CN109991351A - 一种血液样本中胰岛素类似物的检测方法 - Google Patents

一种血液样本中胰岛素类似物的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种血液样本中胰岛素类似物的检测方法，包括如下步骤：(1)确定LC‑MS/MS条件；(2)绘制标准曲线，将胰岛素类似物溶于甲醇中，稀释制成胰岛素类似物标准溶液，再加入大鼠血浆样本中制成胰岛素类似物标准曲线样品，将标准曲线样品通过前处理后以LC‑MS/MS条件分别检测标准曲线样品，并根据检测结果绘制胰岛素类似物的标准曲线；(3)样品检测，将待测血液样本通过前处理后，以LC‑MS/MS条件进行检测，并将检测结果与标准曲线对照计算出待测血液样本中胰岛素类似物的含量。本发明的检测方法克服了现有技术中检测方法无法实现胰岛素类似物在体内较低浓度水平的精准定量检测的缺陷，为胰岛素类似物在动物体内的药代动力学中的检测提供了简便的分析方法。

Description

一种血液样本中胰岛素类似物的检测方法
技术领域
本发明涉及医学检测领域，尤其涉及一种血液样本中胰岛素类似物的检测方法。
背景技术
胰岛素类似物(Insulin analog)，又称餐时胰岛素，泛指通过对胰岛素结构的修饰模拟正常胰岛素的分泌，并模拟胰岛素生理作用的物质。
胰岛素由胰岛β细胞受内源或外源性物质如葡萄糖的刺激分泌，属于可溶性酸性蛋白，主要结构包括两条肽链(A链和B链)，其中A链含氨基酸残基21个；B链则有30个。肽链由两个胱氨酸二硫键连接，其中所含的脯氨酸残基是形成二聚体的关键位点。胰岛素类似物是在胰岛素的结构上做一些相应的修饰，从而更贴合人体对胰岛素分泌的需求，达到治疗糖尿病的目的。目前对于胰岛素类似物的检测，存在无法实现胰岛素类似物在体内较低浓度水平的精准定量检测的缺陷。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种操作简单、分析快速、且能满足胰岛素类似物在体内较低浓度水平的精准定量的检测方法，解决现有的技术问题。
为解决上述技术问题，血液样本中胰岛素类似物的检测方法，其特征在于：采用液相-质谱联用系统对胰岛素类似物进行分析；检测方法包括以下步骤：
步骤一：确定LC-MS/MS条件：
LC条件如下：
流动相：流动相A：含质量比0.1％乙酸的乙腈；流动相B：含质量比0.1％乙酸的水；
梯度洗脱条件包括如下三个阶段：
第一阶段：起始流动相体积比：A:B＝90:10；
第二阶段：流动相体积比：A:B＝52:48；
第三阶段：流动相体积比：A:B＝5:95；
第四阶段：流动相体积比：A:B＝90:10至结束；
且第一阶段和第三阶段的洗脱时间之和大于或等于1.5min；
流速：0.25mL/min；
进样量：10μL；
MS条件如下：
检测方式：多反应监测MRM；
扫描方式：正离子扫描；
离子喷雾电压：5500V；
离子喷雾电压：5500V；
气帘气：35；
雾化气：55；
辅助气：50；
离子源温度：250℃；
碰撞气种类：N2；
碰撞气压力：High
步骤二：绘制标准曲线：
将胰岛素类似物溶于甲醇中，稀释制成胰岛素类似物浓度为1.7ppb-3400ppb的标准溶液，再加入大鼠血浆样本中，制成胰岛素类似物浓度为0.17ppb～340ppb的标准曲线样品；
将标准曲线样品通过前处理后，以所述LC-MS/MS条件分别检测标准曲线样品，并根据检测结果绘制胰岛素类似物的标准曲线；
步骤三：样品检测：
将待测血液样本通过前处理后，以所述LC-MS/MS条件进行检测，并将检测结果与所述标准曲线对照，计算出待测血液样本中胰岛素类似物的含量；
步骤二中标准曲线样品的前处理包括如下步骤：取45ul动物血浆加入5ul胰岛素类似物标准曲线样品溶液，涡旋10s,然后加入100ul甲醇沉淀蛋白，涡旋2min,低温高速离心10min，取上清；
步骤三中待测血液样品的前处理包括如下步骤：取45ul动物血浆加入5ul待测血液样本溶液，涡旋10s,然后加入100ul甲醇沉淀蛋白，涡旋2min,低温高速离心10min，取上清。
进一步的，步骤一中所述的LC条件中，使用的高效液相色谱仪的型号为Agilent1100、Agilent1200、Agilent1260、Agilent1290、岛津LC-20A和岛津LC-30A中的任意一种。
进一步的，步骤一中所述的LC条件中，液相色谱柱为Agilent ZORBAX EclipseXDB-C18、Agilent ZORBAX Eclipse Plus-C18、Agilent ZORBAX SB-C18、Waters SunFireC18、Waters CSH C18、Agela Venusil XBP C18中的任意一种。
进一步的，步骤一中所述的LC条件中，梯度洗脱条件为：
起始流动相体积比：A:B＝90:10；
步骤①：0～3.5min，流动相体积比由A:B＝90:10匀速上升至A:B＝52:48；
步骤②：3.5～3.8min，流动相体积比A:B＝52:48；
步骤③：3.8～4.0min，流动相体积比由A:B＝52:48匀速上升至A:B＝5:95；
步骤④：4.0～6.0min，流动相体积比A:B＝5:95；
步骤⑤：6.0～6.1min，流动相体积比由A:B＝5:95匀速下降至A:B＝90:10；
步骤⑥：6.1～8.5min，A:B＝90:10；
其中步骤①和步骤⑥的洗脱时间之和大于4min。
进一步的，步骤一中所述的LC条件中，液相色谱柱的柱温为25～35℃。
进一步的，步骤一中所述的MS条件中，所使用的质谱仪的型号为SCIEX5500，6500，6500+，所使用的离子源为电喷雾离子源。
进一步的，步骤一中所述的MS条件中，胰岛素类似物和内标的质谱参数为：
进一步的，步骤一中所述的MS条件中，离子源温度为200-350℃。
进一步的，步骤二中绘制标准曲线时选择胰岛素类似物浓度为340ppb、170ppb、34ppb、6.8ppb、3.4ppb、0.68ppb和0.17ppb的标准曲线样品。
进一步的，步骤三中待测血液样本的前处理中，离心的条件为：13000转/分钟，10分钟，4℃。
本发明的积极进步效果在于：本发明的检测方法克服了现有技术中的检测方法无法实现胰岛素类似物在体内较低浓度水平的精准定量检测的缺陷，为胰岛素类似物在动物体内的药代动力学中的检测提供了简便的分析方法。本发明的检测方法精准度高。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式做进一步阐明。
图1为实施例1中胰岛素类似物的色谱图。
图2为实施例1中胰岛素类似物的标准曲线。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
下述实施例中，所使用的液相色谱的条件如下：
液相色谱仪型号：岛津LC-20A；
液相色谱柱型号：Waters CSH C18(2.1×100mm，1.7μm)
流动相：流动相A：含质量比0.1％乙酸的乙腈；流动相B：含质量比0.1％乙酸的水；
梯度洗脱条件：
起始流动相体积比：A:B＝90:10；
步骤①：0～3.5min，流动相体积比由A:B＝90:10匀速上升至A:B＝52:48；
步骤②：3.5～3.8min，流动相体积比A:B＝52:48；
步骤③：3.8～4.0min，流动相体积比由A:B＝52:48匀速上升至A:B＝5:95；
步骤④：4.0～6.0min，流动相体积比A:B＝5:95；
步骤⑤：6.0～6.1min，流动相体积比由A:B＝5:95匀速下降至A:B＝90:10；
步骤⑥：6.1～8.5min，A:B＝90:10；
柱温：30℃；
流速：0.25mL/min；
进样量：10μL；
下述实施例中，所使用的质谱参数如下：
质谱仪型号：QTRAP6500；
源参数：
上表中，对于各术语的解释说明如下：
CAD——碰撞活化解离气(N2)；CUR——气帘气；Gas1——雾化气；Gas2——辅助气；IS——离子喷雾电压；TEM——离子源温度。
化合物参数：
上表中，对于各术语的解释说明如下：
Q1——母离子；Q3——子离子；Dwell time——驻留时间；DP——去簇电压；EP——射入电压；CE——碰撞能量；CXP——碰撞室射出电压。
实施例1
本实施例提供了一种血液样本中胰岛素类似物的检测方法，其基本步骤和条件如下：
(1)标准溶液的配制
甲醇超声溶解胰岛素类似物至3.41mg/mL，50％甲醇水溶液稀释至1.7ppb-3.4ppm。
(2)标曲样品配制
取标准溶液溶液各5μL平行加入到45μL空白全血样本中，制得浓度为340ppb,170ppb,34ppb,6.8ppb,3.4ppb,0.68ppb，0.17ppb的标准曲线样品，通过前处理后进样分析。所述前处理步骤如下：取45ul大鼠血浆加入5ul标准系列溶液，涡旋10s,然后加入100ul甲醇沉淀蛋白，涡旋2min,低温高速离心10min，取上清，进样10ul。
(3)待测样品采集
大鼠给予胰岛素类似物制剂，剂量，0.45mg/kg。
尾静脉采血0.2mL，抗凝剂，肝素钠。采血时间：给药后15min、30min、1h、2h、3h、5h。
血液样本配制或采集完成后，通过与步骤(2)相同的前处理后进样分析。
(4)LC-MS/MS方法
通过LC-MS/MS方法对于标准曲线样品和待测血液样本分别进行检测。
(5)色谱图获得
如图1，经过上述步骤进样分析得到胰岛素类似物的色谱,。图1中，停留时间为3.59min的峰为胰岛素类似物的峰。
如图2，基于标准曲线样品的待测物峰面积过归一化法得到标准曲,。其中，横坐标是待测物中胰岛素类似物的浓度(单位ppb)，纵坐标是待测物与峰面积。1/X2表示权重。图2中，具体线性关系为y＝4.59584e4x-243.97861，r＝0.99068。
(6)定量结果
通过标准曲线定量得到血液样本中胰岛素类似物的浓度。具体方法为：将待测样品按照LC-MS/MS方法检测得到的与胰岛素类似物标准曲线样品相同保留时间的色谱峰的峰面积带入胰岛素类似物标准曲线，得到待测样品中胰岛素类似物的含量。待测样本中胰岛素类似物药物浓度测定结果如下表所示：
时间点(h) 0.25 0.5 1 2 3 5
浓度(ppb) 57.333 49.393 29.945 2.880 1.142 BLOQ
可见，本发明的检测方法采取了简单的有机溶剂蛋白沉淀法对血液样本进行前处理，基于待测物峰面积，通过加权平均法得到标准曲线，从而定量得到血液样本中胰岛素类似物的浓度。本发明的检测方法精准度高。
在以上的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是以上描述仅是本发明的较佳实施例而已，本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，因此本发明不受上面公开的具体实施的限制。同时任何熟悉本领域技术人员在不脱离本发明技术方案范围情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。

Claims (9)

1.一种血液样本中胰岛素类似物的检测方法，其特征在于：采用液相-质谱联用系统对胰岛素类似物进行分析；检测方法包括以下步骤：
步骤一：确定LC-MS/MS条件：
LC条件如下：
流动相：流动相A：含质量比0.1％乙酸的乙腈；流动相B：含质量比0.1％乙酸的水；
梯度洗脱条件包括如下三个阶段：
第一阶段：起始流动相体积比：A:B＝90:10；
第二阶段：流动相体积比：A:B＝52:48；
第三阶段：流动相体积比：A:B＝5:95；
第四阶段：流动相体积比：A:B＝90:10至结束；
且第一阶段和第三阶段的洗脱时间之和大于或等于1.5min；
流速：0.25mL/min；
进样量：10μL；
MS条件如下：
检测方式：多反应监测MRM；
扫描方式：正离子扫描；
离子喷雾电压：5500V；
离子喷雾电压：5500V；
气帘气：35；
雾化气：55；
辅助气：50；
离子源温度：250℃；
碰撞气种类：N2；
碰撞气压力：High
步骤二：绘制标准曲线：
将胰岛素类似物溶于甲醇中，稀释制成胰岛素类似物浓度为1.7ppb-3400ppb的标准溶液，再加入大鼠血浆样本中，制成胰岛素类似物浓度为0.17ppb～340ppb的标准曲线样品；
将标准曲线样品通过前处理后，以所述LC-MS/MS条件分别检测标准曲线样品，并根据检测结果绘制胰岛素类似物的标准曲线；
步骤三：样品检测：
将待测血液样本通过前处理后，以所述LC-MS/MS条件进行检测，并将检测结果与所述标准曲线对照，计算出待测血液样本中胰岛素类似物的含量；
步骤二中标准曲线样品的前处理包括如下步骤：取45ul动物血浆加入5ul胰岛素类似物标准曲线样品溶液，涡旋10s,然后加入100ul甲醇沉淀蛋白，涡旋2min,低温高速离心10min，取上清；
步骤三中待测血液样品的前处理包括如下步骤：取45ul动物血浆加入5ul待测血液样本溶液，涡旋10s,然后加入100ul甲醇沉淀蛋白，涡旋2min,低温高速离心10min，取上清。
2.根据权利要求1所述的血液样本中胰岛素类似物的检测方法，其特征在于：步骤一中所述的LC条件中，使用的高效液相色谱仪的型号为Agilent1100、Agilent1200、Agilent1260、Agilent1290、岛津LC-20A和岛津LC-30A中的任意一种。
3.根据权利要求1所述的血液样本中胰岛素类似物的检测方法，其特征在于：步骤一中所述的LC条件中，液相色谱柱为Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18、Agilent ZORBAXEclipse Plus-C18、Agilent ZORBAX SB-C18、Waters SunFire C18、Waters CSH C18、Agela Venusil XBP C18中的任意一种。
4.根据权利要求1所述的血液样本中胰岛素类似物的检测方法，其特征在于：步骤一中所述的LC条件中，梯度洗脱条件为：
起始流动相体积比：A:B＝90:10；
步骤①：0～3.5min，流动相体积比由A:B＝90:10匀速上升至A:B＝52:48；
步骤②：3.5～3.8min，流动相体积比A:B＝52:48；
步骤③：3.8～4.0min，流动相体积比由A:B＝52:48匀速上升至A:B＝5:95；
步骤④：4.0～6.0min，流动相体积比A:B＝5:95；
步骤⑤：6.0～6.1min，流动相体积比由A:B＝5:95匀速下降至A:B＝90:10；
步骤⑥：6.1～8.5min，A:B＝90:10；
其中步骤①和步骤⑥的洗脱时间之和大于4min。
5.根据权利要求1所述的血液样本中胰岛素类似物的检测方法，其特征在于：步骤一中所述的LC条件中，液相色谱柱的柱温为25～35℃。
6.根据权利要求1所述的血液样本中胰岛素类似物的检测方法，其特征在于：步骤一中所述的MS条件中，所使用的质谱仪的型号为SCIEX5500，6500，6500+，所使用的离子源为电喷雾离子源。
7.根据权利要求1所述的血液样本中胰岛素类似物的检测方法，其特征在于：步骤一中所述的MS条件中，离子源温度为200-350℃。
8.根据权利要求1所述的血液样本中胰岛素类似物的检测方法，其特征在于：步骤二中绘制标准曲线时选择胰岛素类似物浓度为340ppb、170ppb、34ppb、6.8ppb、3.4ppb、0.68ppb和0.17ppb的标准曲线样品。
9.根据权利要求1所述的血液样本中胰岛素类似物的检测方法，其特征在于：步骤三中待测血液样本的前处理中，离心的条件为：13000转/分钟，10分钟，4℃。
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