法，其中所述分析包括测量406.3/167.2或406.3/155.2的MRM跃迁。

14.权利要求11、12或13所述的方法，其中在分析之前，所述方法还包括：

将经分离的反应的液体溶液洗脱至串联质谱仪进行分析。

15.试剂盒，包括：

包含下式化合物的标记试剂：

以及至少以下之一：

沉淀溶液的水溶液，和，

同位素富集的睾酮。

16.权利要求15所述的试剂盒，其中所述沉淀溶液包含硫酸锌。

17.权利要求15至16中任一项所述的试剂盒，其中试剂盒包括标记试剂、沉淀溶液的水溶液和同位素富集的睾酮。

18.权利要求15至17中任一项所述的试剂盒，还包括小瓶或含有孔的板。