CN111896651A - 一种白眉蝮蛇蛇毒类凝血酶特征多肽及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及化学分析检测及应用领域，特别涉及一种白眉蝮蛇蛇毒类凝血酶特征多肽及其应用。一种白眉蝮蛇蛇毒类凝血酶特征多肽，氨基酸序列为TLCAGVMEGGIDTCNR。使用上述特征多肽表征待测样品中蛇毒类凝血酶的种属来源和含量采用以下步骤：取待测样品经过胰蛋白酶酶解预处理，取酶解液上清作为供试品溶液；将上述供试品溶液和对照品溶液注入液相色谱‑质谱仪，选择定性离子对和定量离子对，对待测样品中蛇毒类凝血酶的种属来源和含量进行检测；该方法简便快捷，定量准确，填补了白眉蝮蛇蛇毒的质量标准的空白，提高了质量控制水平。

Description

一种白眉蝮蛇蛇毒类凝血酶特征多肽及其应用
技术领域
本发明涉及化学分析检测及应用领域，特别涉及一种白眉蝮蛇蛇毒类凝血酶特征多肽及其应用。
背景技术
白眉蝮蛇（Agkistrodon halys）是我国的特有蛇种，主要分布在我国东北长白山山区，也被称为蝮蛇乌苏里亚种。以白眉蝮蛇蛇毒为原料提取的蛇毒血凝酶是一种具有精氨酸酯酶和酰氨酶活性的丝氨酸蛋白酶，可在凝血过程中发挥重要作用，因其结构和功能与人类凝血酶相似，故称“类凝血酶”。在临床上主要用于出血性疾病的治疗，特别是毛细血管的出血，可明显缩短患者的出血时间，减少出血量。因其具有高效、速效、长效、方便、安全、不被凝血酶抑制剂影响等优点而成为临床医生在处理出血性疾病时的主要选择。目前，国内上市的蛇毒血凝酶类产品主要来自矛头蝮蛇、尖吻蝮蛇、蝰蛇和白眉蝮蛇，由于不同蛇种来源的类凝血酶结构不同，其作用机制不同，相应的药理作用也存在差异，因此建立一种专属性强、灵敏度高的方法来表征其种属来源及含量对于控制蛇毒血凝酶类产品的质量意义重大。
蛇毒是由蛇的毒腺分泌的一种复杂混合物，含有多种蛋白质、多肽、核苷、酶类、金属离子和其它小分子物质。蛇毒可能是自然界所有毒素中最复杂的一类物质,蛇毒液中富含微量但种类多达50多种的蛋白水解酶。现有白眉蝮蛇蛇毒的质量标准未控制其种属来源，无专属性检测类凝血酶含量的方法。现报道的表征蛇毒中类凝血酶含量的方法主要为凝胶电泳法和效价测定法，测定方法繁琐且准确性差，导致无法准确表征蛇毒的质量。因此建立一种方便快捷，定量准确的白眉蝮蛇蛇毒类凝血酶定性定量方法具有广泛的社会效益和经济效应。
发明内容
为克服现有技术的缺陷，本发明提供了一种白眉蝮蛇蛇毒类凝血酶特征多肽，以及其在表征待测样品中蛇毒类凝血酶的种属来源和含量方面的技术应用，该技术方法简便快捷，定量准确，填补了白眉蝮蛇蛇毒质量标准的空白，提高了质量控制水平。
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
一种白眉蝮蛇蛇毒类凝血酶特征多肽，氨基酸序列为TLCAGVMEGGIDTCNR。
进一步地，一种上述白眉蝮蛇蛇毒类凝血酶特征多肽的应用，使用上述特征多肽对待测样品中蛇毒类凝血酶的种属来源和/或含量进行检测，采用以下步骤：
（1）取待测样品经过胰蛋白酶酶解预处理，取酶解液上清作为供试品溶液；
（2）取白眉蝮蛇蛇毒特征多肽对照品经过胰蛋白酶酶解预处理，制备系列浓度的对照品溶液；
（3）取步骤（1）所述的供试品溶液和步骤（2）所述的对照品溶液分别注入液相色谱-质谱仪，采用电喷雾正离子模式，进行多反应监测，以质荷比m/z 双电荷877.4→550.2和双电荷877.4→892.4作为定性离子对，以双电荷877.4→892.4作为定量离子对；
（4）在以定性离子对和定量离子对提取的供试品溶液色谱图中，如呈现与对照特征多肽色谱保留时间一致的色谱峰，则表明待测样品含有氨基酸序列TLCAGVMEGGIDTCNR，证明待测样品来源于白眉蝮蛇；反之，则为非白眉蝮蛇来源。
（5）提取离子双电荷877.4→892.4色谱图，以对照品系列标准溶液中特征多肽的浓度为横坐标，以对应的峰面积为纵坐标，计算线性回归方程，r>0.99，从回归方程求计算供试品溶液浓度，进而计算待测样品中类凝血酶含量。
进一步地，所述白眉蝮蛇蛇毒特征多肽检出限为2 ng/mL，定量限为6 ng/mL。
进一步地，步骤（1）所述经过胰蛋白酶酶解预处理的具体操作为：取待测样品20mg，置10 mL量瓶中，用25 mmol/L碳酸氢铵溶液溶解并定容；量取200 μL，加0.2 mol/L二硫苏糖醇溶液10 μL，混匀，60℃反应60 min，加0.2 mol/L碘乙酰胺溶液20 μL，避光反应30min，加25 mmol/L碳酸氢铵溶液760 μL和0.4 mg/mL 胰蛋白酶溶液10 μL，37℃酶解90min，90℃灭活10 min，放冷至室温，1200 rpm离心10 min得上清液。
进一步地，步骤（2）所述经过胰蛋白酶酶解预处理的具体操作为：取特征多肽对照品10 mg，精密称定，置100 mL容量瓶中，用25 mmol/L碳酸氢铵溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，分别精密量取0.1 mL、0.25 mL、0.5 mL、1 mL、2 mL，分别置100 mL量瓶中，用25 mmol/L碳酸氢铵溶液稀释至刻度，摇匀；分别量取200 μL，加0.2 mol/L二硫苏糖醇溶液10 μL，混匀，60℃反应60 min，加0.2 mol/L碘乙酰胺溶液20 μL，避光反应30 min，加25 mmol/L碳酸氢铵溶液760 μL和0.4 mg/mL 胰蛋白酶溶液10 μL，37℃酶解90 min，90℃灭活10 min，放冷至室温，1200 rpm离心10 min得上清液。
进一步地，所述液相色谱-质谱仪中液相和质谱检测条件如下：
液相条件：Waters ACQUITY UPLC BEH C18，色谱柱 50 mm×2.1 mm，1.7 μm；柱温：40℃；进样量：2 μL；流速：0.2 mL/min；流动相A为0.1%甲酸溶，B为0.1%甲酸乙腈，进行梯度洗脱，洗脱程序：0→1 min，流动相A 80%；1→5 min，流动相A 80%→10%；5→7 min，流动相A10%→10%；
质谱条件：电喷雾离子源，正离子扫描模式，多反应监测；涡旋离子喷雾温度500℃；离子化电压：5.5 kV；碰撞室出口电压10 V；入口电压EP 10V；碰撞能量CE均为45 V，去簇电压DP为135 V。
上述方法中，所述待测样品为蛇毒。
本发明的有益效果：
（1）经大量实验研究及蛋白质数据库比对，寻找到了白眉蝮蛇蛇毒类凝血酶的特征多肽段（TLCAGVMEGGIDTCNR），由于已知矛头蝮蛇、蝰蛇和尖吻蝮蛇等蛇种的类凝血酶氨基酸序列中不含该段氨基酸序列，因此可用于检测待测样品中蛇毒类凝血酶的种属来源和含量。
（2）本发明公开的定性定量方法简便快捷，定量准确，填补了白眉蝮蛇蛇毒质量标准的空自，可以大大提高白眉蝮蛇蛇毒的质量控制水平，确保白眉蝮蛇蛇毒类凝血酶产品临床用药的有效性和安全性。
附图说明
图1白眉蝮蛇蛇毒类凝血酶特征多肽一级质谱图；
图2白眉蝮蛇蛇毒类凝血酶特征多肽二级质谱图；
图3专属性考察图谱；
图4线性及范围图谱；
图5检出限与定量限图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明：
下述实施例中相关试剂试药及溶液的制备方法如下：
（1）试剂：胰蛋白酶（Sigma，批号SLBS8956）、白眉蝮蛇蛇毒类血凝（锦州奥鸿药业，纯度为98.5%）、盐酸胍（VETEC，批号WXBC4261V）、三羟基氨基甲烷（沪市，批号20181206）、二硫苏糖醇（BBI Life Sciences，批号D911BA0011）、碘乙酰胺（BBI Life Sciences，批号B326BA1943），其它试剂均为分析纯。
（2）25 mmol/L碳酸氢铵溶液：称取79.06 mg 碳酸氢铵，加40 mL水溶解，即得。
（3）二硫苏糖醇（DTT）溶液：称取15.42 mg 二硫苏糖醇，加500 μL水溶解，即得。
（4）碘乙酰胺（IA）溶液（临用新制）：称取18.5 mg碘乙酰胺，加500 μL水溶解，即得。
（5）0.4 mg/mL胰蛋白酶溶液（临用新制）：称取胰蛋白酶8.0 mg，加20 mL水溶解，即得。
实施例1
白眉蝮蛇类凝血酶特征多肽的筛选和确定
1 仪器设备
Thermo Fusion高分辨质谱仪（Thermo Fisher Scientific，美国），EASY-nLC 1000纳升液相色谱仪（Thermo Fisher Scientific，美国），CP225D电子天平（Sartorius，德国），Sigma 3-30 K冷冻离心机(Sigma, 德国)，密理博Milli-QAdvantage A10超纯水仪（Millipore，美国）
2 色谱质谱条件
色谱柱：实验室自制0.2 mm × 3.5 cm（5 μm粒径）的 ReproSil-Pur C18-AQ Trapcolumn脱盐富集，采用实验室自制75 μm × 25 cm（3 μm粒径）的 ReproSil-Pur C18-AQ纳升分析柱分离。流动相A为2% 乙腈的0.1% 甲酸水溶液；流动相B为98% 乙腈的0.1% 甲酸水溶液。纳升分离泵流速为300 nL/min，梯度洗脱设置见下表1。
Figure 193200DEST_PATH_IMAGE001
质谱条件：采用正离子模式进行分析，喷雾电压为2.0 kV，离子传输毛细管温度为275℃，S-Lens传输效率设置为60%。一级质谱采用Orbitrap作为质量分析器，分辨率为60,000，采集范围为350-1650。二级质谱采用IT作为质量分析器，采用Rapid Scan模式进行扫描，利用Top20数据依赖模式进行母离子选择，采用HCD模式进行碎裂，碎裂能量NCE设置为35%。
3.数据采集
取白眉蝮蛇蛇毒类血凝5 mg，置10 mL量瓶中，用25 mmol/L碳酸氢铵溶液溶解并定容；精密量取200 μL，加0.2 mol/L二硫苏糖醇溶液10 μL，混匀，60℃反应1小时，加0.2 mol/L碘乙酰胺溶液20 μL，避光放置30 min，加25 mmol/L碳酸氢铵溶液760 μL和0.4 mg/mL 胰蛋白酶溶液（临用新制）10 μL，37℃反应90 min，90℃灭活10 min，放冷至室温，1200 rpm离心10 min，取上清液作为供试品溶液，采用纳升液相分离进样，利用高分辨质谱采集一级和二级质谱图。
4.搜库筛选及确定
使用NCBI和UniProt，对相关蛇蛋白库和毒液蛋白库进行整合，建立蛇及毒液数据库。通过Uniprot提供的Peptidemass功能模拟胰蛋白酶酶解不同物种蛇毒类凝血酶蛋白的结果，并通过将白眉蝮蛇类凝血酶蛋白序列与其他物种的序列比对获得白眉蝮蛇相对于其他物种的特征性多肽序列，并使用Proteome Discoverer软件（2.2版）对质谱数据搜库，参照(1)8~25氨基酸、(2)尽量避免易发生人为修饰的肽段、(3)酶切时无漏切位点等原则，结合质谱响应和分离情况，确定“TLCAGVMEGGIDTCNR”可作为白眉蝮蛇类凝血酶的特征多肽。检测结果显示特征肽的分子量和二级质谱都与理论值相符，见图1和图2。
实施例2
多反应监测（MRM）定性定量分析样品中的白眉蝮蛇类凝血酶。
1.仪器设备
SCIEX Triple Quad 6500三重四级杆质谱仪，CP225D电子天平（Sartorius，德国），Sigma 3-30 K冷冻离心机(Sigma， 德国)，密理博Milli-QAdvantage A10超纯水仪（Millipore，美国）。
2.色谱质谱条件
液相条件：Waters ACQUITY UPLC BEH C18 色谱柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱温：40℃；进样量：2 μL；流速：0.2 mL/min；流动相A为0.1%甲酸溶，B为0.1%甲酸乙腈，进行梯度洗脱，洗脱程序：0→1 min，流动相A 80%；1→5 min，流动相A 80%→10%；5→7 min，流动相A10%→10%。
质谱条件：电喷雾离子源，正离子扫描模式，多反应监测；以质荷比（m/z) 877.4(双电荷)→892.4为定量离子对，以m/z 877.4(双电荷)→550.2为定性离子对；涡旋离子喷雾温度500℃；离子化电压：5.5 kV；碰撞室出口电压10 V；入口电压EP 10V；碰撞能量（CE）均为45 V，去簇电压（DP）为135 V。
3.溶液制备
3.1 对照品溶液制备
取实施例1筛选得到的特征多肽对照品10 mg，精密称定，置100 mL容量瓶中，用25mmol/L碳酸氢铵溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，分别精密量取0.1 mL、0.25 mL、0.5 mL、1mL、2 mL，分别置100 mL量瓶中，用25 mmol/L碳酸氢铵溶液稀释至刻度，摇匀；分别精密量取200 μL，加0.2 mol/L二硫苏糖醇溶液10 μL，混匀，60℃反应1小时，加0.2 mol/L碘乙酰胺溶液20 μL，避光放置30分钟，加25 mmol/L碳酸氢铵溶液760 μL和0.4 mg/mL 胰蛋白酶溶液10 μL，37℃反应90分钟，90℃酶解10分钟，放冷至室温，1200 rpm离心10分钟，取上清液作为对照品系列标准溶液。
3.2供试品溶液制备
取待测样品20 mg，置10 mL量瓶中，用25 mmol/L碳酸氢铵溶液溶解并定容；精密量取200 μL，加0.2 mol/L二硫苏糖醇溶液10 μL，混匀，60℃反应1小时，加0.2 mol/L碘乙酰胺溶液20 μL，避光放置30分钟，加25 mmol/L碳酸氢铵溶液760 μL和0.4 mg/mL 胰蛋白酶溶液（临用新制）10 μL，37℃反应90分钟，90℃酶解10分钟，放冷至室温，1200 rpm离心10分钟，取上清液作为供试品溶液。
3.3空白溶液制备
精密量取25 mmol/L碳酸氢铵溶液200 μL，加0.2 mol/L二硫苏糖醇溶液10 μL，混匀，60℃反应1小时，加0.2 mol/L碘乙酰胺溶液20 μL，避光放置30分钟，加25 mmol/L碳酸氢铵溶液760 μL和0.4 mg/mL 胰蛋白酶溶液（临用新制）10 μL，37℃反应90分钟，90℃酶解10分钟，放冷至室温，1200 rpm离心10分钟，取上清液作为空白溶液。
4.测定法
取上述待测溶液各2 μL，按照2项下色谱质谱条件检测，以对照品系列标准溶液中特征多肽的浓度为横坐标，以对应的峰面积为纵坐标，计算线性回归方程，r>0.99，从回归方程求计算供试品溶液浓度，进而计算待测样品中类凝血酶含量。
5.专属性考察
取供试品溶液、空白溶液和对照品溶液各2 μL，进行液质分析，结果空白溶液在对照品溶液出峰位置没有干扰峰出现，供试品溶液在对照品溶液出峰位置有响应色谱峰出现，表明该方法专属性良好，见图1。
6.检出限与定量限
取0.02 μg/mL的对照品溶液，用水稀释制得浓度为6 ng/mL和2 ng/mL的对照品溶液，取2 μL注入高效液相色谱-质谱联用仪，以877.4（双电荷）→892.4作为定量离子对进行检测。对照品溶液浓度为2 ng/mL时特征多肽的定量离子对的信噪比为3.4，浓度为6 ng/mL时信噪比11.8。因此检出限为2 ng/ mL，定量限为6 ng/mL，见图3。
7.线性及范围
按照3.1项下，制备终浓度为0.02 μg/mL、0.05 μg/mL、0.1 μg/mL、0.2 μg/mL、0.4 μg/mL的对照品系列标准溶液，以877.4（双电荷）→892.4作为定量离子对进行检测。以对照品系列标准溶液中特征多肽的浓度为横坐标，以对应的峰面积为纵坐标，计算线性回归方程：y = 783411 x -10329 (R2 = 0.998)，在0.02 μg/mL～0.4 μg/mL范围内，特征多肽的浓度与色谱峰面积成线性关系，见图2。
8.重复性
按照供试品溶液制备方法，平行制备6份后进行分析，以877.4（双电荷）→892.4作为定量离子对进行检测。结果六次平行测得含量RSD为2.2%，方法重复性良好。
Figure 774354DEST_PATH_IMAGE002
9.精密度考察
取供试品溶液，连续重复进样6次，以877.4（双电荷）→892.4作为定量离子对，测得峰面积， RSD为2.6%，仪器精密度良好。
Figure 47204DEST_PATH_IMAGE003
10稳定性考察
取供试品溶液，处理后置于8℃，分别于0、2、4、6、8、16及24小时进样测定，以877.4（双电荷）→892.4作为定量离子对，测得峰面积RSD为3.0%，说明供试品溶液中特征多肽在8℃下24小时内稳定。
Figure 182650DEST_PATH_IMAGE004
11.回收率考察
精密称取已知特征多肽含量的蛇毒样品（含量0.53 μg/mg）19.80 mg用25 mmol/L碳酸氢铵溶液溶解并稀释至10 mL；取9份，每份200 μL，各加入适量特征多肽对照品溶液，按3.2制备回收率考察溶液，以877.4（双电荷）→892.4作为定量离子对，进行检测。结果显示三个水平的回收率均在91.18%～107.84%范围内，平均回收率96.23%，RSD为6.6%，该方法回收率良好。
Figure 945287DEST_PATH_IMAGE005
12.样品检测
按照3和4项下方法，对标示为白眉蝮蛇蛇毒（20180601F、20180702F、20170802）和标示为矛头蝮蛇蛇毒（2004171、2004172、2004173、2004174）的样品，以及两批蛇种未知的蛇毒样品（20200304、20200405）进行检测。
12.1定性分析
根据上文所述的蛇毒样品预处理方法以及分析方法，检测结果显示，以质荷比（m/z)877.4(双电荷)→550.2和877.4(双电荷)→892.4离子对提取的供试品离子流色谱中，三批白眉蝮蛇蛇毒样品均呈现与对照特征多肽色谱保留时间（0.88分钟）一致的色谱峰，而四批次矛头蝮蛇蛇毒及两批未知蛇毒在对照特征多肽色谱保留时间处均未提取到色谱峰。因此，三批标示为白眉蝮蛇蛇毒中均可以检测到特征多肽TLCAGVMEGGIDTCNR，确认来源于白眉蝮蛇，而四批标示为矛头蝮蛇蛇毒和两批未知蛇毒均未检测到该特征多肽，因此确认这6批蛇毒并非来源于白眉蝮蛇。
12.2定量分析
对于检测到特征多肽（TLCAGVMEGGIDTCNR）的样品，从回归方程求计算供试品溶液浓度，进而计算样品中类凝血酶含量。结果见表6，三批次粗毒含量均在0.4 μg/mg以上。因此该方法可以用来检测样品中白眉蝮蛇蛇毒中类凝血酶含量。
Figure 974423DEST_PATH_IMAGE006
以上实施例为本发明较佳的实施方式，单本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何为背离本发明的精神实质于原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 山东大学，山东省食品药品检验研究院，锦州奥鸿药业有限责任公司
<120> 一种白眉蝮蛇蛇毒类凝血酶特征多肽及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 16
<212> PRT
<213> 白眉蝮蛇(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 1
Thr Leu Cys Ala Gly Val Met Glu Gly Gly Ile Asp Thr Cys Asn Arg
1 5 10 15

Claims (7)

1.一种白眉蝮蛇蛇毒类凝血酶特征多肽，其特征为：氨基酸序列为TLCAGVMEGGIDTCNR。
2.一种权利要求1所述的白眉蝮蛇蛇毒类凝血酶特征多肽的应用，使用上述特征多肽对待测样品中蛇毒类凝血酶的种属来源和/或含量进行检测，其特征在于，采用以下步骤：
（1）取待测样品经过胰蛋白酶酶解预处理，取酶解液上清作为供试品溶液；
（2）取白眉蝮蛇蛇毒特征多肽对照品经过胰蛋白酶酶解预处理，制备系列浓度的对照品溶液；
（3）取步骤（1）所述的供试品溶液和步骤（2）所述的对照品溶液分别注入液相色谱-质谱仪，采用电喷雾正离子模式，进行多反应监测，以质荷比m/z 双电荷877.4→550.2作为定性离子对，以双电荷877.4→892.4作为定量离子对；
（4）在以步骤（3）所述的定性离子对和定量离子对提取的供试品溶液色谱图中，如呈现与对照特征多肽色谱保留时间一致的色谱峰，则表明待测样品含有氨基酸序列TLCAGVMEGGIDTCNR，证明待测样品来源于白眉蝮蛇；反之，则为非白眉蝮蛇来源；
（5）提取离子对双电荷877.4→892.4色谱图，以对照品系列标准溶液中特征多肽的浓度为横坐标，以对应的峰面积为纵坐标，计算线性回归方程，r>0.99，从回归方程计算供试品溶液浓度，进而计算待测样品中类凝血酶含量。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述白眉蝮蛇蛇毒特征多肽检出限为2ng/mL，定量限为6 ng/mL。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述经过胰蛋白酶酶解预处理的具体操作为：取待测样品20 mg，置10 mL量瓶中，用25 mmol/L碳酸氢铵溶液溶解并定容；量取200 μL，加0.2 mol/L二硫苏糖醇溶液10 μL，混匀，60℃反应60 min，加0.2 mol/L碘乙酰胺溶液20μL，避光反应30 min，加25 mmol/L碳酸氢铵溶液760 μL和0.4 mg/mL 胰蛋白酶溶液10 μL，37℃酶解90 min，90℃灭活10 min，放冷至室温，1200 rpm离心10 min得上清液。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（2）所述经过胰蛋白酶酶解预处理的具体操作为：取特征多肽对照品10 mg，精密称定，置100 mL容量瓶中，用25 mmol/L碳酸氢铵溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，分别精密量取0.1 mL、0.25 mL、0.5 mL、1 mL、2 mL，分别置100 mL量瓶中，用25 mmol/L碳酸氢铵溶液稀释至刻度，摇匀；分别量取200 μL，加0.2mol/L二硫苏糖醇溶液10 μL，混匀，60℃反应60 min，加0.2 mol/L碘乙酰胺溶液20 μL，避光反应30 min，加25 mmol/L碳酸氢铵溶液760 μL和0.4 mg/mL 胰蛋白酶溶液10 μL，37℃酶解90 min，90℃灭活10 min，放冷至室温，1200 rpm离心10 min得上清液。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述液相色谱-质谱仪中液相和质谱检测条件如下：
液相条件：Waters ACQUITY UPLC BEH C18，色谱柱 50 mm×2.1 mm，1.7 μm；柱温：40℃；进样量2 μL；流速：0.2 mL/min；流动相A为0.1%甲酸溶，B为0.1%甲酸乙腈，进行梯度洗脱，洗脱程序：0→1 min，流动相A 80%；1→5 min，流动相A 80%→10%；5→7 min，流动相A10%→10%；
质谱条件：电喷雾离子源，正离子扫描模式，多反应监测；涡旋离子喷雾温度500℃；离子化电压：5.5 kV；碰撞室出口电压10 V；入口电压EP 10 V；碰撞能量CE均为45 V，去簇电压DP为135 V。
7.根据权利要求2-7中任一项所述的方法，其特征在于，所述待测样品为蛇毒。
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