CN117517541A - 一种测定血浆中双甘肽浓度的方法 - Google Patents

一种测定血浆中双甘肽浓度的方法 Download PDF

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Abstract

本申请公开了一种测定血浆中双甘肽浓度的方法，涉及仪器分析技术领域。一种测定血浆中双甘肽浓度的方法，其包括如下步骤：血浆样品处理：取血浆样品，加入内标工作液混合后再加入1％FA/ACN混合后离心处理；离心处理后取上清液至磷脂去除板，放置于正压萃取装置上施加正压，收集萃取液并转移至EP管，于氮气流下吹干并复溶；固相萃取：将上述血浆样品处理步骤中复溶后的样品装载于固相萃取柱上进行固相萃取并洗脱，收集洗脱液至EP管，于氮气流下吹干并复溶，然后离心处理，取上清液作为待测样品；仪器检测：使用LC‑MS/MS仪器对上述待测样品进行检测。其检测灵敏度高、专属性强，适用于大批量样本测定，检测效果好。

Description

一种测定血浆中双甘肽浓度的方法
技术领域
本申请涉及仪器分析技术领域，具体涉及一种测定血浆中双甘肽浓度的方法。
背景技术
双甘肽(Glycylglycine，Gly-Gly)是一种简单的二肽，由两个甘氨酸分子通过肽键连接而成，分子量为132.12g/mol。双甘肽是白色固体，通常以粉末形式存在。双甘肽具有氨基基团和羧基基团，因此可以表现出酸碱性。在水中，它可以作为两个氨基酸残基的共轭酸和碱，可以接受或释放质子。虽然双甘肽通常在生物体内不扮演重要的生物学角色，但它在实验室研究中经常被用作模拟肽链的部分结构，以研究蛋白质折叠、酶活性、分子相互作用等生物化学过程。此外双甘肽在生物研究及医药上被用作血液保存和蛋白质药物细胞色素C水针剂的稳定剂，同时可用来测定双甘肽二肽酶的底物，以及合成多肽。并且，双甘肽作为一种短肽，其与过渡金属的相互作用在许多生物工程和药物化学等领域具有关键性的作用。双甘肽的分析和检测也可以用于生物医学研究中，例如在血浆或尿液中检测它的浓度可能与某些代谢性疾病或肾脏功能有关，有助于疾病的诊断和监测。
在血浆样品的分析检测过程中，血浆中含有蛋白质、脂肪、磷脂等物质，这些物质容易随同待测物从色谱柱上一起被洗脱出来，经离子源气化，进入质谱进行检测分析。而就在液滴气化、发生库伦爆炸变成小液滴直至产生气体离子的过程中，这些物质由于极性较大，会同待测物离子竞相竞争液滴表面，从而导致待测物的离子化效率降低或增强，引起响应降低或增高，产生基质效应，进而容易对样品的检测带来不利影响。
目前针对血浆中双甘肽浓度的有效的检测方法较为稀缺，而双甘肽浓度检测对疾病的诊断和检测又具有积极作用，为此，需要提供一种有效的方法来测定血浆中的双甘肽浓度。
发明内容
本申请的目的在于提供一种测定血浆中双甘肽浓度的方法，其检测灵敏度高、专属性强，适用于大批量样本测定，检测效果好。
本申请的技术方案如下：
本申请实施例提供了一种测定血浆中双甘肽浓度的方法，其包括如下步骤：
血浆样品处理：取血浆样品，加入内标工作液混合后再加入1％ FA/ACN混合后离心处理；离心处理后取上清液至磷脂去除板，放置于正压萃取装置上施加正压，收集萃取液并转移至EP管，于氮气流下吹干并复溶；
固相萃取：将上述血浆样品处理步骤中复溶后的样品装载于固相萃取柱上进行固相萃取并洗脱，收集洗脱液至EP管，于氮气流下吹干并复溶，然后离心处理，取上清液作为待测样品；
仪器检测：使用LC-MS/MS仪器对上述待测样品进行检测。
进一步的，在本申请的一些实施例中，上述磷脂去除板采用沃特世Ostro ProteinPrecipitation&Phospholipid Removal Plate；施加正压进行萃取后，使用96孔样品收集板收集萃取液，再将萃取液转移至EP管。
进一步的，在本申请的一些实施例中，上述血浆样品处理步骤中，血浆样品、内标工作液的混合物与所加入的1％ FA/ACN的体积比为1：3。
进一步的，在本申请的一些实施例中，上述血浆样品处理步骤中，取血浆样品80μL，加入20μL内标工作液，混合后再加入300μL的1％ FA/ACN。
进一步的，在本申请的一些实施例中，上述血浆样品处理步骤中，以12000rpm的转速离心处理10min；于正压萃取装置施加5min的5psi正压；于40℃氮气流下吹干2h，再用1ml的1％ FA/H2O复溶。
进一步的，在本申请的一些实施例中，上述固相萃取步骤中，采用P-SCX固相萃取柱，规格为10mg/1ml；萃取柱使用1ml的MeOH活化，使用1ml的1％ FA/H2O平衡；萃取后使用1ml的1％ FA/MeOH洗涤，采用2％的NH4OH/MeOH洗脱。其中，P-SCX是一种聚合物基质的具有强阳离子交换功能和反相色谱固定相的疏水作用的混合吸附剂，含有强酸性的磺酸功能基团。
进一步的，在本申请的一些实施例中，上述固相萃取步骤中，于40℃氮气流下吹干2h，再用100μL的50％ ACN/H2O复溶；以12000rpm的转速离心处理5min。
进一步的，在本申请的一些实施例中，上述仪器检测步骤中，使用LC-MS/MS仪器进行检测时，液相色谱的检测条件为：流动相A为0.1％的FA/H2O，流动相B为ACN，柱温40℃，进样体积为2.00μL，流速为0.3mL/min，梯度洗脱15min；
其采用WELCH Ultimate UHPLC HILIC AmphionⅡ(2.1×100mm，3μm)色谱柱，以0.1％ FA/H2O和ACN作为流动相进行梯度洗脱，双甘肽保留时间为7.8min。
进一步的，在本申请的一些实施例中，上述仪器检测步骤中，液相色谱梯度洗脱程序为：0～10min，流动相A比例由5％升至50％，流动相B比例由95％降至50％；10～12min，维持各相50％的比例；12～12.5min，流动相A比例由50％降至5％，流动相B比例由50升至95％；12.5～15min，维持5％流动相A和95％流动相B。。
具体的，梯度洗脱程序如表1所示：
表1
时间/min 流动相A/％ 流动相B/％
0 5 95
1 5 95
10 50 50
12 50 50
12.5 5 95
15 5 95
进一步的，在本申请的一些实施例中，上述仪器检测步骤中，使用LC-MS/MS仪器进行检测时，质谱条件为：正离子模式，气体温度为350℃，气体流量为14L/min；毛细管电压为5500V(±)；喷嘴电压为500V；iFunnel H电压为150V(±)；扫描方式为多重反应监测；用于定量分析的双甘肽离子对为m/z＝133.06→m/z＝76。
进一步的，在本申请的一些实施例中，上述血浆样品处理步骤中，内标为2-氯苯丙氨酸。
相对于现有技术，本申请的实施例至少具有如下优点或有益效果：
针对上述方面，本申请实施例提供了一种测定血浆中双甘肽浓度的方法，其步骤包括血浆样品处理、固相萃取和仪器检测，其能够快速、准确的对血浆中双甘肽的浓度进行检测，且能够有效降低血浆基质效应，其双甘肽最低定量限为15.625ng/mL，灵敏度高，专属性强，样品用量及进样量小，适用于大批量样本检测。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本申请的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本申请试验例中2-氯苯丙氨酸的离子色谱图；
图2为本申请试验例中双甘肽的离子色谱图；
图3为本申请试验例中血浆加入双甘肽标准品和内标2-氯苯丙氨酸后的质谱图；
图4为本申请试验例中双甘肽标准曲线图。
具体实施方式
为使本申请实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
需要说明的是，术语“包括”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括……”限定的要素，并不排除在包括要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
下面结合实施例对本申请的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例
本实施例提供了一种测定血浆中双甘肽浓度的方法，其包括如下步骤：
标准曲线样品和质控样品制备：称量1mg双甘肽标准品，用1ml H2O溶解，制备成1mg/ml双甘肽储备液；用H2O以1：4的比例梯度稀释双甘肽储备液，制备配制标准曲线样品及质控样品的标准品储备液。然后取20μl各浓度标准品储备液与80μl空白血浆混合，配制浓度为15.625ng/ml、62.5ng/ml、250ng/ml、1000ng/ml、4000ng/ml和160000ng/ml的标准曲线样品，以及浓度为62.5ng/ml(LQC)、250ng/ml(MQC)和1000ng/ml(HQC)的质控样品。
血浆样品处理：取80μL血浆样品，加入20μL内标工作液混合后再加入300μL的1％FA/ACN混合后，以12000rpm的转速离心处理10min；离心处理后取上清液至磷脂去除板，放置于正压萃取装置上施加5min的5psi正压，用96孔样品收集板收集萃取液并转移至1.5ml的EP管，于40℃氮气流下吹干2h，再用1ml的1％ FA/H2O复溶；其中，磷脂去除板采用沃特世Ostro Protein Precipitation&Phospholipid Removal Plate。
对上述标准曲线和质控样品制备步骤中得到的标准曲线样品和质控样品分别采用与血浆样品相同的处理方法进行处理，用量及相关参数均相同。
其中，所上述内标为2-氯苯丙氨酸。
固相萃取：对P-SCX固相萃取柱使用1ml的MeOH活化，1ml的1％ FA/H2O平衡，然后上样于上述血浆样品处理步骤中进行复溶后的样品，待样品自然流尽后施加正压确保样品全部流经固相萃取柱，再用1ml的1％ FA/MeOH洗涤，最后用1ml的2％ NH4OH/MeOH洗脱；洗脱液收集于1.5ml的EP管，于40℃氮气流下吹干2小时，再用100μL的50％ACN/H2O复溶，再以12000rpm的转速离心处理5min，取80μL上清液装入LC-MS/MS检测样品瓶，待进样。
仪器检测：使用LC-MS/MS仪器对经过上述固相萃取步骤处理后的样品进行检测；检测时，液相色谱条件如下：
色谱柱为WELCH Ultimate UHPLC HILIC AmphionⅡ(2.1×100mm，3μm)；
流动相A为0.1％ FA/H2O；
流动相B为ACN，柱温为40℃；
进样体积为2.00μL，流速为0.3mL/min，梯度洗脱15min；
梯度洗脱程序如表2所示：
表2
时间/min 流动相A/％ 流动相B/％
0 5 95
1 5 95
10 50 50
12 50 50
12.5 5 95
15 5 95
质谱条件如下：
离子模式：正离子模式；
气体温度：350℃，气体流量：14L/min；
毛细管电压：5500V(±)，喷嘴电压：500V，iFunnel H电压：150V(±)；
扫描方式为多重反应监测；
用于定量分析的双甘肽离子对为m/z＝133.06→m/z＝76。
标准曲线绘制：以标准曲线样品的浓度为横坐标，以标准曲线样品双甘肽与内标的峰面积比为纵坐标，绘制标准曲线，得到线性回归方程。由于标准曲线样品制备使用的空白血浆含有一定浓度内源性双甘肽，因此样品双甘肽浓度由双甘肽与内标样品峰面积之比/标准曲线斜率计算得出。
试验例：
采用实施例1所提供的一种测定血浆中双甘肽浓度的方法对血浆样品进行检测，检测所用的仪器设备及耗材如下：
沃特世96孔正压装置；
上海乔跃固相萃取仪；
Labconco CentriVap真空离心浓缩仪；
Labconco CentriVap台式真离心浓缩；
Eppendorf 5920R离心机；
超高液相色谱-三重四极杆串联质谱仪(Agilent 1290Infinity II-6495C，安捷伦科技)配备Agilent MassHunter数据采集软件和Quantitative Analysis定量软件进行数据处理。
其中，2-氯苯丙氨酸的离子色谱图如图1所示，双甘肽的离子色谱图如图2所示，血浆加入双甘肽标准品(上)和内标2-氯苯丙氨酸(下)后的质谱图如图3所示；
绘制得到的标准曲线如图4所示，双甘肽的回归方程为Y＝0.003983*X+0.052523(R＝0.9998)，双甘肽在15.625ng/ml-16000ng/ml范围内线性良好。
精密度测试：
连续3天测定3种浓度(1000ng/ml、250ng/ml、62.5ng/ml)的质控样品(HQC、MQC、LQC)，用于评价日内、日间精密度。
结果如表3所示：双甘肽的日内、日间精密度(CV，％)分别为4.44％-10.12％和3.09％-8.50％，均在可接受范围内。
表3
回收率测试：
分析质控样品(HQC、MQC、LQC)各3个。同时另取3份空白血浆80μL，按实施例1方法进行样品处理和LC-MS/MS分析，计算质控样品和空白血浆双甘肽浓度。由于空白血浆中含有内源性双甘肽，回收率＝(质控样品双甘肽浓度-空白血浆样品双甘肽平均浓度)/添加标准品浓度。
结果如表4所示，回收率为91.20％-105.42％，在可接受范围内。
表4
基质效应测试：
采用样品处理后加入法评估基质效应，取4组空白血浆，按实施例1中血浆样品处理步骤的方法进行样品处理，处理后其中三组加入分别加入高、中和低浓度标准品储备液(0.3125μg/ml、1.25μg/ml和5μg/ml)，最后一组不加入标准品测定空白血浆双甘肽峰面积。样品混匀后取80μL装入LC-MS/MS样品瓶。同时制备与上述样品浓度相同的以水溶液为基质的样品，一同进行LC-MS/MS分析，以双甘肽峰面积之比评估基质效应。
由于空白血浆含有一定量内源性双甘肽，因此血浆处理后加标样品双甘肽峰面积为扣除空白血浆双甘肽峰面积后的结果。
结果如表5所示，该方法的基质效应为69.8％-79.5％，在可接受范围内。
表5
稳定性测试：
取3个质控样品(HQC)于当天按实施例1方法进行样品处理并进行LC-MS/MS分析。另取同样的质控样品以3个为一组分别于室温放置12小时；－4℃冰箱放置48小时；-20℃冰箱存放7日；-80℃冰箱存放30日；以及反复冻融三个循环。每组保存时间结束后解冻，于解冻当日按实施例1进行样品处理并进行LC-MS/MS分析。
通过比较未冻存和冻存样品双甘肽浓度，考察处理前样品稳定性。
另取3份标准品储备液按实施例1方法中的仪器检测步骤进行LC-MS/MS分析，然后将其放置于-80℃冰箱冻存30日后解冻后，再次按实施例1方法中的仪器检测步骤进行LC-MS/MS分析，考察储备液冻存稳定性。
结果如表6所示，测量值采用单因素方差分析，统计分析结果显示P>0.05，样品测量值无显著差异，表明血浆中的分析物能在室温稳定至少12小时；在-4℃稳定至少48小时；在-20℃至少稳定7天；在-80℃至少稳定30天。同时标准品储备液至少能在-80℃稳定30天。
表6
综上，本申请实施例提供了一种测定血浆中双甘肽浓度的方法，其能够快速、准确的对血浆中双甘肽的浓度进行检测，且能够有效降低血浆基质效应；其双甘肽最低定量限为15.625ng/mL，灵敏度高；采用WELCH Ultimate UHPLC HILIC AmphionⅡ(2.1×100mm，3μm)色谱柱，以0.1％ FA/H2O和ACN作为流动相，梯度洗脱，双甘肽保留时间为7.8min，专属性强；仅需使用80μl血浆，血浆样品采用商业化蛋白质和磷脂去除板和固相萃取柱进行前处理，LC-MS/MS进样仅2μL，可适用于大批量样本测定，适用于大批量样本检测，适用性强；其双甘肽最低定量限为15.625ng/mL，灵敏度高。
以上所描述的实施例是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。本申请的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本申请的范围，而是仅仅表示本申请的选定实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

Claims (10)

1.一种测定血浆中双甘肽浓度的方法，其特征在于，其包括如下步骤：
血浆样品处理：取血浆样品，加入内标工作液混合后再加入1％FA/ACN混合后离心处理；离心处理后取上清液至磷脂去除板，放置于正压萃取装置上施加正压，收集萃取液并转移至EP管，于氮气流下吹干并复溶；
固相萃取：将所述血浆样品处理步骤中复溶后的样品装载于固相萃取柱上进行固相萃取并洗脱，收集洗脱液至EP管，于氮气流下吹干并复溶，然后离心处理，取上清液作为待测样品；
仪器检测：使用LC-MS/MS仪器对所述待测样品进行检测。
2.根据权利要求1所述的一种测定血浆中双甘肽浓度的方法，其特征在于，所述血浆样品处理步骤中，血浆样品、内标工作液的混合物与所加入的1％FA/ACN的体积比为1：3。
3.根据权利要求1所述的一种测定血浆中双甘肽浓度的方法，其特征在于，所述血浆样品处理步骤中，取血浆样品80μL，加入20μL内标工作液，混合后再加入300μL的1％FA/ACN。
4.根据权利要求1所述的一种测定血浆中双甘肽浓度的方法，其特征在于，所述血浆样品处理步骤中，以12000rpm的转速离心处理10min；于正压萃取装置施加5min的5psi正压；于40℃氮气流下吹干2h，再用1ml的1％FA/H2O复溶。
5.根据权利要求1所述的一种测定血浆中双甘肽浓度的方法，其特征在于，所述固相萃取步骤中，采用P-SCX固相萃取柱，规格为10mg/1ml；萃取柱使用MeOH活化，使用1％的FA/H2O平衡；萃取后使用1％的FA/MeOH洗涤，采用2％的NH4OH/MeOH洗脱。
6.根据权利要求1所述的一种测定血浆中双甘肽浓度的方法，其特征在于，所述固相萃取步骤中，于40℃氮气流下吹干2h，再用100μL的50％ACN/H2O复溶；以12000rpm的转速离心处理5min。
7.根据权利要求1所述的一种测定血浆中双甘肽浓度的方法，其特征在于，所述仪器检测步骤中，使用LC-MS/MS仪器进行检测时，液相色谱的检测条件为：流动相A为0.1％的FA/H2O，流动相B为ACN，柱温40℃，进样体积为2.00μL，流速为0.3mL/min，梯度洗脱15min。
8.根据权利要求7所述的一种测定血浆中双甘肽浓度的方法，其特征在于，所述仪器检测步骤中，液相色谱梯度洗脱程序为：0～10min，流动相A比例由5％升至50％，流动相B比例由95％降至50％；10～12min，维持各相50％的比例；12～12.5min，流动相A比例由50％降至5％，流动相B比例由50升至95％；12.5～15min，维持5％流动相A和95％流动相B。
9.根据权利要求1所述的一种测定血浆中双甘肽浓度的方法，其特征在于，所述仪器检测步骤中，使用LC-MS/MS仪器进行检测时，质谱条件为：正离子模式，气体温度为350℃，气体流量为14L/min；毛细管电压为5500V，喷嘴电压为500V；扫描方式为多重反应监测；用于定量分析的双甘肽离子对为m/z＝133.06→m/z＝76。
10.根据权利要求1所述的一种测定血浆中双甘肽浓度的方法，其特征在于，所述血浆样品处理步骤中，内标为2-氯苯丙氨酸。
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