CN108693280A - 通过uplc-ms/ms定量测定生物样品中德谷胰岛素含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种通过UPLC‑MS/MS定量测定生物样品中德谷胰岛素含量的方法，该方法利用结合串联质谱技术的纯化方法来检测并量化生物样品中的德谷胰岛素的质谱方法，包括使所述样品经受固相萃取(SPE)和超高效液相色谱法(UPLC)以得到富含源自样品的德谷胰岛素的级分；(b)在适合生成可通过质谱法检测的一种或多种胰岛素离子的条件下使所述富集的德谷胰岛素经受电离源；(c)通过串联质谱法测定一种或多种德谷胰岛素离子的量，其中所述样品在电离之前未经受免疫纯化。相对于现有检测技术的ELISA法，本发明整个检测过程耗时短、相对成本低、特异性好，发生假阳性与假阴性概率极低，同时节省劳动量，更适合临床应用。

Description

通过UPLC-MS/MS定量测定生物样品中德谷胰岛素含量的方法

技术领域

本发明涉及德谷胰岛素的定量测量。在具体方面，本发明涉及通过UPLC-MS/MS定量测定生物样品中德谷胰岛素含量的方法。

背景技术

德谷胰岛素是通过改变人胰岛素分子的一个氨基酸，即去掉其B链第30位氨基酸，再通过1个谷氨酸连接子，将1个16碳脂肪二酸的侧链连接到B29位上。德谷胰岛素的分子量为约6103.97Da。A链有21个氨基酸而B链有29个氨基酸。德谷胰岛素具有超长效作用时间，不仅可以有效降低血糖，同时降低了低血糖发生率。德谷胰岛素在每日一次给药的前提下能提供更灵活的注射时间选择，解决现有基础胰岛素需要在每日固定时间内注射的困扰，为广大中国患者提供更优质治疗方案。常常采用德谷胰岛素治疗2型糖尿病。糖尿病及其并发症代表主要公共健康问题。因此，糖尿病和糖尿病前期患者样品中德谷胰岛素的定量作为诊断工具和检测患者治疗均很重要。目前生物样品中德谷胰岛素的定量测定主要通过酶联免疫吸附测定Enzyme Linked Immunosorbent Assay(简写ELISA)，该方法将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原抗体结合专一性进行免疫反应的定性和定量检测。该方法在进行抗原与抗体进行特异性结合，以及在进行二抗结合时需要长时间的孵育，整个检测时间耗时较长；而检测需要的特异性单抗或多抗需通过购买或专门制备，使得检测的时间成本与经济成本提高。再者，由于单抗或多抗本身的性质和固相检测等特点，检测结果容易出现假阳性和假阴性。在进行大量样本检测时，由于整个检测过程较长，检测人员的工作负荷也会大大的增加。

发明内容

为了解决现有技术中的问题，本发明的目的在于提供一种通过UPLC-MS/MS定量测定生物样品中德谷胰岛素含量的方法。

本发明的目的是这样实现的：

在一个方面，所述方法利用串联质谱法。在一些串联质谱法实施方案中，所述方法用于测定取自人、兔、犬、鼠、猴时的生物样品中德谷胰岛素的量。在一些实施方案中，所述方法包括：(a)使样品经受固相萃取(SPE)和超高效液相色谱法(UPLC)以由样品获得富含德谷胰岛素的成分；(b)在适合生成可通过质谱法检测的一种或多种德谷胰岛素离子的条件下使富集的德谷胰岛素经受电离源；(c)通过串联质谱法测定一种或多种德谷胰岛素离子的量，其中所述样品在电离之前未经受免疫纯化。在这些实施方案中，使用步骤(c)中测定的所述一种或多种离子的量测定样品中德谷胰岛素的量。

在一些实施方案中，在正离子模式下电离之前使所述样品经受酸性条件。在一些相关实施方案中，使所述样品经受酸性条件包括使富集的德谷胰岛素经受甲酸。在一些相关实施方案中，步骤(c)中测定的一种或多种离子包括选自质荷比(m/z)为1527.27±0.5、1222.06±0.5、1018.57±0.5的离子的德谷胰岛素前体离子。在另外的相关实施方案中，步骤(c)中测定的一种或多种离子包括选自m/z为641.24±0.5和641.32±0.5的离子的一种或多种碎片离子。在其它相关实施方案中，一种或多种碎片离子包括来自m/z为1527.27±0.5的德谷胰岛素前体离子的一种或多种碎片离子，一种或多种碎片离子包括来自m/z为1222.06±0.5的德谷胰岛素前体离子的一种或多种碎片离子和来自m/z为1018.57±0.5的德谷胰岛素前体离子的一种或多种碎片离子。在相关实施方案中，来自每种前体离子的一种或多种碎片离子包括选自m/z为641.24±0.5和641.32±0.5的离子的一种或多种碎片离子。

在利用UPLC-MS/MS测定样品中德谷胰岛素的量的一些实施方案中，所述方法包括：(1)通过萃取技术使样品中的德谷胰岛素富集；(2)使来自步骤(1)的纯化德谷胰岛素经受超高效液相色谱法(UPLC)以从样品获得富含德谷胰岛素的成分；(3)在适合生成可通过质谱法检测的德谷胰岛素前体离子的条件下使富集的德谷胰岛素经受电离源，其中德谷胰岛素前体离子的m/z为1222.06±0.5；(4)在约12-44eV范围内的碰撞能下使德谷胰岛素前体离子经受碰撞诱导解离以生成可通过质谱法检测的一种或多种碎片离子；以及(5)通过质谱法测定一种或多种所述碎片离子的量。在这些实施方案中，步骤(5)中测定的离子的量与所述样品中德谷胰岛素的量有关。在一些实施方案中，萃取技术为固相萃取(SPE)。

在一些实施方案中，在正离子模式下电离之前使所述样品经受酸性条件。在一些相关实施方案中，使所述样品经受酸性条件包括使样品经受甲酸。

在一些实施方案中，电离源是电喷雾电离(ESI)源，例如加热ESI源。

在一些实施方案中，串联质谱法包括以在12-44V范围内且包括12V和44V的碰撞能破碎前体离子。

在本文所述任何方法中，样品可包括生物样品。在一些实施方案中，生物样品可包括生物流体，例如尿、血浆或血清。在一些实施方案中，生物样品可包括来自人、猴、犬、兔、鼠的样品。可分析人类样品以诊断或监测疾病状态或病状，或监测疾病状态或病状治疗的疗效。在一些相关实施方案中，本文所述方法可用于测定取自人类时的生物样品中德谷胰岛素的量。

在本文所述任何方法中，可在电离之前通过超高效液相色谱法(UPLC)从样品中纯化目标分析物(德谷胰岛素)。在本文所述任何方法中，可通过萃取技术，例如使样品经由固相萃取(SPE)柱，从样品中纯化目标分析物。在一些实施方案中，萃取技术不是免疫纯化技术。具体地，在一些实施方案中，SPE柱不是免疫亲和柱。在一些实施方案中，在所述方法的任何时候都不适用免疫纯化。

在本文提出的任何方法中，样品可包括生物样品；优选体液样品，包括(例如)血浆或血清。

在本文提出的任何方法中，可在样品中提供可单独检测的内标，也测定了样品中内标的量。在利用可单独检测的内标的实施方案中，电离样品中存在的全部或部分目标分析物和内标以生成在质谱仪中可检测的多种离子，并通过质谱法检测各自生成的一种或多种离子。在这些实施方案中，可通过与检测的内标离子的量作比较，使目标分析物生成的离子的存在或量与样品中目标分析物的存在或量相关。

在一些实施方案中，所述方法能够测定样品中在约0.0136IU/mL至1.3661IU/mL(等于约0.0820nmol/L至8.1970nmol/L，或约500ng/mL至50000ng/mL)，包括0.0136IU/mL和13661IU/mL范围内的水平的德谷胰岛素的量。

如本文所使用，术语“纯化”和“富集(enriching)”并不指从样品中去除除目标分析物外的所有物质。相反，这些术语指使一种或多种目标分析物的量相对于样品中可能干扰目标分析物的检测的其它组分富集的过程。通过各种方式纯化样品可使一种或多种干扰物质，例如可能或可能不干扰通过质谱法检测所选母离子或子离子的一种或多种物质相对减少。当使用该术语时，相对减少不需要通过纯化完全去除待纯化材料中与目标分析物一起存在的任何物质。

如本文所使用，术语“免疫纯化”指利用抗体，包括多克隆或单克隆抗体，使所述一种或多种目标分析物富集的纯化过程。可使用本领域众所周知的免疫纯化方法进行免疫纯化。通常，免疫纯化过程利用结合、偶联或以其它方式附着于载体，例如柱、孔、管、凝胶、胶囊、颗粒等的抗体。如本文所使用的免疫纯化包括但不限于本领域中常称为免疫沉淀的过程，以及本领域中常称为亲和色谱法或免疫亲和色谱法的过程。

如本文所使用，术语“样品”指可能含有目标分析物的任何样品。如本文所使用，术语“体液”指可从各个体内分离的任何流体。例如，“体液”可包括血液、血浆、血清、胆汁、唾液、尿、眼泪、汗等。在优选实施方案中，样品包括来自人类的体液样品；优选血浆或血清。

如本文所使用，术语“固相萃取”或“SPE”指由于溶于或悬浮于溶液(即，流动相)中的组分对溶液通过或围绕的固体(即固相)的亲和力，使化学混合物分离成组分的过程。在一些情况下，当流动相通过或围绕固相时，固相可保留流动相不需要的组分，导致对流动相中分析物的纯化。在其它情况下，固相可保留分析物，使流动相不需要的组分通过或围绕固相。在这些情况下，然后使用第二流动相将保留的分析物从固相洗脱做进一步处理或分析。SPE，包括TFLC，可通过单一或混合模式机制操作。混合模式机制利用相同柱中的离子交换和疏水保留；例如，混合模式SPE柱的固相可表现出强的阴离子交换和疏水保留；或可表现出强的阳离子交换和疏水保留。

通常，SPE柱填充材料对分析物的亲和力可能是由于多种机制中的任一种，例如一种或多种化学相互作用或免疫亲和性相互作用。在一些实施方案中，不使用免疫亲和柱填充材料进行德谷胰岛素的SPE。即，在一些实施方案中，用不是免疫亲和柱的SPE柱从样品中纯化德谷胰岛素。

如本文所使用，术语“超高效液相色谱法”或“UPLC”指通过在压力下迫使流动相通过固定相，通常为密集填充柱，提高分离程度的液相色谱法。

如本文所使用，术语“质谱法”或“MS”指通过其质量鉴定化合物的分析技术。MS指基于其质荷比或“m/z”过滤、检测和测量的方法。MS技术通常包括电离化合物以形成带电化合物；和检测带电化合物的分子量并计算质荷比。可通过任何适合方式电离并检测化合物。“质谱仪”通常包括离子发生器、质量分析器和离子检测器。一般而言，电离一个或多个目标分子，并且随后将离子引入质谱仪中，其中由于磁场和电场的组合，离子在空间上跟随取决于质量(“m”)和电荷(“z”)的途径。

如本文所使用，术语“电离”指生成具有等于一个或多个电子单位的净电荷的分析物离子的过程。负离子是具有一个或多个电子单位的净负电荷的离子，而正离子是具有一个或多个电子单位的净正电荷的离子。

如本文所使用，术语“电喷雾电离”或“ESI”指使溶液沿末端施加了高正或负电位的长度较短的毛细管通过的方法。使到达管末端的溶液蒸发(雾化)成于溶剂蒸汽中非常小的溶液液滴射流或喷雾。这种雾滴流过蒸发室。当液滴变小时，电气表面电荷密度增大，直至相同电荷之间的自然排斥引起离子以及中性分子被释放。

如本文所使用，术语“量化下限”、“定量下限”或“LLOQ”指测量在数量上变得有意义的点。在这个LLOQ的分析物反应可识别、不连续并且可重现，相对标准偏差(RSD％)小于20％并且精度为85％-115％。

如本文所使用，术语“检测限”或“LOD”指测量值大于与之相关的不确定度的点。LOD是值超过与之测量相关的不准确度的点并且定义为零浓度下平均数RSD的3倍。

如本文所使用，体液样品中分析物的“量”通常指反映样品体积中可检测的分析物质量的绝对值。然而，量也涵盖与另一分析物量相比的相对量。例如，样品中分析物的量可为大于样品中一般存在的分析物的对照或正常水平的量。

如本文所使用，关于定量测量(不包括离子质量的测量)的术语“约”指指示值加上或减去10％。在测定指定分析物的质量中，质谱仪可稍有变化。在离子质量或离子质/荷比上下文中的术语“约”指+/-0.50个原子质量单位。发明详述

描述了测定样品中德谷胰岛素的量的方法。更具体地，描述了检测并量化样品中的德谷胰岛素的质谱法。所述方法可利用固相萃取(SPE)和超高效液相色谱法(UPLC)，进行所选分析物的纯化，与质谱法(MS)相结合，从而通过检测并量化样品中的德谷胰岛素的测定系统。优选实施方案特别适合应用于大型临床实验室进行自动化德谷胰岛素量化测定。

用于本发明实施方案中的校准和QC混合血清优选使用与预期样品基质相似的基质制备，条件是基本上不存在德谷胰岛素。

通过质谱法检测并定量德谷胰岛素

使用包括用于电离分馏样品并产生带电分子做进一步分析的离子源的质谱仪进行质谱分析。在各个实施方案中，可通过技术人员已知的任何方法电离德谷胰岛素。例如，可通过电子电离、化学电离、电喷雾电离(ESI)、质子电离、大气压化学电离(APCI)、光致电离、大气压光致电离(APPI)、激光二极管热解吸(LDTD)、快原子轰击(FAB)、液态二次电离(LSI)、基质辅助激光解吸电离(MALDI)、场电离、场解吸、热喷雾/等离子喷雾电离、表面增强激光解吸电离(SELDI)、电感耦合等离子体(ICP)和粒子束电离进行德谷胰岛素的电离。技术人员将理解，可基于待测分析物、样品类型、检测器类型、正与负模式的选择等确定电离方法的选择，可在正或负模式下电离德谷胰岛素。在优选实施方案中，可在正离子模式下通过ESI电离德谷胰岛素。

使用多反应监测(MRM)检测模式检测离子。当离子与检测器碰撞时，它们产生转化为数字信号的电子脉冲。将所需数据转发至计算机，计算机绘制收集离子计数与时间的图。所得质量色谱图与传统HPLC-MS方法中生成的色谱图类似。可测量与特定离子相对应的峰下面积与目标分析物的量相关联。在某些实施方案中，测量碎片离子和/或前体离子的曲线下面积以测定德谷胰岛素的量。可使用校准标准曲线，基于内部或外部分子标准的一种或多种离子的峰面积，将指定离子的峰面积与内标峰面积比转化为原始分析物的量。

可通过“串联质谱法”或“MS/MS”提高采用某些质谱分析器的MS技术的分辨率。在这种技术中，可在MS仪器中过滤由目标分子生成的前体离子(也称为母离子)，随后破碎驱离子以产生一个或多个碎片离子(也称为子离子或产物离子)，然后在第二个MS过程中分析所述碎片离子。通过精心选择前体离子，仅使某些分析物产生的离子通过到达破碎室，在那里与惰性气体原子的碰撞产生碎片离子。因为在一系列指定电离/破碎条件下以可重现方式生成前体和碎片离子，所以MS/MS技术可提供极其强大的分析工具。

在一些实施方案中，如下使用MS/MS检测和/或量化样品中的德谷胰岛素。通过首先使样品经受SPE，然后经受液相色谱法，优选UPLC使德谷胰岛素在样品中富集；来自色谱分析柱的液体溶剂流进入MS/MS分析器的加热喷雾器接口；并且在接口的加热带电管道内将溶剂/分析物混合物转化为蒸汽。在这些过程期间，分析物(即德谷胰岛素)电离。离子，例如前体离子，通过仪器口并且进入第一个四极。四极1和3(Q1和Q3)为滤质器，允许基于其质荷比(m/z)选择离子(即，分别选择Q1和Q3中的“前体”和“碎片”离子)。四极2(Q2)是碰撞室，在碰撞室内破碎离子。质谱仪的第一个四极(Q1)选择具有德谷胰岛素离子的m/z的分子。使具有恰当m/z的前体离子进入碰撞室(Q2)，而具有任何其它m/z的不合需要的离子与四极的侧面碰撞并且被消除。进入Q2的前体离子与中性气体分子(例如氩分子)碰撞并且破碎。使生成的碎片离子进入四极3(Q3)，在四极3中选择碎片离子进行检测。

电离德谷胰岛素可产生多电荷前体离子(例如4+、5+、6+前体离子等)。电离条件，特别是电喷雾技术中利用的缓冲液的pH，严重影响生成的德谷胰岛素前体离子的同一性和量。例如，在酸性条件下，正电喷雾电离可能主要生成m/z分别为1527.27±0.5、1222.06±0.5和1018.57±0.5的4+、5+和6+电荷德谷胰岛素前体离子。

所述方法在正离子模式下进行的MS/MS。在某些实施方案中，电喷雾缓冲液为酸性并且Q1选择用于m/z为约1527.27±0.5、1222.06±0.5或1018.57±0.5的德谷胰岛素前体离子。破碎这些德谷胰岛素前体离子中的任一种生成m/z为约641.24±0.5和/或641.32±0.5的碎片离子。因此，在Q1选择用于选自m/z为约1527.27±0.5、1222.06±0.5和1018.57±0.5的离子的一种或多种德谷胰岛素前体离子的实施方案中，Q3可选择选自m/z为约641.24±0.5和/或641.32±0.5的离子的一种或多种碎片离子。在某些实施方案中，可测量来自单个前体离子的单个碎片离子的峰面积比。或者，可测量自单个前体离子的两个或更多个碎片离子的峰面积比。在这些实施方案中，可使每个碎片离子的峰面积比受任何已知数学处理以定量评估最初样品中的德谷胰岛素。在其它实施方案中，可测量来自两个或更多个前体离子的一个或多个碎片离子并如以上用于定量评估最初样品中的德谷胰岛素。

有益效果

本发明提供了一种通过UPLC-MS/MS定量测定生物样品中德谷胰岛素含量的方法，该方法利用结合串联质谱技术的纯化方法来检测并量化生物样品中德谷胰岛素的质谱方法，包括使所述样品经受固相萃取(SPE)和超高效液相色谱法(UPLC)以得到富含源自样品的德谷胰岛素的级分；(b)在适合生成可通过质谱法检测的一种或多种胰岛素离子的条件下使所述富集的德谷胰岛素经受电离源；(c)通过串联质谱法测定一种或多种德谷胰岛素离子的量，其中所述样品在电离之前未经受免疫纯化。本发明方法准确性和精密度全部在可接受水平内(精密度：相对标准偏差≤15％，LLOQ相对标准偏差≤20％；准确度：均值85-115％，相对标准偏差±15％；LLOQ均值80-120％，相对标准偏差±20％)。本发明方法对样本类型普通血清、SST、EDTA血浆、肝素钠血浆、肝素锂血浆样品的德谷胰岛素定量测定均适用，基质特异性小。本发明方法对溶血样品获得可接受的结果；对脂血性患者样品均获得可接受的结果；可见脂血和溶血对本发明方法干扰小。相对于现有检测技术的ELISA法，本发明整个检测过程耗时短、相对成本低、特异性好，发生假阳性与假阴性概率极低，更适合临床应用。

附图说明

图1是通过UPLC-MS/MS检测4+德谷胰岛素离子对典型图谱。

图2是通过UPLC-MS/MS检测5+德谷胰岛素离子对典型图谱。

图3是通过UPLC-MS/MS检测6+德谷胰岛素离子对典型图谱。

图4是用德谷胰岛素UPLC-MS/MS测量的模拟血清标准中德谷胰岛素定量的线性图线。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行具体描述，在此指出以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术熟练人员可以根据上述发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。本发明所有原料及试剂均为市售产品。

实施例1：样品制备

通过在各种浓度下示踪模拟血浆中的德谷胰岛素(具有0.1％抑酞酶的空白血浆中)制备含有不同量的德谷胰岛素的模拟血浆样品以评估线性响应(500-50000ng/mL)。

实施例2：质谱分析之前富集德谷胰岛素

样本经过蛋白沉淀、固相萃取(SPE)柱预处理。SPE小柱保留德谷胰岛素，而使其它血清蛋白和大分子流过，将50μL样品引入Waters H Class用甲醇：水：乙酸(6：3：1，v/v/v)的溶液将德谷胰岛素从萃取小柱上洗脱到分析柱上(Waters,ACQUITY UPLC Peptide BEHC18)。将UPLC梯度应用于分析柱，以将德谷胰岛素与样品所含的其它分析物分开。流动相A是0.1％于水中的甲酸而流动相B是0.1％于乙腈中的甲酸。UPLC梯度从15％有机梯度开始，在约192s内提高到85％。然后使德谷胰岛素富集样品进行MS/MS以定量德谷胰岛素。

实施例3：通过串联MS检测并定量德谷胰岛素

使用Waters TQ-S MS/MS系统进行MS/MS。在本文所述实施例中使用全部来自Waters UNIFI 1.8.2.169或更新版本。离开分析柱的液体溶剂/分析物流MS/MS分析器的ESI源接口。在接口的加热管道内溶剂/分析物混合物转化为蒸汽。在正离子模式下，在酸性条件下通过ESI电离分析物。离子进入第一个四极(Q1)。在Q1处观察到几种可能的德谷胰岛素前体离子。图1-3是通过UPLC-MS/MS检测4+、5+、6+德谷胰岛素离子对典型图谱。对m/z为约1527.27±0.50(4+离子)、1222.06±0.50(5+离子)和约1018.57±0.50(6+离子)的多电荷德谷胰岛素前体离子进行破碎研究。

表1.对德谷胰岛素观察到的示例性质量相变的最佳碰撞能(正极性-酸性条件)

前体离子(m/z)	产物离子(m/z)	最佳碰撞能
			1527.27±0.50(4+)	641.32	44.00
	1822.30	28.00
				1528.61	12.00
1222.06±0.50(5+)	1218.33	22.00
				1366.92	22.00
	641.24	32.00
			1018.57±0.50(6+)	1015.41	14.00
	1093.77	14.00
				641.24	18.00

实施例4：测定日内和测定日间准确性和精密度研究

用人空白血浆(含0.1％抑肽酶)配制最低定量限LLOQ 500ng/mL(13.7μIU)、低浓度QL 1000ng/mL(27.3μIU)、中低浓度QGM 2500ng/mL(68.3μIU)、中浓度QM 12000ng/mL(327.9μIU)、高浓度QH 30000ng/mL(819.7μIU)德谷胰岛素生物样本，进行测定内和测定间准确性、再现性和精度研究，以覆盖假定可报道测定范围。在研究测定内准确性和精密度时，每一个浓度至少制备并测定5个样本。在研究测定间准确性和精密度时，至少在不同日连续制备并测定3个合格分析批。

上述5中质控样本，准确性和精密度全部在可接受水平内(精密度：相对标准偏差≤15％，LLOQ相对标准偏差≤20％；准确度：均值85-115％，相对标准偏差±15％；LLOQ均值80-120％，相对标准偏差±20％)。

实施例5：定量下限研究

取6个不同来源的空白血浆，用空白血浆(含0.1％抑肽酶)配制最低定量限LLOQ500ng/mL(13.7μIU)德谷胰岛素生物样本，进行定量下限研究。上述6个不同来源的空白血浆配置的LLOQ质控样本，定量下限在可接受水平内(信噪比S/N：≥5)。

实施例6：测定可报道范围和线性度

用空白血浆(含0.1％抑肽酶)配制500ng/mL(13.7μIU)、1000ng/mL(27.3μIU)、2500ng/mL(68.3μIU)、5000ng/mL(136.6μIU)、10000ng/mL(273.2μIU)15000ng/mL(409.8μIU)、25000ng/mL(683.1μIU)、50000ng/mL(1366.1μIU)德谷胰岛素生物样本，并且在单独的3天分析。连续3次的加权(1/X)线性回归产生0.997或更高的相关系数，精度为±20％，揭示可量化范围为13.7-1366.1μIU/mL。图4是用德谷胰岛素UPLC-MS/MS测量的模拟血清标准中德谷胰岛素定量的线性图线。德谷胰岛素在血浆中标准曲线为：

y＝4039.5x-406.14，R²＝0.997。

式中，x为峰面积比，y为德谷胰岛素在生物样品中的浓度，单位为ng/mL。

实施例7：样本类型研究

可通过BD Vacutainer^TM管中收集的6种不同抗凝类型的人类患者混合血清(普通血清、SST、EDTA血浆、肝素钠血浆、肝素锂血浆和柠檬酸钠血浆)，每种类型收集十个人的样本进行平行实验，估计基质特异性。

然后根据实施例2中描述的方法萃取并分析来自每种混合血清的样品的德谷胰岛素。这些研究表明，所有样品类型可接受。

实施例8：干扰研究

在正常空白血浆中加入2％冻融红细胞，混合。通过示踪溶血性样品中不同水平的德谷胰岛素估计溶血干扰对德谷胰岛素测定的影响。然后根据实施例2中描述的方法萃取并分析德谷胰岛素。这些研究的结果表明，对溶血样品获得可接受的结果(即，在80-120％精度内)。

在正常空白血浆中加入商品化脂肪，使脂肪浓度为20mg/ml，混合。通过示踪高脂血样品中不同水平的德谷胰岛素估计脂血干扰对德谷胰岛素测定的影响。然后根据实施例2中描述的方法萃取并分析德谷胰岛素。这些研究的结果表明，对于脂血样品获得可接受的结果(即，在80-120％精度内)。

Claims (10)

1.一种通过UPLC-MS/MS测定生物样品中德谷胰岛素含量的方法，包括：

(a) 通过超高效液相色谱法(UPLC)处理样品以获得富含德谷胰岛素的成分；

(b) 在适合生成可通过质谱法检测的一种或多种德谷胰岛素离子的条件下使所述富集的德谷胰岛素经受电离源；以及

(c) 通过串联质谱法测定一种或多种德谷胰岛素离子的量。

2.根据权利要求1 所述的方法，其特征在于：所述生物样品包括人、食蟹猴、家兔、小鼠、大鼠、Beagle犬血浆或血清样品；其中当取自人、食蟹猴、家兔、小鼠、大鼠、Beagle犬时，所述测定的德谷胰岛素的量是所述样品中存在的德谷胰岛素的量。

3.根据权利要求1 所述的方法，其特征在于：所述电离源是电喷雾(ESI)电离源；经受电离源时在正离子模式下电离之前使所述样品经受酸性条件；所述样品经受酸性条件包括使所述样品经受甲酸。

4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于：步骤(c)中测定的所述一种或多种离子包括选自质荷比(m/z)为1222.06±0.5、1018.57±0.5和1527.27±0.5的离子的德谷胰岛素前体离子。

5.根据权利要求4 所述的方法，其特征在于：步骤(c)中测定的所述一种或多种离子包括选自质荷比(m/z)为1218.33±0.5、1366.92±0.5、641.24±0.5、1015.41±0.5、1093.77±0.5、641.32±0.5 1822.30±0.5和1528.61±0.5 的离子的一种或多种碎片离子。

6.根据权利要求5 所述的方法，其特征在于：步骤(c)中测定的所述一种或多种离子包括选自以下的一种或多种碎片离子：来自质荷比(m/z)为1222.06±0.5的德谷胰岛素前体离子的碎片离子，来自m/z为1018.57±0.5的德谷胰岛素前体离子的碎片离子和来自m/z为1527.27±0.5的德谷胰岛素前体离子的碎片离子。

7.根据权利要求1 所述的方法，其特征在于：所述串联质谱法包括生成质荷比(m/z)为1222.06±0.5的德谷胰岛素前体离子并将所述前体离子破碎成选自m/z 1218.33±0.5、1366.92.0±0.5、641.24±0.5的离子的一种或多种碎片离子。

8.根据权利要求7 所述的方法，其特征在于：步骤(c)中测定的所述离子包括来自m/z为641.24±0.5 和641.32±0.5 的离子的一种或多种离子。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1) 通过萃取技术使样品中的德谷胰岛素富集；(2) 使来自步骤(1) 的纯化德谷胰岛素经受超高效液相色谱法(UPLC) 以从样品获得富含德谷胰岛素的成分；(3) 在适合生成可通过质谱法检测的德谷胰岛素前体离子的条件下使富集的德谷胰岛素经受电离源，其中德谷胰岛素前体离子的m/z为1222.06±0.5 ；(4) 在约12-44eV 范围内的碰撞能下使德谷胰岛素前体离子经受碰撞诱导解离以生成可通过质谱法检测的一种或多种碎片离子；以及(5) 通过质谱法测定一种或多种所述碎片离子的量。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：以在12-44V 范围内且包括12V 和44V 的碰撞能进行所述破碎。