CN107064400A - 同时检测血清中五种类固醇激素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种同时检测血清中五种类固醇激素的方法，所述五种类固醇激素分别为：睾酮、雄烯二酮、11‑脱氧皮质醇、皮质醇和可的松；检测方法包括如下步骤：样品前处理：在血清样品中加入内标物的乙腈溶液进行蛋白沉淀，再加入叔丁基甲醚进行萃取，上清液吹干，加入复溶液，取上清液得待测样品；富集、分离和检测：对所述待测样品采用二维液相色谱串联四级杆质谱联用仪进行富集、分离和检测。上述检测方法采用一种方法同时检测血清中五种浓度范围不一致的化合物，同时检测五种化合物的时间约为8.5～12.0min。上述检测方法成本低，通量高灵敏度高、精密度高、特异性强。
Description
技术领域
本发明涉及分析检测技术领域，特别是涉及一种同时检测血清中五种类固醇激素的方法。
背景技术
睾酮是一种类固醇荷尔蒙，由男性的睾丸或女性的卵巢分泌，肾上腺亦分泌少量，但绝经后妇女，卵巢分泌睾酮显著减少。睾酮分子量为288.42g/moL，结构式如下。大多数睾酮与性激素结合球蛋白(SHBG)结合，少数与白蛋白结合，一小部分以游离形式存在，所有非SHBG结合的睾酮被认为是生物可利用的。在儿童期，过多睾酮会诱发男孩性早熟和女孩的男性化。在成年女性中，过量的睾酮会造成不同程度的男性化，包括多毛，痤疮，月经稀发，或不育。睾酮轻度至中度升高对男性通常无明显症状，但对女性造成严重的影响。对于睾酮轻度至中度升高的确切原因往往不清楚。明显升高的常见原因包括遗传疾病(如先天性肾上腺皮质增生症)，肾上腺，睾丸和卵巢的肿瘤和运动员滥用睾丸激素或促性腺激素等。女性的睾酮降低会引起微妙的症状。这主要包括性欲下降和非特异性的情绪变化。在男性，它会导致性腺功能减退。这个特点将改变男性的第二性征和生育功能。
雄烯二酮主要通过肾上腺分泌，其产量一定程度上由促肾上腺皮质激素(ACTH)调节，此外还由睾丸和卵巢通过将脱氢表雄酮硫酸盐(DHEA-S)转化而来。雄烯二酮分子量为286.41 g/moL，结构式如下。雄烯二酮为一种重要的性类固醇激素前提物。它主要通过两种生物合成途径生成：来自孕酮或脱氢表雄酮(DHEA)等衍生生成。过高的雄烯二酮水平可能会引起女性雄激素过多症的症状。男性通常无症状，但是通过外围的雄性激素转化为雌激素可能偶然使其经历雌激素过多的轻度症状，例如男性女性型乳房。大多数温和的雄烯二酮水平增高是正常的，但是，显著的增高可能表明肾上腺和性腺肿瘤。
雄烯二酮主要用于评估肾上腺，卵巢或睾丸功能，如激素的产生影响男性生殖器官和生理特征(雄性激素)。结合实验室其他检测项目，最通常用于诊断引起高水平睾酮激素女性过量雄性激素症状的原因。
11-脱氧皮质醇(化合物S)是胆固醇转化为皮质醇的中间产物，皮质醇分子量为346.46g/moL，结构式如下。11-脱氧皮质醇主要用于诊断11-beta-羟化酶缺乏症和原发性(肾上腺衰竭)或者继发性(肾上腺轴ACTH缺乏)肾上腺机能不足。
可的松分子量为360.44g/moL，结构式如下。当患者患有库欣综合征时，皮质醇和可的松水平同时增高，当服用外源性糖皮质激素药物如强的松时，皮质醇和可的松水平会下降。对于显著的盐皮质激素过剩患者(AME)可的松的形成减少，并使皮质醇行使盐皮质激素功能。因此一般显著的盐皮质激素过剩患者(AME)常伴随着可的松和醛固酮水平较低，而皮质醇水平正常。由于甘草汁可抑制皮质醇转化为可的松，因此会减少可的松的血液循环水平。
皮质醇是由肾上腺产生的一种激素。位于颅底蝶鞍的垂体生成ACTH(促肾上腺皮质激素)，后者刺激肾上腺合成分泌皮质醇。皮质醇分子量为362.46g/moL，结构式如下。皮质醇在机体中扮演大量角色：皮质醇参与蛋白质、糖和脂质分解，维持血压，调节免疫系统。冷热、感染、创伤、精神、运动、肥胖和糖尿病可以影响皮质醇浓度。皮质醇的分泌具有时间周期性，早晨分泌增多，在早晨8点达到高峰；傍晚则降低。这种模式可被称为：“昼夜变异”或“昼夜节律”，如果人体工作时间不固定(例如夜班)以及每天睡眠时间不固定时，上述节律会发生改变。皮质醇不足可引发非特异性症状：体重减轻、肌肉无力、疲劳、血压过低和腹痛。有时皮质醇降低合并压力有可能导致肾上腺危象，后者需要立即就医。皮质醇含量过高会导致高血压、血糖过高、肥胖、皮肤脆弱、腹部紫纹、肌肉无力和骨质疏松。
目前国内普遍采用免疫法分别检测不同的类固醇激素：如睾酮、4-雄烯二酮、11-脱氧皮质醇、可的松和氢化可的松等，但是免疫法普遍存在交叉反应性强，特异性差，灵敏度低，准确度低等问题，而LC-MS/MS法是目前被广泛接受的小分子定量检测的金标准方法，它的优势在于灵敏度高，检测限低，选择性好及准确度和特异性高，它能够区别结构相似的化合物。但是由于人体内这五种激素的浓度范围宽，部分浓度高，部分浓度低尤其是女性及儿童的睾酮浓度，且这些类固醇激素主要以蛋白结合的形式存在，且人体血液组成复杂存在大量的高亲和力结合蛋白，因此采样质谱法检测但仍然需要解决以下问题：1)严重的基质干扰，特异性差，灵敏度低；2)提高检测效率，用同一种方法同时检测这五种类固醇激素；3)不同化合物浓度相差较大或者同一化合物不同人群浓度相差大，要求线性范围宽。
为了降低基质干扰，提高特异性、灵敏度等，目前常采用方法有：
方法一：离线-样本先经蛋白沉淀，再经过液液萃取或者液固萃取后进行氮吹浓缩得到待测样本，样本经高效液相色谱、液相色谱串联质谱等进行检测；
方法二：在线-样本先经蛋白沉淀后经过在线萃取装置得到待测物，再经高效液相色谱、液相色谱串联质谱等进行检测。
但是这两种方法存在如下的问题：方法一前处理复杂、处理时间长(一个样本约2小时)、通量低、试剂成本高、对操作人员要求高；方法二仪器投入大，且在线萃取的耗材成本高。
发明内容
基于此，本发明的目的是提供一种同时检测血清中五种类固醇激素的方法。
具体的技术方案如下：
一种同时检测血清中五种类固醇激素的方法，包括如下步骤：
所述五种类固醇激素分别为：睾酮、雄烯二酮、11-脱氧皮质醇、皮质醇和可的松；
样品前处理：在血清样品中加入含有睾酮内标物、雄烯二酮内标物、11-脱氧皮质醇内标物、皮质醇内标物和可的松内标物的乙腈溶液进行蛋白沉淀，再加入叔丁基甲醚进行萃取，震荡，离心取上清液于氮吹仪中，吹干，加入复溶液，震荡离心取上清液得待测样品；
富集、分离和检测：对所述待测样品采用二维液相色谱串联四级杆质谱联用仪进行富集、分离和检测。
在其中一些实施例中，所述富集、分离和检测的步骤包括：
先用流动相1洗脱富集柱中的所述待测样品，对所述待测样品进行富集、纯化；
将富集柱与分析柱连通，用流动相2将待测物依次从富集柱洗脱至分析柱，用流动相2 将待测物从分析柱洗脱、分离；
断开富集柱与分析柱，用流动相2将待测物从分析柱洗脱、分离至四级杆质谱进行检测；
其中，富集柱为C6柱，分析柱为C18柱；
流动相1：A相为去离子水，B相为甲醇，流速为1.0-2.0ml/min；
流动相2：C相为15mM/L醋酸铵水溶液，D相为含0.1wt％甲酸的甲醇溶液，流速为0.2-1.0ml/min。
在其中一些实施例中，流动相采用梯度洗脱模式：
0min时，流动相1中A相与B相的体积比为100:0，流动相2中C相与D相的体积比为90:10，用流动相1洗脱富集柱中的待测样品，对待测样品进行富集、纯化；
0.15min时，将富集柱与分析柱连通，用流动相2将待测物依次从富集柱洗脱至分析柱；
3.0min时，流动相2中C相与D相的体积比为55:45；
4.0min时，流动相2中C相与D相的体积比为35:65；
5.0min时，断开富集柱与分析柱，用流动相2将待测物从分析柱洗脱、分离至四级杆质谱进行检测，流动相2中C相与D相的体积比为25:75；用流动相1将富集柱中的残留杂质洗脱至废液瓶中；
5.5min时，流动相2中C相与D相的体积比为5:95；
8.0min时，流动相2中C相与D相的体积比为90:10；
整个梯度时间为8.5～12.0min。
在其中一些实施例中，所述流动相1的流速为1.0-1.2ml/min，所述流动相2的流速为 0.4-0.6ml/min。
在其中一些实施例中，所述睾酮内标物为睾酮的C13标记物或氘代标记物，所述雄烯二酮内标物为雄烯二酮的C13标记物或氘代标记物，所述11-脱氧皮质醇内标物为11-脱氧皮质醇的C13标记物或氘代标记物，所述皮质醇内标物为皮质醇的C13标记物或氘代标记物，所述可的松内标物为可的松的C13标记物或氘代标记物。
在其中一些实施例中，所述四级杆质谱条件为：正离子模式，扫描方式为多反应监测离子扫描MRM；
所述正离子模式中，目标定量离子对包括：睾酮离子对、雄烯二酮离子对、11-脱氧皮质醇离子对、皮质醇离子对和可的松定量离子对；和/或，睾酮内标物的定量离子对、雄烯二酮内标物的定量离子对、11-脱氧皮质醇内标物的定量离子对、皮质醇内标物的定量离子对和可的松内标物的定量离子对；
目标定量离子的多反应监测离子扫描MRM的质/荷比条件包括：
睾酮的母离子的质/荷比为289.0～289.5，对应的子离子的质/荷比为108.9～109.3， 96.8～97.2；
雄烯二酮的母离子的质/荷比为287.0～287.8，对应的子离子的质/荷比为96.8～97.2， 108.9～109.3；
11-脱氧皮质醇母离子的质/荷比为346.9～347.3，对应的子离子的质/荷比为96.8～97.2， 108.9～109.3；
皮质醇母离子的质/荷比为362.8～363.3，对应的子离子的质/荷比为96.8～97.2， 120.9～121.3；
可的松母离子的质/荷比为360.9～361.3，对应的子离子的质/荷比为162.8～163.2， 342.8～343.2；
13C3-睾酮母离子的质/荷比为289.9～292.3，对应的子离子的质/荷比为111.9～112.2；
13C3-雄烯二酮母离子的质/荷比为290.0～290.5，对应的子离子的质/荷比为99.8～100.2；
D5-11-脱氧皮质醇母离子的质/荷比为351.9～352.3，对应的子离子的质/荷比为113.9～114.3；
d4-皮质醇母离子的质/荷比为366.8～367.3，对应的子离子的质/荷比为120.9～121.3。
在其中一些实施例中，所述四级杆质谱条件还包括以下离子源参数：
电离源为电喷雾电离ESI源，气帘气压力为39～43psi，加热气压力为46～53psi，辅助加热气压力为55～62psi，加热气温度为500～600℃，碰撞气为氮气，碰撞气压力为5.5～7.0psi，电喷雾针电压为5000～6000V。
在其中一些实施例中，所述四级杆质谱条件还包括：
睾酮定量离子对的去簇电压为95～105V，入口电压为8～12V，碰撞电压为30～40V，出口电压为10～14V；
雄烯二酮的定量离子对的去簇电压为95～105V，入口电压8～12V，碰撞电压为30～40V，出口电压为10～14V；
11-脱氧皮质醇定量离子对的去簇电压为95～105V，入口电压4～8V，碰撞电压为45～55V，出口电压为20～30V；
皮质醇定量离子对的去簇电压为105～115V，入口电压6～10V，碰撞电压为30～40V，出口电压为8～12V；
可的松定量离子对的去簇电压为125～135V，入口电压8～15V，碰撞电压为40～50V，出口电压为9～15V；
睾酮-13C定量离子对的去簇电压为115～130V，入口电压4～8V，碰撞电压为30～40V，出口电压为9～15V；
雄烯二酮-13C定量离子对的去簇电压为110～120V，入口电压8～12V，碰撞电压为30～40V，出口电压为9～15V；
11脱氧皮质醇-D5定量离子对的去簇电压为115～125V，入口电压4～8V，碰撞电压为 45～55V，出口电压为9～15V；
皮质醇-D4定量离子对的去簇电压为105～120V，入口电压4～8V，碰撞电压为30～40V，出口电压为9～15V。
在其中一些实施例中，所述血清样品与所述乙腈溶液的体积比为1：1～4；所述叔丁基甲醚与所述血清样品的体积比为1：2～8倍；所述叔丁基甲醚与上清液的体积比为1：1～2。
在其中一些实施例中，所述样品前处理中离心的条件为：温度0～5℃，转速 11000～13000r/min，时间4～8min。
上述血清中五种类固醇激素的检测方法具有以下优点和有益效果：
(1)上述检测方法采用一种方法同时检测血清中五种浓度范围不一致的化合物，同时检测五种化合物的时间约为8.5～12.0min。其他分别检测的方法，一个化合物的检测时间至少 7min，即五个化合物至少用时35min。对比于化合物分别检测的方法，上述检测方法大大缩短了检测时间，提高了样本的检测通量。
(2)上述检测方法在仪器投入方面比普通的液相色谱串联四级杆质谱仪仅增加了一个富集柱和一组泵，就可以大大提高了待测化合物的浓缩纯化效率提高检测灵敏度，并且采用的富集柱简单、成本低且可重复使用数千次以上。相对于在线固相萃取，本方法的耗材成本至少降低10倍。即本发明的检测方法成本低。
(3)上述检测方法通过对前处理的参数以及富集、分离和检测的各参数(比如富集柱的选择、流动相的选择、流速等条件)进行了大量实验研究进行优化，使最后得到的检测方法可以有效去除基质干扰，特异性、抗基质干扰能力强。定量限低，灵敏度高，精密度RSD小于10％，可以准确的定性或定量检测出血清中极低浓度的睾酮、雄烯二酮、11-脱氧皮质醇、皮质醇和可的松的含量。即与常用的检测相比，本发明的检测方法检测灵敏度高、精密度高、特异性强。
附图说明
图1为实施例1人血清样品中睾酮、雄烯二酮、11-脱氧皮质醇、皮质醇和可的松及其内标物的TIC图，顺序依次为总混合物、皮质醇、可的松、11-脱氧皮质醇、睾酮、雄烯二酮；
图2为睾酮的标准曲线图；
图3为雄烯二酮的标准曲线图；
图4为11-脱氧皮质醇的标准曲线图；
图5为皮质醇的标准曲线图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
实施例1
本实施例的五种类固醇激素的检测方法，包括以下步骤：
一、样品前处理
取200μL样本(标准曲线点与质控同步处理)于2.0离心管中，加入400μL内标工作液 (13C3-睾酮4mg/L、d4-皮质醇4mg/L、D5-11-脱氧皮质醇16mg/L)和13C3-雄烯二酮储备液8mg/L的乙腈溶液)，高速震荡混匀3min；加入800uL叔丁基甲醚，高速震荡混匀3min；于 4℃，14000r离心10min；取上清液1mL于1.5mL离心管中，40℃氮气吹干；取100uL复溶液复溶，高速震荡3min；于4℃，10000r离心5min；转移80μL离心后的样本于进样瓶中，上机检测。
二、富集、分离和检测
自动进样器自动将50ul待测样品加载到二维液相色谱系统中，对所述待测样品采用二维液相色谱串联四级杆质谱仪(LC-MS/MS)进行富集、分离与检测。
其中，富集柱为C6-Phenyl(4×2.0mm)；分析柱为C18(50×2.0mm,3μm)；柱温为40℃。
该系统配置了两套泵，两套泵通过一个六通阀实现切换(也可以通过两个六通阀或者其它的方式进行切换)，六通阀3号位连接FLOW1(流动相1)，1号和4号位连接富集柱，5号位连接FLOW2(流动相2)，6号位连接分析柱，2号位连接废液瓶。
FLOW1流动相1：A相为去离子水、B相为甲醇，流速为1.0mL/min；
FLOW2流动相2：C相为含15mM/L醋酸铵水溶液、D相为含0.1％甲酸的甲醇溶液，流速0.45mL/min。
六通阀的起始模式为0，即富集柱与分析柱处于未连通状态，待测样品经进样器进入富集柱进行富集、纯化，此过程中富集柱用FLOW1流动相进行洗脱；0.15min切换六通阀为1，即富集柱与分析柱连通，将待测样品洗脱至分析柱，此过程中富集柱与分析柱中的洗脱流动相均为FLOW2流动相；5.0min六通阀切回起始模式0，断开富集柱与分析柱，待测物在分析柱中经梯度洗脱(流动相为FLOW2流动相)至分离后进入质谱进行检测，富集柱中的残留杂质经梯度洗脱(流动相为FLOW1流动相)至废液瓶中。流动相的梯度洗脱如表1所示。
表1流动相的洗脱梯度
上述梯度下，可的松的保留时间为：5.22min；皮质醇的保留时间为：5.38min；11-脱氧皮质醇的保留时间为：5.78min；4-雄烯二酮的保留时间为:6.04min；睾酮的保留时间为： 6.16min。
本实施例LC-MS/MS采用具有电喷雾电离源(ESI)的Applied BiochemistryAPI4500plus 串联质谱分析仪作为检测器进行分析。其中，气帘气压力为40.0psi；加热气压力为40psi；辅助加热气压力为60psi；加热气温度为550℃；碰撞气为高纯氮气，压力为6psi；电喷雾针电压为5500V。
其它质谱条件：采用正离子模式，扫描方式采用多反应监测离子扫描MRM，其条件参见表2。
表2多反应监测离子扫描MRM条件
待测物随流动相流出分析柱后，在压力的作用下进入质谱仪离子源，由六通阀控制进入离子源的样品通道，和进入切换时间。在离子源内液体样品被汽化并且电离为带电分子，带电分子在电压和真空作用下，进入Q1、Q2和Q3，其中，Q1和Q3为质量过滤器，只允许根据上述五种类固醇激素及其内标物的质荷比选择的母离子和子离子通过，Q2为碰撞单元，母离子在此处与惰性气体原子碰撞，产生特定的碎片离子。质谱仪的第一个四极(Q1)选择具有待测物及其内标物的特定质荷比m/z的母离子，具有这些m/z比的母离子被允许进入Q2， Q2产生的碎片离子进入到Q3，其中待测物及其内标物的碎片离子(子离子)被选择通过，而其它离子被除去。参见表3，示出了被用于鉴别和定量的待测物的离子对的质荷比m/z。
表3待测物的质量转变表
随着离子与检测器碰撞，它们将捕获到的离子数转化成数字信号的电子脉冲。所获得的数据被传递到计算机，其将所收集的离子数对时间作图，即得总离子流图(TIC图)(如图1 所示)。
三、定性判断和定量计算
(1)依据待测物、内标物的相对保留时间和检测的定量离子对的丰度比判断待测物的存在。
在相同试验条件下，检测样品中被测目标物质的质量色谱峰保留时间与标准溶液中对应物质的质量色谱峰保留时间一致；检测样品的色谱图中所选择的检测离子对的相对丰度比与相当浓度标准溶液的离子对相对丰度比的偏差(即表4中的最大允许误差)不超过表4规定的范围，则可以判断样品中存在对应的目标物质。
表4定性判断相对丰度的最大允许误差
| 相对丰度(K) | K≥50％ | 20％≤K≤50％ | 10％≤K≤20％ | K≤10％ |
| 最大允许误差 | ±20％ | ±25％ | ±30％ | ±50％ |
(2)采用内标标准曲线法定量，以待测物与内标物的峰面积比值计算样品中的待测物的含量。
配置系列浓度的含有待测物的血清标准样品，用本实施例的上述方法进行样品前处理以及分离检测，以血清标准样品中待测物和内标物的峰面积的比值构建内标标准曲线，睾酮的标准曲线见图2，曲线的方程Y＝0.000122X+0.00188，R＝0.9998；雄烯二酮的标准曲线见图3，曲线的方程为Y＝2.98e-005X+0.00267,R＝0.9992；11-脱氧皮质醇的标准曲线见图4，曲线的方程为Y＝0.00068X+0.0105,R＝0.9997；皮质醇的标准曲线见图5，曲线的方程为 Y＝0.000957X+0.00105,R＝0.9997；可的松的标准曲线的方程为Y＝0.0428X+0.00172,R＝0.9993 然后利用该标准曲线计算待测样品或质量控制物中的待测物的浓度。
本实施例测得睾酮的峰面积为3.10e+005，其内标物的峰面积为6.10e+006，计算得到本实施例的人血清样品中睾酮的浓度为403ng/L；雄烯二酮的峰面积为6.65e+005，其内标物的峰面积为1.96e+007，计算得到雄烯二酮的浓度为1050ng/L；11-脱氧皮质醇的峰面积为 5.23e+004，其内标物的峰面积为3.27e+005，计算得到11-脱氧皮质醇的浓度为220ng/L；皮质醇的峰面积为3.44e+005，其内标物的峰面积为8.63e+006，计算得到皮质醇的浓度为 4.06ug/L；可的松的峰面积为3.28e+004，其内标物的峰面积为8.63e+006，计算得到可的松的浓度为3.79ug/L。
实施例2方法学验证实验
本实施例对实施例1中的五种类固醇激素的检测方法进行方法学验证实验。
1、精密度(Precision)实验
1.1批内精密度(Intra-assay)：取实际血清样本分别加标至低、中、高三水平，得到的样本进行批内精密度实验；每个浓度水平的样本平行处理20个，每个进样1次；计算检测结果的平均值及相对标准偏差(RSD)。
1.2批间精密度(Inter-assay)：取预先配制好的低、中、高三水平的质控品，进行批间精密度实验；每个水平的样本分别做4个平行，即检测得4组数据，连续测定5天；计算检测结果的平均值及相对标准偏差(RSD)。
睾酮、雄烯二酮、11-脱氧皮质醇、皮质醇、可的松的批内精密度及批间精密度实验数据分别如表5～9所示，经验证，批内精密度范围为1.31％～5.89％，批间精密度范围为1.67％～6.31％。
表5睾酮批内精密度及批间精密度实验数据(单位：ng/L)
表6雄烯二酮批内精密度及批间精密度实验数据(单位：ng/L)
表7 11-脱氧皮质醇批内精密度及批间精密度实验数据(单位：ng/L)
表8皮质醇批内精密度及批间精密度实验数据(单位：ug/L)
表9可的松批内精密度及批间精密度实验数据(单位：ug/L)
2、分析灵敏度和线性范围(Analytical Sensitivity and Analytical M--easurement Range and Linearity Study)
2.1方法定量限与线性范围(Limit of Quantitation and Linearity)
a.配制空白基质；
b.配置标准曲线；
c.每个浓度的样本平行处理6个，分别检测一次；
d.计算各浓度样本的平均值、RSD和回收率；
e.方法定量限的确定标准：RSD小于20％且回收率在85％-115％范围内的最低浓度点视为定量限浓度，即LOQ；
f.线性范围的确定标准：RSD小于20％，回收率在85％-115％范围内，且以理论浓度比率与实际信号响应峰面积比率绘制成的回归曲线R2>0.98，即满足线性范围的要求；
g.验证实验数据如表10～14与图2-图5所示，睾酮的LOQ为2.75ng/L，线性范围为2.75-10000ng/L；雄烯二酮的LOQ为9.7ng/L，线性范围为9.7-25000ng/L；11-脱氧皮质醇的LOQ为2.75ng/L，线性范围为2.75-10000ng/L；皮质醇的LOQ为0.0275ug/L，线性范围为0.0275-100ug/L；可的松的LOQ为0.046ug/L，线性范围为0.046-191ug/L。
表10睾酮定量限实验数据
| 理论浓度(ng/L) | 检测平均值(ng/L) | RSD | 回收率 |
| 0 | 0 | — | — |
| 1.2375 | 2.03 | 25％ | 164.04％ |
| 2.75 | 2.72 | 3.59％ | 99.03％ |
| 5.5 | 5.42 | 4.07％ | 98.52％ |
| 11 | 10.92 | 4.27％ | 99.24％ |
| 22 | 21.37 | 3.01％ | 97.12％ |
| 44.1 | 42.40 | 2.62％ | 96.15％ |
| 88.1 | 84.60 | 4.63％ | 96.03％ |
| 156 | 154.50 | 2.04％ | 99.04％ |
| 313 | 313.83 | 2.36％ | 100.27％ |
| 625 | 632.33 | 1.29％ | 101.17％ |
| 1250 | 1238.33 | 1.19％ | 99.07％ |
| 2500 | 2506.67 | 1.74％ | 100.27％ |
| 5000 | 5030.00 | 1.56％ | 100.60％ |
| 10000 | 9960.00 | 1.91％ | 99.60％ |
表11雄烯二酮定量限实验数据
表12 11-脱氧皮质醇定量限实验数据
| 理论浓度(ng/L) | 检测平均值(ng/L) | RSD | 回收率 |
| 0 | 0 | — | — |
| 1.375 | 1.719 | 20.06％ | 125.1％ |
| 2.75 | 2.77 | 5.77％ | 100.67％ |
| 5.5 | 5.35 | 3.45％ | 97.21％ |
| 11 | 11.05 | 5.45％ | 100.45％ |
| 22 | 21.03 | 5.10％ | 95.61％ |
| 44.1 | 41.17 | 7.09％ | 93.35％ |
| 88.1 | 84.87 | 3.66％ | 96.33％ |
| 156 | 159.00 | 3.98％ | 101.92％ |
| 313 | 325.33 | 3.89％ | 103.94％ |
| 625 | 641.33 | 3.24％ | 102.61％ |
| 1250 | 1278.33 | 2.64％ | 102.27％ |
| 2500 | 2531.67 | 1.53％ | 101.27％ |
| 5000 | 5051.67 | 1.13％ | 101.03％ |
| 10000 | 9870.00 | 2.42％ | 98.70％ |
表13皮质醇定量限实验数据
| 理论浓度(ng/L) | 检测平均值(ng/L) | RSD | 回收率 |
| 0 | 0 | — | — |
| 0.01375 | 0.01445 | 25.03％ | 105.11％ |
| 0.0275 | 0.03 | 6.26％ | 104.12％ |
| 0.055 | 0.06 | 7.96％ | 101.61％ |
| 0.11 | 0.11 | 4.05％ | 103.03％ |
| 0.22 | 0.21 | 2.94％ | 95.68％ |
| 0.441 | 0.42 | 4.41％ | 94.63％ |
| 0.881 | 0.84 | 2.72％ | 95.89％ |
| 1.56 | 1.59 | 1.68％ | 101.71％ |
| 3.13 | 3.23 | 1.30％ | 103.09％ |
| 6.25 | 6.48 | 1.68％ | 103.60％ |
| 12.5 | 12.78 | 1.67％ | 102.27％ |
| 25 | 25.08 | 1.52％ | 100.33％ |
| 50 | 50.28 | 1.51％ | 100.57％ |
| 100 | 99.07 | 2.47％ | 99.07％ |
表14可的松定量限实验数据
2.2方法检出限(Limit of Detection)
a.收集浓度均在定量限LOQ附近的病人血清样本；
b.平行处理此病人样本20个，分别检测1次；
c.计算各浓度样本的平均值、SD和方法检出限(LOD)；
d.实验结果如表15所示，睾酮的LOD为1.595ng/L，雄烯二酮的LOD为2.45ng/L，11-脱氧皮质醇的LOD为1.90ng/L，皮质醇的LOD为0.012ug/L，可的松的LOD为0.0238 ug/L。
表15方法检出限试验数据
2.3结论(Summary of the AMR study)
表16分析灵敏度与线性范围结果汇总
3.方法准确度-回收率(Recovery)
a.收集一批混合血清样本，测得基础浓度，分别加标至高、中、低三水平的样本，进行加标回收率实验；
b.未加标及加标样品，每个平行处理3个，分别进行检测，计算加标样品的回收率结果，回收率在85-115％范围内，认为方法准确；
c.回收率实验结果如表17～21所示。由结果可知，方法的回收率在95.42～105％之间，满足要求。
表17睾酮加标回收率试验结果
表18雄烯二酮加标回收率试验结果
表19 11-脱氧皮质醇加标回收率试验结果
表20皮质醇加标回收率试验结果
表21可的松加标回收率试验结果
由上述的检测结果显示本发明的五种类固醇激素的检测方法检测血清样品或者质控物质结果准确，睾酮的定量限为2.75ng/L，检测限为1.6ng/L，精密度RSD<5％，加标回收率在 90％-110％之间；雄烯二酮的定量限为9.7ng/L，检测限为2.45ng/L，精密度RSD<5％，加标回收率在90％-115％之间；11-脱氧皮质醇的定量限为2.75ng/L，检测限为1.90ng/L，精密度 RSD<5％，加标回收率在87％-110％之间；皮质醇的定量限为0.0275ug/L，检测限为0.0120 ug/L，精密度RSD<5％，加标回收率在85％-115％之间；可的松的定量限为0.046ug/L，检测限为0.0238ug/L，精密度RSD<5％，加标回收率在90％-110％之间，检测时间时间约11.0min，检测效率高。说明本方法准确可靠，精密度高、灵敏度高、检测通量高、成本低。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种同时检测血清中五种类固醇激素的方法，其特征在于，包括如下步骤：
所述五种类固醇激素分别为：睾酮、雄烯二酮、11-脱氧皮质醇、皮质醇和可的松；
样品前处理：在血清样品中加入含有睾酮内标物、雄烯二酮内标物、11-脱氧皮质醇内标物、皮质醇内标物和可的松内标物的乙腈溶液进行蛋白沉淀，再加入叔丁基甲醚进行萃取，震荡，离心取上清液于氮吹仪中，吹干，加入复溶液，震荡离心取上清液得待测样品；
富集、分离和检测：对所述待测样品采用二维液相色谱串联四级杆质谱联用仪进行富集、分离和检测。
2.根据权利要求1所述的同时检测血清中五种类固醇激素的方法，其特征在于，所述富集、分离和检测的步骤包括：
先用流动相1洗脱富集柱中的所述待测样品，对所述待测样品进行富集、纯化；
将富集柱与分析柱连通，用流动相2将待测物依次从富集柱洗脱至分析柱，用流动相2将待测物从分析柱洗脱、分离；
断开富集柱与分析柱，用流动相2将待测物从分析柱洗脱、分离至四级杆质谱进行检测；
其中，富集柱为C6柱，分析柱为C18柱；
流动相1：A相为去离子水，B相为甲醇，流速为1.0-2.0ml/min；
流动相2：C相为15mM/L醋酸铵水溶液，D相为含0.1wt％甲酸的甲醇溶液，流速为0.2-1.0ml/min。
3.根据权利要求2所述的同时检测血清中五种类固醇激素的方法，其特征在于，流动相采用梯度洗脱模式：
0min时，流动相1中A相与B相的体积比为100:0，流动相2中C相与D相的体积比为90:10，用流动相1洗脱富集柱中的待测样品，对待测样品进行富集、纯化；
0.15min时，将富集柱与分析柱连通，用流动相2将待测物依次从富集柱洗脱至分析柱；
3.0min时，流动相2中C相与D相的体积比为55:45；
4.0min时，流动相2中C相与D相的体积比为35:65；
5.0min时，断开富集柱与分析柱，用流动相2将待测物从分析柱洗脱、分离至四级杆质谱进行检测，流动相2中C相与D相的体积比为25:75；用流动相1将富集柱中的残留杂质洗脱至废液瓶中；
5.5min时，流动相2中C相与D相的体积比为5:95；
8.0min时，流动相2中C相与D相的体积比为90:10；
整个梯度时间为8.5～12.0min。
4.权利要求3所述的同时检测血清中五种类固醇激素的方法，其特征在于，所述流动相1的流速为1.0-1.2ml/min，所述流动相2的流速为0.4-0.6ml/min。
5.权利要求1-4任一项所述的同时检测血清中五种类固醇激素的方法，其特征在于，所述睾酮内标物为睾酮的C13标记物或氘代标记物，所述雄烯二酮内标物为雄烯二酮的C13标记物或氘代标记物，所述11-脱氧皮质醇内标物为11-脱氧皮质醇的C13标记物或氘代标记物，所述皮质醇内标物为皮质醇的C13标记物或氘代标记物，所述可的松内标物为可的松的C13标记物或氘代标记物。
6.权利要求5所述的同时检测血清中五种类固醇激素的方法，其特征在于，所述四级杆质谱条件为：正离子模式，扫描方式为多反应监测离子扫描MRM；
所述正离子模式中，目标定量离子对包括：睾酮离子对、雄烯二酮离子对、11-脱氧皮质醇离子对、皮质醇离子对和可的松定量离子对；和/或，睾酮内标物的定量离子对、雄烯二酮内标物的定量离子对、11-脱氧皮质醇内标物的定量离子对、皮质醇内标物的定量离子对和可的松内标物的定量离子对；
目标定量离子的多反应监测离子扫描MRM的质/荷比条件包括：
睾酮的母离子的质/荷比为289.0～289.5，对应的子离子的质/荷比为108.9～109.3，96.8～97.2；
雄烯二酮的母离子的质/荷比为287.0～287.8，对应的子离子的质/荷比为96.8～97.2，108.9～109.3；
11-脱氧皮质醇母离子的质/荷比为346.9～347.3，对应的子离子的质/荷比为96.8～97.2，108.9～109.3；
皮质醇母离子的质/荷比为362.8～363.3，对应的子离子的质/荷比为96.8～97.2，120.9～121.3；
可的松母离子的质/荷比为360.9～361.3，对应的子离子的质/荷比为162.8～163.2，342.8～343.2；
13C3-睾酮母离子的质/荷比为289.9～292.3，对应的子离子的质/荷比为111.9～112.2；
13C3-雄烯二酮母离子的质/荷比为290.0～290.5，对应的子离子的质/荷比为99.8～100.2；
D5-11-脱氧皮质醇母离子的质/荷比为351.9～352.3，对应的子离子的质/荷比为113.9～114.3；
d4-皮质醇母离子的质/荷比为366.8～367.3，对应的子离子的质/荷比为120.9～121.3。
7.根据权利要求6所述的同时检测血清中五种类固醇激素的方法，其特征在于，所述四级杆质谱条件还包括以下离子源参数：
电离源为电喷雾电离ESI源，气帘气压力为39～43psi，加热气压力为46～53psi，辅助加热气压力为55～62psi，加热气温度为500～600℃，碰撞气为氮气，碰撞气压力为5.5～7.0psi，电喷雾针电压为5000～6000V。
8.根据权利要求6所述的同时检测血清中五种类固醇激素的方法，其特征在于，所述四级杆质谱条件还包括：
睾酮定量离子对的去簇电压为95～105V，入口电压为8～12V，碰撞电压为30～40V，出口电压为10～14V；
雄烯二酮的定量离子对的去簇电压为95～105V，入口电压8～12V，碰撞电压为30～40V，出口电压为10～14V；
11-脱氧皮质醇定量离子对的去簇电压为95～105V，入口电压4～8V，碰撞电压为45～55V，出口电压为20～30V；
皮质醇定量离子对的去簇电压为105～115V，入口电压6～10V，碰撞电压为30～40V，出口电压为8～12V；
可的松定量离子对的去簇电压为125～135V，入口电压8～15V，碰撞电压为40～50V，出口电压为9～15V；
睾酮-13C定量离子对的去簇电压为115～130V，入口电压4～8V，碰撞电压为30～40V，出口电压为9～15V；
雄烯二酮-13C定量离子对的去簇电压为110～120V，入口电压8～12V，碰撞电压为30～40V，出口电压为9～15V；
11脱氧皮质醇-D5定量离子对的去簇电压为115～125V，入口电压4～8V，碰撞电压为45～55V，出口电压为9～15V；
皮质醇-D4定量离子对的去簇电压为105～120V，入口电压4～8V，碰撞电压为30～40V，出口电压为9～15V。
9.根据权利要求1-4任一项所述的同时检测血清中五种类固醇激素的方法，其特征在于，所述血清样品与所述乙腈溶液的体积比为1：1～4；所述叔丁基甲醚与所述血清样品的体积比为1：2～8倍。
10.根据权利要求1-4任一项所述的同时检测血清中五种类固醇激素的方法，其特征在于，所述样品前处理中离心的条件为：温度0～5℃，转速11000～13000r/min，时间4～8min。
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