CN111679005A - 血浆中甘草酸苷的检测方法 - Google Patents

血浆中甘草酸苷的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种血浆中甘草酸苷的检测方法，其采用超高效液相色谱‑串联质谱进行检测，包括以下步骤：(1)血浆样品预处理：取血浆样本，加入依折麦布内标工作溶液以及甲酸水溶液，混合，再加入萃取剂，离心，取上层清液并进行干燥后加入复溶液，得到待测样品；(2)样品检测：将所述待测样品注入超高效液相色谱‑串联质谱仪中进行检测；其中，超高效液相色谱的流动相为：流动相A为0.2～0.4v/v％甲酸的乙腈溶液，流动相B为0.2～0.4v/v％甲酸的水溶液，进行梯度洗脱。本发明方法专属性强、灵敏度高、特异性强，可以满足临床大批量样品分析要求，并且操作简单。

Description

血浆中甘草酸苷的检测方法
技术领域
本发明涉及医药技术领域，特别是涉及一种血浆中甘草酸苷的检测方法。
背景技术
甘草酸苷是由中药甘草中提取的一个活性成分，甘草酸苷有以下作用：a.抗炎症作用；b.免疫调节作用；c.对实验性肝细胞损伤的抑制作用；d.肝细胞增殖促进作用；e.抑制病毒增殖和对病毒的灭活作用。
目前，由于甘草酸苷在人体中很快就转化为其活性代谢产物甘草次酸，且由于甘草酸苷在人体内的浓度较低，检测灵敏度不高，现今还没有一种检测方法，可以直接测定原型药物。
根据相关指导原则的规定：“一般推荐仅测定原形药物，因为原形药物的药时曲线比代谢产物能更灵敏地反映制剂间的差异。对于从原形药物直接代谢产生的主要代谢产物，如果同时满足以下两点，应同时予以测定：1)代谢产物主要产生于进入体循环以前，如源自首过效应或肠道内代谢等；2)代谢产物显著影响药物的安全性和有效性。以上原则适用于包括前体药物在内的所有药物。建议以原形药物评价生物等效性，代谢产物的相关数据用于进一步支持临床疗效的可比性。”
因此，亟待开发一种方法，用于检测原形药甘草酸苷在人体血浆中的浓度。
发明内容
基于此，本发明的目的是提供一种检测原形药甘草酸苷在人体血浆中浓度的方法，该方法专属性强、灵敏度高、特异性高，可以满足临床大批量样品分析要求，并且操作简单。
具体技术方案如下：
一种血浆中甘草酸苷的检测方法，采用超高效液相色谱-串联质谱进行检测，包括以下步骤：
(1)血浆样品预处理：取血浆样本，加入依折麦布内标工作溶液以及甲酸水溶液，混合，再加入萃取剂，离心，取上层清液并进行干燥后加入复溶液，得到待测样品；
(2)样品检测：将所述待测样品注入超高效液相色谱-串联质谱仪中进行检测；
其中，超高效液相色谱的流动相为：流动相A为0.2～0.4v/v％甲酸的乙腈溶液，流动相B为0.2～0.4v/v％甲酸的水溶液，进行梯度洗脱。
在其中一些实施例中，所述流动相A为0.25～0.35v/v％甲酸的乙腈溶液，所述流动相B为0.25～0.35v/v％甲酸的水溶液。
在其中一些实施例中，所述超高效液相色谱的色谱条件包括：
色谱柱：Waters ACQUITY
Figure BDA0002537715720000021
BEHC18；色谱柱规格：粒径1.7±0.2μm，直径×长度：2.1±0.2mm×100±2mm；
色谱柱温度：35±2℃；
流速：0.40±0.02mL/min；
进样量：10±1μL；
自动进样器温度：5～7℃；
洗针液：强洗液：体积百分比为90±5：10的乙腈和水混合液，弱洗液：体积百分比为10±5：90的乙腈和水混合液。
在其中一些实施例中，所述梯度洗脱的条件为：
0～1.6min，流动相A 43～47％，流动相B 53～57％；
1.6～2.80min，流动相A 43～47％→93～97％，流动相B 53～57％→3～7％；
2.80～3.5min，流动相A 93～97％，流动相B 3～7％；
3.5～4.3min，流动相A 93～97％→43％～47％，流动相B 3～7％→53～57％。
在其中一些实施例中，所述梯度洗脱的条件为：
0～1.6min，流动相A 44～46％，流动相B 54～56％；
1.6～2.80min，流动相A 44～46％→94～96％，流动相B 54～56％→4～6％；
2.80～3.5min，流动相A 94～96％，流动相B 4～6％；
3.5～4.3min，流动相A 94～96％→44％～46％，流动相B 4～6％→54～56％。
在其中一些实施例中，所述质谱的色谱条件包括：
离子源：电喷雾离子源，负离子模式下以MRM进行扫描；
喷雾电压为-4500±50V；
雾化气温度为600±10℃；
雾化气压力为50±5Psi；
辅助加热气压力为50±5Psi；
气帘气压力为30±3Psi；
碰撞气压力为9±1psi；
碰撞室入口电压为-10±1eV；
碰撞室出口电压为-13±1eV。
在其中一些实施例中，甘草酸苷选择离子对：m/z 821.3→m/z 351.1；依折麦布选择离子对：m/z 408.2→m/z 271.2。
在其中一些实施例中，所述依折麦布内标工作溶液中依折麦布内标的浓度为18～22ng/mL，优选为20ng/mL。
在其中一些实施例中，所述血浆样本包含抗凝剂肝素钠。
在其中一些实施例中，所述甲酸水溶液中甲酸与水的体积比为0.8～1.2：1。
在其中一些实施例中，所述复溶液为甲醇水溶液，所述复溶液中甲醇与水的体积比为0.8～1.2：1。
在其中一些实施例中，所述萃取剂为乙酸乙酯。
在其中一些实施例中，所述血浆为人的血浆。
在其中一些实施例中，所述血浆样品、依折麦布内标工作溶液、甲酸水溶液和萃取剂的体积比为15：1～3：8～12：50～150。可选为15：1.5～2.5：9～11：80～120。
在其中一些实施例中，所述上清液和复溶液的体积比为：5～9：2。可选为6～8：2。
在其中一些实施例中，所述离心的过程为：在15700±1000g的离心力下离心8～12min。
在其中一些实施例中，所述检测方法还包括如下步骤：采用内标法进行定量计算，以甘草酸苷和内标依折麦布的峰面积比值带入标准曲线方程计算血浆样品中甘草酸苷的浓度。
在其中一些实施例中，所述标准曲线方程的建立包括以下步骤：在8份空白血浆中分别添加甘草酸苷浓度依次为4ng/mL(W1)、8ng/mL(W2)、20ng/mL(W3)、40ng/mL(W4)、160ng/mL(W5)、300ng/mL(W6)、480ng/mL(W7)和600ng/mL(W8)的甘草酸苷标准溶液，所述甘草酸苷标准溶液的与空白血浆的体积比为：1：18～20，依次得到最低定量下限血浆标样1(STD1)、血浆标样2(STD2)、血浆标样3(STD3)、血浆标样4(STD4)、血浆标样5(STD5)、血浆标样6(STD6)、血浆标样7(STD7)、最高定量上限血浆标样8(STD8)；分别取上述血浆标样，加入依折麦布内标工作溶液(与空白血浆的体积比为1：7～8)。另取空白血浆2份，加入体积比为1：1的甲醇-水(与空白血浆的体积比为1：18～20)，取上述1份加入依折麦布内标工作溶液(与空白血浆的体积比为1：7～8)，作为零浓度样品(0)；另1份加入体积比为1：1的甲醇-水(与空白血浆的体积比为1：7～8)，作为双空白样品(00)；再取超纯水1份，加入体积比为1：1的甲醇-水(与超纯水的体积比为1：7～8)，作为溶剂空白样品。在上述标样或样品(已添加内标/甲醇水溶液后)中分别加入甲酸水溶液，涡旋混合均匀后，加入萃取剂，涡旋并离心，取上清液并干燥，加入复溶液复溶，涡旋(甲酸水溶液、萃取剂、复溶液、上清液的体积比与所述血浆样品前处理过程一致)，得到11份标准样品；分别取上述标准样品注入超高效液相色谱-串联质谱仪中，检测标准样品中的甘草酸苷和内标物依折麦布的色谱峰，并据此得到标准曲线。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的UPLC-MS-MS方法专属性强，甘草酸苷的保留时间为1.13min左右，内标依折麦布保留时间在2.53min左右，甘草酸苷和内标依折麦布的峰形良好，无杂峰干扰测定，基线平稳。
本发明方法的灵敏度高，血浆最低定量限为0.2ng/mL，能准确测定血浆中甘草酸苷的浓度，特异性高。
本发明方法的血浆样品预处理过程简便、高效，使用乙酸乙酯作为萃取剂，萃取效率好，可以适用临床大批量样品的常规测定。
本发明方法快速、准确、操作简便，为甘草酸苷的血药浓度测定提供了依据。
附图说明
图1为HPLC-MS/MS法测得的甘草酸苷在人血浆中的标准曲线图；
图2为人空白血浆的HPLC-MS/MS图(左右两个色谱峰分别代表待测物甘草酸苷和内标依折麦布)；
图3为人空白血浆加入甘草酸苷和依折麦布的HPLC-MS/MS图(左右两个色谱峰分别代表待测物甘草酸苷和内标依折麦布)；
图4为健康受试者口服甘草酸苷药物后血浆样品再加入内标依折麦布的HPLC-MS/MS图(左右两个色谱峰分别代表待测物甘草酸苷和内标依折麦布)。
具体实施方式
本发明下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。
本发明的术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或模块，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤。
在本发明中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。
一、分析方法
1.1仪器耗材
甘草酸铵(待测物对照品)：中国食品药品检定研究院或相同、更高等级的标准品；依折麦布(内标)：USP或相同、更高等级的标准品。使用仪器见表1，使用试剂见表2。
表1仪器设备汇总
仪器名称 型号 生产商
质谱仪 AB Sciex Triple Quad 5500 美国AB Sciex公司
超高效液相色谱 ACQUITY UPLC I-CLASS 美国Waters公司
96孔氮吹仪 NV96-XW Agela Technologies
高速常温离心机 5810 德国Eppendorf公司
高速冷冻离心机 5430R 德国Eppendorf公司
涡旋仪 IKAMS3digital 艾卡广州仪器设备有限公司
超纯水仪 Medium-S800GUVF 上海和泰仪器有限公司
十万分之一天平 METTLER MS205DU 梅特勒-托利多仪器
百万分之一天平 MSA6.6S-OCE-DM 赛海多有利斯
多管涡旋振荡器 VX-Ⅱ 安简(北京)科技有限公司
表2试剂汇总
Figure BDA0002537715720000061
Figure BDA0002537715720000071
注：亦可使用相同级别或更高级别的试剂。
1.2样品制备方法
血浆以肝素钠为抗凝剂，以依折麦布为内标；先加入150μL的血浆样品，再加入20μL的依折麦布内标工作溶液于至EP管中，样品涡旋混匀后，加入100μL的体积比为1：1的甲酸水溶液，混匀后加入1000μL乙酸乙酯，涡旋混匀10min，放入离心机，15700g离心10min。取700μL的上清液于96孔板中，氮气吹干后用200μL的体积比为1：1的甲醇水溶液复溶，涡旋10min充分混匀后作为待测样品。
1.3分析方法
超高效液相色谱条件如下：色谱柱：Waters ACQUITY
Figure BDA0002537715720000073
BEH C18，柱规格为1.7μm，2.1×100mm；色谱柱温度：35℃。流动相A：乙腈/甲酸的体积百分比为100/0.3；流动相B：水/甲酸的体积百分比为100/0.3。洗液：强洗液：
乙腈/水的体积百分比为90/10，弱洗液：乙腈/水的体积百分比为10/90。自动进样器温度为6℃；梯度洗脱，流速为0.4mL/min，进样量为10μL，分析时间4.3min。
洗脱程序见表3：
表3洗脱程序
Figure BDA0002537715720000072
质谱条件如下：离子源为电喷雾离子源ESI，负离子模式下以MRM进行扫描，CAD(碰撞气压力)：9psi，CUR(气帘气压力)：30psi，GS1(雾化气压力)：50psi，GS2(辅助加热气压力)：50psi，IS(喷雾电压)：-4500v，TEM(雾化气温度)：600℃，甘草酸苷选择离子对m/z821.3→m/z351.1，DP(去簇电压)：-20V，CE(碰撞电压)：-58eV，Dwell time(停留时间)：150ms；依折麦布选择离子对m/z 408.2→m/z 271.2，DP(去簇电压)：-21V，CE(碰撞电压)：-22eV，Dwell time(停留时间)：50ms。碰撞室入口电压为-10±1eV，碰撞室出口电压为-13±1eV。
二、实验过程
2.1、甘草酸苷标准溶液配制
甘草酸苷标准溶液的配制：精密称取甘草酸铵对照品于20mL棕色玻璃瓶中，加入体积比为70：30的甲醇-二甲亚砜溶液溶解并定容至刻度，摇匀，即得0.5mg/mL的甘草酸苷贮备液。再以体积比为1：1的甲醇水溶液依次稀释配制甘草酸苷标准溶液，具体稀释浓度见下表4：
表4-1甘草酸苷标准溶液配制浓度(标准曲线工作液)
Figure BDA0002537715720000081
表4-2甘草酸苷标准溶液配制浓度(质控工作液)
Figure BDA0002537715720000082
甘草酸苷标准溶液不使用时储存于塑料容器及冰箱(-20℃)保存，体积可视需要依比例增加或减少。
依折麦布内标工作溶液的配制
依折麦布内标工作溶液的配制：精密称取依折麦布对照品于20mL棕色玻璃瓶中，加入甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得1.000mg/mL的依折麦布贮备液，再以体积比为1：1的甲醇水溶液稀释配制成浓度为20.00ng/mL依折麦布内标工作溶液，具体稀释浓度见下表5：
表5依折麦布内标工作溶液配制浓度
来源溶液(ng/mL) 来源溶液体积(μL) 最终体积(μL) 最终浓度(ng/mL)
1,000,000 10 1000 10,000
10,000 100 50,000 20.00
依折麦布内标工作溶液不使用时储存于塑料容器及冰箱(-20℃)保存，体积可视需要依比例增加或减少。
2.2、线性考察
将空白血浆于室温环境解冻；分别转移10份190μL的空白血浆至96深孔板中(每一个标准曲线样本、空白样本-00及零浓度样本-0)，依下表6所列，分别精密加入甘草酸苷浓度依次为4ng/mL(W1)、8ng/mL(W2)、20ng/mL(W3)、40ng/mL(W4)、160ng/mL(W5)、300ng/mL(W6)、480ng/mL(W7)和600ng/mL(W8)的不同浓度甘草酸苷标准溶液10μL或分析物的替代溶液10μL，并混匀，配成不同浓度的含药血浆，依次得到最低定量下限血浆标样1、血浆标样2、血浆标样3、血浆标样4、血浆标样5、血浆标样6、血浆标样7、最高定量上限血浆标样8，再按“1.2样品制备方法”操作，以1.3项方法分析。另取150μL超纯水加入20μL体积比为1：1的甲醇-水，作为溶剂空白样品，涡旋混匀后，加入100μL体积比为1：1的甲酸水溶液，参考“1.2样品制备方法”操作，以1.3项方法分析。
表6甘草酸苷标准曲线配制浓度
Figure BDA0002537715720000091
Figure BDA0002537715720000101
a：10μL分析物的替代溶液(体积比为1：1的甲醇水溶液)；
线性考察结果：所有甘草酸苷标准曲线样品均当天配制，考察结果见表7，计算浓度的准确度均在标示值的±15％以内。以三次考察结果的甘草酸苷与内标峰面积比值均值为纵坐标，以甘草酸苷浓度为横坐标绘制标准曲线，见图1。
表7甘草酸苷在人血浆中的标准曲线(浓度单位：ng/mL)
Figure BDA0002537715720000102
由表7的数据可以看出，每次测试构建的标准曲线的相关系数均大于0.99，满足试验要求。
2.3、准确度和精密度
质控样品制备：分别配制高、中、低及定量下限浓度的质控标准溶液，其浓度依次分别为400.0ng/mL、60.0ng/mL、12.0ng/mL及4.0ng/mL，配制方法同甘草酸苷标准溶液。然后按上述血浆标样的制备方法制备质控浓度分别为20.0ng/mL、3.0ng/mL、0.6ng/mL及0.2ng/mL的质控样品，依下表8所列，每个浓度平行6个样品。按“1.2样品制备方法”操作，以1.3项方法分析。
要求：准确度均值一般在质控样品标示值的±15％内，定量下限准确度在标示值的±20％；精密度的变异系数一般不得超过15％，定量下限的变异系数不得过20％。准确度与精密度考察结果见表9，批内批间不同浓度的准确度与精密度均符合要求，表明本发明具有较高的特异性，能准确测定血浆中的甘草酸苷的浓度。
表8质控样品配制浓度
Figure BDA0002537715720000111
表9 HPLC-MS/MS法测定血浆中甘草酸苷的批内精密度和准确度考察结果
Figure BDA0002537715720000112
Figure BDA0002537715720000121
2.4、定量下限考察
结合信噪比和待测物响应，以及甘草酸苷临床血药浓度范围，本实验室考察建立分析方法的定量下限浓度为0.2ng/mL。
分析物加入空白血浆的具体操作为：取190μL空白血浆于1.5mL EP管中，加入10μL甘草酸苷标准溶液W1(甘草酸苷浓度4.000ng/mL)，涡旋混匀。按“1.2样品制备方法”操作，以1.3项方法分析。平行设置6个样品，考察结果如表10所列，本方法测定血浆最低定量限为0.2ng/mL，灵敏度高。
表10定量下限考察结果
Figure BDA0002537715720000131
2.5、稀释可靠性考察
分析物加入空白血浆的具体操作为：取380μL空白血浆于1.5mL EP管中，加入20μL质控标准溶液QW-5(甘草酸苷浓度2000ng/mL)，涡旋混匀。取上述混匀血浆样品40μL，加入空白血浆160μL稀释后，涡旋混匀，按“1.2样品制备方法”操作，以1.3项方法分析。考察结果如表11所示，结果表明本发明方法对于稀释后样品分析结果可靠准确。
表11稀释可靠性考察结果
Figure BDA0002537715720000132
2.6、基质效应
基质效应考察6个不同来源人的空白血浆。
不含基质的样品处理方法：加入150μL超纯水，添加20μL的体积比为1：1的甲醇水溶液；再加入100μL的体积比为1：1的甲酸水溶液，混匀后加入1000μL的乙酸乙酯涡旋混匀10min，再放入离心机，15700g离心10min；取700μL的上清液于96孔板中，氮气吹干后用200μL含甘草酸苷和依折麦布的体积比为1:1的甲醇水溶液复溶，使最终甘草酸苷和依折麦布的浓度同质控高、中、低质控浓度。
含基质样品的处理方法：加入150μL不同来源的空白血浆，添加20μl的体积比为1：1的甲醇水溶液；再加入100μL的体积比为1：1的甲酸水溶液，混匀后加入1000μL的乙酸乙酯涡旋混匀10min，再放入离心机，15700g离心10min；取700μL的上清液于96孔板中，氮气吹干后用200μL含甘草酸苷和依折麦布的体积比为1:1的甲醇水溶液复溶。最终甘草酸苷和依折麦布的浓度同质控高、中、低质控浓度。考察结果如表12所示，结果表明本方法无基质效应影响，对于血浆样品分析准确度高。
表12基质效应考察结果
Figure BDA0002537715720000141
Figure BDA0002537715720000151
2.7、回收率考察
提取后的样品处理方法：在1.5mL EP管中加入150μL含药血浆(浓度同高、中、低质控浓度)，添加20μL的依折麦布内标工作液；加入150μL含药血浆(浓度同高、中、低质控浓度)，再加入100μL的体积比为1：1的甲酸水溶液，混匀后加入1000μL的乙酸乙酯涡旋混匀10min，再放入离心机，15700g离心10min；取700μL的上清液于96孔板中，氮气吹干后用200μL体积比为1：1的甲醇水溶液复溶。
未提取样品处理方法：含基质样品的处理方法：在1.5mL EP管中加入150μL不同来源的空白血浆，添加20μL的体积比为1：1的甲醇水溶液；再加入100μL的体积比为1：1的甲酸水溶液，混匀后加入1000μL的乙酸乙酯涡旋混匀10min，再放入离心机，15700g离心10min；取700μL的上清液于96孔板中，氮气吹干后用200μL含甘草酸苷和依折麦布的体积比为1:1的甲醇水溶液复溶，甘草酸苷和依折麦布的浓度同提取样品浓度。考察结果如表13所示，结果表明甘草酸苷各浓度水平和内标依折麦布的回收率结果应一致、精密、重现性好，分析方法可靠。
表13回收率考察结果
Figure BDA0002537715720000152
Figure BDA0002537715720000161
2.8、稳定性
处理过程中基质样品的稳定性考察
样品处理方法：取380μL的空白血浆，加入20μL的高、低浓度的质控标液，涡旋混匀，每个浓度平行6份，于室温条件下放置23小时后，按“1.2样品制备方法”操作，以1.3项方法分析。所得结果见表14，结果表明甘草酸苷在室温条件下放置23小时后基质稳定。
表14处理过程中基质样品的稳定性考察结果
Figure BDA0002537715720000162
2.9、残留考察
样品处理方法：残留效应将在每个分析批中的每条标准曲线定量上限(ULOQ)样品后进空白样品来评价。残留样品处理同双空白样品。
接受标准：空白样品中待测物保留时间处残留峰峰面积不超过当批标准曲线中STD1(LLOQ浓度水平)峰面积的20％。空白样品中内标保留时间处残留峰峰面积不超过当批标准曲线中STD1(LLOQ浓度水平)内标峰面积的5％。考察结果如表15所示，各分析批中残留考察均符合接受标准。
表15残留考察结果
Figure BDA0002537715720000171
2.10人血浆样品检测
(1)取没有给予过甘草酸苷的人空白血浆150μL于EP管中，加入20μL的体积比为1：1的甲醇水溶液，混匀后加入100μL的体积比为1：1的甲酸水溶液，涡旋混合后加入1000μL乙酸乙酯。涡旋混匀10min，再放入离心机，15700g离心10min；取700μL的上清液于96孔板中，氮气吹干后用200μL的体积比为1：1的甲醇水溶液复溶，涡旋10min充分混匀后取10μL样品进行LC-MS/MS分析，结果如图2所示。
(2)取没有给予过甘草酸苷的人空白血浆190μL，加入10μL的甘草酸苷标准溶液(STD1)，混匀。精密移取150μL上述含甘草酸苷标准溶液的人血浆于EP管中，加入20μL的内标依折麦布溶液，混匀后加入100μL的体积比为1：1的甲酸水溶液，涡旋混合后加入1000μL乙酸乙酯。涡旋混匀10min，再放入离心机，15700g离心10min；取700μL的上清液于96孔板中，氮气吹干后用200μL的体积比为1：1的甲醇水溶液复溶，涡旋10min充分混匀后取10μL样品进行LC-MS/MS分析，结果如图3所示。
(3)采集健康受试者口服甘草酸苷药物后的血浆，取健康受试者口服甘草酸苷药物后的血浆150μL于EP管中，加入20μL的内标依折麦布溶液，混匀后加入100μL的体积比为1：1的甲酸水溶液，涡旋混合后加入1000μL乙酸乙酯。涡旋混匀10min，再放入离心机，15700g离心10min；取700μL的上清液于96孔板中，氮气吹干后用200μL的体积比为1：1的甲醇水溶液复溶，涡旋10min充分混匀后取10μL样品进行LC-MS/MS分析，结果如图4所示。结果显示在本发明方法所采用的色谱条件下，甘草酸苷保留时间为1.13min左右，内标依折麦布保留时间在2.53min左右，甘草酸苷和内标依折麦布的峰形良好，无杂峰干扰测定，基线平稳。
综上所述，本发明提供了一种预处理方法简便的血浆中甘草酸苷浓度的测定方法，采用一步有机溶液萃取法，适用于常规测定；同时，在本实验所采用的色谱条件下，甘草酸苷保留时间为1.13min左右，内标依折麦布保留时间在2.53min左右，甘草酸苷和内标依折麦布的峰形良好，无杂峰干扰测定，基线平稳；本方法具有较高的特异性，能准确测定血浆中的甘草酸苷的浓度，灵敏度高，血浆最低定量限为0.2ng/mL；同时，本发明方法快速、准确、灵敏度高、操作简便，为甘草酸苷的血药浓度测定提供依据。本方法的血浆标准曲线线性范围为0.2～30ng/mL，批内和批间精密度RSD均小于±15％。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种血浆中甘草酸苷的检测方法，其特征在于，采用超高效液相色谱-串联质谱进行检测，包括以下步骤：
(1)血浆样品预处理：取血浆样本，加入依折麦布内标工作溶液以及甲酸水溶液，混合，再加入萃取剂，离心，取上层清液并进行干燥后加入复溶液，得到待测样品；
(2)样品检测：将所述待测样品注入超高效液相色谱-串联质谱仪中进行检测；
其中，超高效液相色谱的流动相为：流动相A为0.2～0.4v/v％甲酸的乙腈溶液，流动相B为0.2～0.4v/v％甲酸的水溶液，进行梯度洗脱。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述流动相A为0.25～0.35v/v％甲酸的乙腈溶液，所述流动相B为0.25～0.35v/v％甲酸的水溶液。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述超高效液相色谱的色谱条件包括：
色谱柱：Waters ACQUITY
Figure FDA0002537715710000011
BEH C18；色谱柱规格：粒径1.7±0.2μm，直径×长度：2.1±0.2mm×100±2mm；
色谱柱温度：35±2℃；
流速：0.40±0.02mL/min；
进样量：10±1μL；
自动进样器温度：5～7℃；
洗针液：强洗液：体积百分比为90±5：10的乙腈和水混合液，弱洗液：体积百分比为10±5：90的乙腈和水混合液。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述梯度洗脱的条件为：
0～1.6min，流动相A 43～47％，流动相B 53～57％；
1.6～2.80min，流动相A 43～47％→93～97％，流动相B 53～57％→3～7％；
2.80～3.5min，流动相A 93～97％，流动相B 3～7％；
3.5～4.3min，流动相A 93～97％→43％～47％，流动相B 3～7％→53～57％。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述质谱的色谱条件包括：
离子源：电喷雾离子源，负离子模式下以MRM进行扫描；
喷雾电压为-4500±50V；
雾化气温度为600±10℃；
雾化气压力为50±5Psi；
辅助加热气压力为50±5Psi；
气帘气压力为30±3Psi；
碰撞气压力为9±1psi；
碰撞室入口电压为-10±1eV；
碰撞室出口电压为-13±1eV。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，甘草酸苷选择离子对：m/z 821.3→m/z 351.1；依折麦布选择离子对：m/z 408.2→m/z 271.2。
7.根据权利要求1～6任一项所述的检测方法，其特征在于，所述依折麦布内标工作溶液中依折麦布内标的浓度为18～22ng/mL；
和/或，所述血浆样本包含抗凝剂肝素钠。
8.根据权利要求1～6任一项所述的检测方法，其特征在于，所述甲酸水溶液中甲酸与水的体积比为0.8～1.2：1；
和/或，所述复溶液为甲醇水溶液，所述复溶液中甲醇与水的体积比为0.8～1.2：1；
和/或，所述萃取剂为乙酸乙酯；
和/或，所述血浆为人的血浆。
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，
所述血浆样品、依折麦布内标工作溶液、甲酸水溶液和萃取剂的体积比为15：1～3：8～12：50～150；
和/或，所述上清液和复溶液的体积比为：5～9：2。
10.根据权利要求1～6任一项所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法还包括如下步骤：采用内标法进行定量计算，以甘草酸苷和依折麦布内标的峰面积比值带入标准曲线方程计算血浆样品中甘草酸苷的浓度。
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