CN117471007B - 一种血浆β-淀粉样蛋白检测方法 - Google Patents

一种血浆β-淀粉样蛋白检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种血浆β‑淀粉样蛋白检测方法，本发明方法以血浆Aβ42和Aβ40作为检测对象，选择Aβ40蛋白的特征肽段为肽段GAIIGLMVGGVV，Aβ42蛋白的特征肽段为肽段GAIIGLMVGGVVIA，肽段GAIIGLMVGGVV的定量子离子为968.56（b11+），肽段GAIIGLMVGGVVIA的定量子离子为1067.63（b12+），采用15N同位素标记的完整蛋白作为内标，通过免疫沉淀富集纯化样本，并酶解产生特征肽段，建立ID‑LC‑MS/MS靶向检测特征肽段的方法，从而实现血浆Aβ42和Aβ40的准确定量。本发明方法避免了血浆中与Aβ40和Aβ42众多结构相似的亚型对检测的干扰，有利于提高检测方法的准确度，并且特征肽段的质谱母离子、质谱子离子具有更强的响应信号，使得血浆β‑淀粉样蛋白检测方法的准确度、重复性、灵敏度更佳。

Description

一种血浆β-淀粉样蛋白检测方法
技术领域
本发明涉及蛋白分析检测领域，具体涉及一种血浆β-淀粉样蛋白检测方法。
背景技术
阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一种进行性、不可逆的神经退行性疾病，是导致老年期痴呆的主要原因。脑内β-淀粉样蛋白(β-amyloid，Aβ)沉积是AD的主要病理特征之一，通常发生于患者进展为痴呆的十到二十年之前，被认为是体内能够最早反映AD神经病理学改变的证据。Aβ是由淀粉样前体蛋白(Amyloid precursor protein，APP)经β-分泌酶和γ-分泌酶不断剪切形成的长度可变的多肽，其主要亚型为β-淀粉样蛋白40(Aβ40)和β-淀粉样蛋白42(Aβ42)。通过检测Aβ等反映AD病理变化的生物标志物，可以对患者的神经病理学改变进行准确评估，为疾病的准确诊断和早期诊断提供重要信息。目前生物标志物的检测在AD临床诊断中的价值正逐渐受到重视。阿尔茨海默病国际工作组(TheInternational Working Group，IWG)针对AD早期临床诊断的建议就强调了只有当患者同时存在特定的AD临床表现(表型阳性)和AD病理相关生物标志物证据(Aβ阳性和tau阳性)时，才能将其诊断为AD。
血液生物标志物检测相对于PET和CSF检测具有侵入性更小且价格更低的优势，在临床应用方面具有广阔前景。此外，近年来的多项研究表明，血浆中Aβ42/Aβ40比值与CSF和PET检测结果相关，能够高精度地识别Aβ沉积的个体，对AD的早期诊断和准确诊断具有重要价值。但目前并不推荐将其用于AD的临床诊断。其中一个重要原因是目前血浆Aβ42/Aβ40等生物标志物的检测尚未实现标准化，其检测结果的可靠性和一致性还有待进一步验证。
目前血浆Aβ42和Aβ40的主要检测方法可分为两类：基于抗原抗体特异性反应的免疫检测和基于质谱原理的检测。免疫检测方法主要包括酶联免疫吸附分析(Enzyme linkedimmunosorbent assay，ELISA)、化学发光分析(Chemiluminiscence，CL)和单分子阵列(Single-moleculeArray，Simoa)等，具有操作简便、自动化程度高等优点。然而，其准确性高度依赖于抗体对待测物的特异性识别。不同试剂厂家使用的特异性高亲和力抗体的性能通常存在差异，这导致了不同免疫检测方法的结果不一致。此外，有研究表明，即使是使用了相同抗体的ELISA和Simoa，其检测结果之间也存在较大差异。质谱(Mass spectrometry，MS)是一种测量离子质荷比(质量-电荷比)的技术，同时具备高灵敏度和高选择性的优势，被广泛应用于生物分析领域。由于血浆成分复杂，内源性Aβ蛋白的浓度极低，样本在进行质谱检测之前通常需要使用免疫沉淀(Immunoprecipitation，IP)前处理进行富集纯化。这种将免疫沉淀与质谱检测结合的分析方法又被称为IP-MS。IP-MS技术能够有效地降低样品复杂度，提高检测灵敏度和特异性，尤其适用于生物样品中低丰度蛋白质的定量检测，已被多家机构和科研单位用于建立血浆Aβ蛋白的检测方法。但是，现有的Aβ38、Aβ40和Aβ42利用液相质谱的检测方法，由于在血浆中存在Aβ40和Aβ42众多结构相似的亚型，现有检测方法对样品的前处理、以及检测标志物的选择易受结构相似的亚型的影响，导致检测方法的特异性不佳，准确度、重复性及灵敏度有待改善。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供血浆β-淀粉样蛋白检测方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种血浆β-淀粉样蛋白检测方法，所述血浆β-淀粉样蛋白检测方法检测的目标物为Aβ40蛋白、Aβ42蛋白；所述血浆β-淀粉样蛋白检测方法包括以下步骤：
(1)将15N-Aβ40蛋白和15N-Aβ42蛋白作为内标与待测血浆样品混匀，混匀后两种内标的终浓度为80～120pg/mL；将加入内标的待测血浆样品与包被β-淀粉样蛋白N端特异性单克隆抗体的树脂磁珠混合得到混合体系a于25～30℃下孵育2～4小时；
(2)去除混合体系a中的液体得到免疫沉淀的树脂磁珠，清洗免疫沉淀的树脂磁珠后对免疫沉淀的树脂磁珠进行洗脱，收集洗脱液；
(3)去除步骤(2)得到的洗脱液中的溶剂，用碳酸氢铵溶液复溶后与定量胰蛋白酶混匀后进行酶解反应，加入终止剂终止酶解反应后得到样本a，将样本a除盐得到样本b；
(4)将样本b进液相二级质谱仪(LC-MS/MS)检测Aβ40蛋白、Aβ42蛋白以及作为内标的15N-Aβ40蛋白和15N-Aβ42蛋白，以样本b中Aβ42蛋白和Aβ40蛋白的特征肽段在液相二级质谱仪中的信号定量Aβ40蛋白、Aβ42蛋白，其中Aβ40蛋白的特征肽段为肽段GAIIGLMVGGVV，Aβ42蛋白的特征肽段为肽段GAIIGLMVGGVVIA，内标15N-Aβ40蛋白和15N-Aβ42蛋白特征肽段分别为15N标记的肽段15N-[GAIIGLMVGGVV]、肽段15N-[GAIIGLMVGGVVIA]，通过选择特征肽段在液相二级质谱仪中的母离子、子离子进行定性和定量，其中肽段GAIIGLMVGGVV的母离子为1085.64+，15N-[GAIIGLMVGGVV]的母离子为1097.6+，肽段GAIIGLMVGGVVIA的母离子为635.38++，肽段15N-[GAIIGLMVGGVVIA]的母离子为642.36++；
所述肽段GAIIGLMVGGVV的子离子包括656.38(b7+)、755.45(b8+)、812.47(b9+)、869.49(b10+)和968.56(b11+)，
所述肽段15N-[GAIIGLMVGGVV]的子离子包括663.36(b7+)、763.42(b8+)、821.44(b9+)、879.46(b10+)、979.53(b11+)，
所述肽段GAIIGLMVGGVVIA的子离子包括656.38(b7+)、755.45(b8+)、812.47(b9+)、869.49(b10+)、968.56(b11+)、1067.63(b12+)、1180.71(b13+)；
所述肽段15N-[GAIIGLMVGGVVIA]的子离子包括663.36(b7+)，763.42(b8+)，821.44(b9+)，879.46(b10+)，979.53(b11+)，1079.59(b12+)，1193.67(b13+)。
发明人在研究血浆β-淀粉样蛋白检测方法中，通过胰蛋白酶对血浆中的目标物Aβ40蛋白、Aβ42蛋白酶解，以酶解后的特征肽段，即Aβ40蛋白的特征肽段为肽段Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val(GAIIGLMVGGVV)，Aβ42蛋白的特征肽段为肽段Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala(GAIIGLMVGGVVIA)，进行液相质谱检测，经过研究发现，胰蛋白酶酶解出的特征肽段的质谱母离子、质谱子离子与现有技术公开的不同，上述血浆β-淀粉样蛋白检测方法获得的胰蛋白酶酶解出的特征肽段的质谱母离子、质谱子离子具有更好的特异性，避免了血浆中与Aβ40和Aβ42众多结构相似的亚型对检测的干扰，有利于提高检测方法的准确度，并且特征肽段的质谱母离子、质谱子离子具有更强的响应信号，使得血浆β-淀粉样蛋白检测方法的准确度、重复性、灵敏度更佳。由此，发明人建立了胰蛋白酶酶解血浆中的目标物Aβ40蛋白、Aβ42蛋白，并且以同位素标记的内标酶解后的特征肽段的母离子、子离子进行定性、定量的血浆β-淀粉样蛋白检测方法。上述血浆β-淀粉样蛋白检测方法可以选择待测血浆样品中特征肽段的任一个母离子、子离子与对应的内标特征肽段的母离子与子离子以及待测血浆样品中目的物与定量内标含量比例计算得到待测血浆样品中目的物的含量。
优选地，所述肽段GAIIGLMVGGVV的定量子离子为968.56(b11+)，所述肽段GAIIGLMVGGVV的定性子离子为755.45(b8+)，所述肽段GAIIGLMVGGVVIA的定量子离子为1067.63(b12+)，所述肽段GAIIGLMVGGVVIA的定性子离子为968.56(b11+)。
发明人通过研究发现，以胰蛋白酶酶解的肽段GAIIGLMVGGVV作为Aβ40蛋白的特征肽段，肽段GAIIGLMVGGVV的子离子中968.56(b11+)、755.45(b8+)的特异性更佳，以胰蛋白酶酶解的肽段GAIIGLMVGGVVIA作为Aβ42蛋白的特征肽段，肽段GAIIGLMVGGVVIA的子离子中1067.63(b12+)、968.56(b11+)的特异性特异性更佳，血浆中与Aβ40和Aβ42众多结构相似的亚型在酶解过程中即没有相同、相似的肽段，而且经液相二级质谱仪获得的子离子也没有与上述特征肽段子离子相同的，完全避免了血浆中与Aβ40和Aβ42众多结构相似的亚型在定性和定量检测过程中对Aβ40和Aβ42的干扰。肽段GAIIGLMVGGVV的定量子离子为968.56(b11+)，可以获得液相二级质谱仪中对肽段GAIIGLMVGGVV子离子968.56(b11+)的响应信号为A1，同时，对应的15N-Aβ40蛋白的特征肽段为15N-[GAIIGLMVGGVV]，与肽段GAIIGLMVGGVV的定量子离子为968.56(b11+)对应的同位素标记的15N-[GAIIGLMVGGVV]的定量子离子为979.53(b11+)，可以获得液相二级质谱仪中对肽段15N-[GAIIGLMVGGVV]子离子979.53(b11+)的响应信号为A2，加入内标15N-Aβ40蛋白的含量是已知确定的，则根据待测目标物Aβ40蛋白与15N-Aβ40蛋白的含量比例，以及响应信号A1与A2的比例，可以计算出待测目标物Aβ40蛋白的含量，同理Aβ42蛋白的含量，也可以通过其特征肽段的定量子离子1067.63(b12+)即对应同位素标记的特征肽段15N-[GAIIGLMVGGVVIA]定量子离子1079.59(b12+)的信号比例计算获得。
优选地，所述步骤(3)中胰蛋白酶的用量为：胰蛋白酶的质量与步骤(1)中树脂磁珠的质量比例为1：(200～2000)，步骤(3)中酶解的时间为12～16小时，步骤(3)中用于复溶的碳酸氢氨的溶液的浓度为80～120mM，体积为50～300μL。
酶解过程对血浆β-淀粉样蛋白检测方法的灵敏度、准确度具有重要影响，酶解影响酶解物中特征肽段的含量，而且不仅会将目标物Aβ40蛋白、Aβ42蛋白酶解为特征肽段，而且会将特征肽段酶解为其他肽段、或者氨基酸，进而降低血浆β-淀粉样蛋白检测方法的灵敏度、准确度。发明人通过研究发现，在上述酶解条件下，酶解后特征肽段的含量更多，且特征肽段的母离子、子离子的响应信号更强，更有利于提高血浆β-淀粉样蛋白检测方法的准确度、灵敏度和重复性。
优选地，步骤(3)中的终止剂为甲酸。
优选地，所述步骤(3)中胰蛋白酶的用量为：胰蛋白酶的质量与步骤(1)中树脂磁珠的质量比例为1：(400～2000)。
优选地，所述步骤(1)中所述树脂磁珠为M270环氧树脂磁珠，所述待测血浆样品与M270环氧树脂磁珠的用量比例为每1mL待测血浆样品与0.8～1.2mg包被β-淀粉样蛋白N端特异性单克隆抗体的M270环氧树脂磁珠混合。
优选地，所述包被β-淀粉样蛋白N端特异性单克隆抗体的M270环氧树脂磁珠的制备方法包括以下步骤：
(a)将M270环氧树脂磁珠用磷酸缓冲盐溶液活化M270环氧树脂磁珠后去除液相收集M270环氧树脂磁珠；
(b)将0.8～1.2moL/L的硫酸铵-磷酸缓冲盐溶液重悬M270环氧树脂磁珠后与β-淀粉样蛋白N端特异性单克隆抗体混合后孵育8～12小时后去除液体收集M270环氧树脂磁珠，所述β-淀粉样蛋白N端特异性单克隆抗体与所述M270环氧树脂磁珠的用量比例为3.0～3.5mL抗体比1gM270环氧树脂磁珠；
(c)将步骤(b)收集的M270环氧树脂磁珠与质量浓度0.08～0.12％的牛血清白蛋白的磷酸缓冲盐溶液混合静置10～15分钟后去除液体收集M270环氧树脂磁珠；M270环氧树脂磁珠与牛血清白蛋白的磷酸缓冲盐溶液的比例为4～6mgM270环氧树脂磁珠比1mL牛血清白蛋白的磷酸缓冲盐溶液；
(d)重复步骤(c)2～3次得到所述包被β-淀粉样蛋白N端特异性单克隆抗体的M270环氧树脂磁珠。
优选地，包被β-淀粉样蛋白N端特异性单克隆抗体的M270环氧树脂磁珠的制备方法中，所述孵育方式为在25～30℃下与800rpm～12000rpm的摇床中孵育。
优选地，所述步骤(1)中，包被β-淀粉样蛋白N端特异性单克隆抗体的树脂磁珠与加入内标的待测血浆样品的比例为0.8～1.2mg包被β-淀粉样蛋白N端特异性单克隆抗体的树脂磁珠比1mL加入内标的待测血浆样品。
优选地，所述步骤(1)中，所述血浆样品与包被β-淀粉样蛋白N端特异性单克隆抗体的树脂磁珠混合后的孵育方式为在25～30℃下与800rpm～12000rpm的摇床中孵育。
优选地，所述步骤(2)中的洗脱液为甲酸水溶液和乙腈的混合液，其中，甲酸水溶液和乙腈的体积比为(0.8～1.2)：1，甲酸水溶液的质量浓度为1.8～2.2％。
优选地，所述步骤(4)中，液相二级质谱仪检测的液相色谱条件包括：
色谱柱为ACQUITYBEH C18色谱柱(1.7μm，2.1×50mm)或AtlantisTMPremierBEH C18 AX(1.7μm，2.1×100mm)，流动相的有机相为乙腈，水相为甲酸水溶液、氨水、氟化铵水溶液、甲酸铵水溶液或乙酸铵水溶液。
优选地，所述步骤(4)中，液相二级质谱仪检测的液相色谱条件包括：色谱柱：ACQUITYBEH C18色谱柱(1.7μm，2.1×50mm)；柱温：40℃；流动相流速：0.3mL/min；流动相水相为18～22mmol/L氟化铵溶液，流动相有机相为乙腈；流动相的梯度为0～1分钟，水相体积保持为95％，1～3.5分钟，水相体积由95％变为10％，3.5～4.5分钟，水相体积保持为10％，4.5～4.6分钟水相体积由10％变为95％，4.6～6分钟后水相体积保持为95％。
上述色谱条件下，Aβ40蛋白与Aβ42蛋白的特征肽段的分离效果更好，色谱峰的峰型更好，更有利于将Aβ40蛋白与Aβ42蛋白的特征肽段和与Aβ40蛋白与Aβ42蛋白众多结构相似的亚型的酶解肽分离，进一步避免了检测干扰。
优选地，所述步骤(4)中，液相二级质谱仪检测的质谱条件包括：用于肽段GAIIGLMVGGVVIA检测的锥孔电压为20V，碰撞电压为15V；用于肽段GAIIGLMVGGVV检测的锥孔电压为20V，碰撞电压为28V，毛细管电压设置为2.7kV、去溶剂温度设置为650℃、去溶剂气流设置为1200L/Hr、锥孔气流设置为150L/Hr。
在上述质谱条件下，Aβ40蛋白与Aβ42蛋白的特征肽段的母离子、子离子具有更强的响应信号。
优选地，所述步骤(3)中，将样本a除盐得到样本b的方法为：用活化、平衡后的C18SPE柱，将样本a过C18 SPE柱，用冲洗液冲洗C18 SPE柱，然后用洗脱液洗脱C18 SPE柱并收集洗脱C18 SPE柱后的滤液得到样本b，其中冲洗液为体积分数95％的质量浓度0.1％的三氟乙酸水溶液与体积分数5％甲醇的混合液，洗脱液为体积分数20％的质量浓度0.1％的三氟乙酸水溶液与体积分数80％乙腈的混合液；所述C18 SPE柱为GL Science C18固相萃取柱。
发明人通过研究发现，C18 SPE柱为GL Science C18固相萃取柱时，Aβ40蛋白与Aβ42蛋白的特征肽段的母离子、子离子具有更强的响应信号。
本发明的有益效果在于：本发明提供了一种血浆β-淀粉样蛋白检测方法，通过胰蛋白酶对血浆中的目标物Aβ40蛋白、Aβ42蛋白酶解，以酶解后的特征肽段，即Aβ40蛋白的特征肽段为肽段GAIIGLMVGGVV，Aβ42蛋白的特征肽段为肽段GAIIGLMVGGVVIA，进行液相质谱检测，经过研究发现，胰蛋白酶酶解出的特征肽段的质谱母离子、质谱子离子与现有技术公开的不同，上述血浆β-淀粉样蛋白检测方法获得的胰蛋白酶酶解出的特征肽段的质谱母离子、质谱子离子具有更好的特异性，避免了血浆中与Aβ40和Aβ42众多结构相似的亚型对检测的干扰，有利于提高检测方法的准确度，并且特征肽段的质谱母离子、质谱子离子具有更强的响应信号，使得血浆β-淀粉样蛋白检测方法的准确度、重复性、灵敏度更佳。
本发明的血浆β-淀粉样蛋白检测方法，建立了靶向定量检测血浆Aβ42和Aβ40的候选参考方法，通过对质谱条件、色谱条件以及样本前处理条件进行系统的优化，提高了方法的检测灵敏度及特异性，使其能够准确测定血浆中的Aβ42和Aβ40。经过严格的方法学评价，该方法表现出良好的精密度、正确度以及分析灵敏度，并且其线性范围较宽，无携带污染和基质效应，测量不确定度在可接受范围内，可作为血浆Aβ42和Aβ40检测的候选参考方法，为常规检测结果的标准化提供支持。通过后续进一步的研究，有望实现血浆Aβ42和Aβ40检测的标准化，为AD的临床研究和临床诊断提供可靠的检测结果。本发明的血浆β-淀粉样蛋白检测方法对于Aβ42的检测，候选参考方法的批内精密度为3.43％-4.78％，批间精密度为4.21％-5.44％，加标回收率为95.3％-108.2％，LOD为5pg/mL，LOQ为10pg/mL，线性范围为10-500pg/mL，无携带污染和基质效应，测量不确定度为7.86％-9.28％(k＝2，95％CI)。对于Aβ40的检测，候选参考方法的批内精密度为2.67％-3.78％，批间精密度为3.68％-4.33％，加标回收率为93.2％-105.6％，LOD为10pg/mL，LOQ为20pg/mL，线性范围为20-1000pg/mL，无携带污染和基质效应，测量不确定度为7.5％-8.66％(k＝2，95％CI)。
附图说明
图1为本发明实施例血浆β-淀粉样蛋白检测方法的流程示意图。
图2为本发明实施例血浆β-淀粉样蛋白检测方法中特征肽段GAIIGLMVGGVVIA、GAIIGLMVGGVV的MS/MS二级离子扫描质谱图。
图3为本发明实施例血浆β-淀粉样蛋白检测方法中15N-Aβ42蛋白经胰蛋白酶水解产生的特征肽段15N-[GAIIGLMVGGVVIA]、15N-[GAIIGLMVGGVV]的MS/MS二级离子扫描质谱图。
图4为本发明实施例血浆β-淀粉样蛋白检测方法中锥孔电压和碰撞能对特征肽段标准品LC-MS/MS检测峰面积的影响结果图。
图5为本发明实施例血浆β-淀粉样蛋白检测方法中色谱柱对特征肽段标准品的分离结果图。
图6为本发明实施例β-淀粉样蛋白标准品检测方法中酶与磁珠比例对特征肽段检测的影响结果图。
图7为本发明实施例血浆β-淀粉样蛋白检测方法中酶与磁珠比例对特征肽段检测的影响结果图。
图8为本发明实施例血浆β-淀粉样蛋白检测方法中酶解时间对特征肽段检测的影响结果图。
图9为本发明实施例血浆β-淀粉样蛋白检测方法的检出限的结果图。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
作为本发明实施例的一种血浆β-淀粉样蛋白检测方法，所述血浆β-淀粉样蛋白检测方法检测的目标物为Aβ40蛋白、Aβ42蛋白；
所述血浆β-淀粉样蛋白检测方法包括以下步骤：
(1)将15N-Aβ40蛋白和15N-Aβ42蛋白作为内标与待测血浆样品混匀，混匀后两种内标的终浓度为80～120pg/mL；将加入内标的待测血浆样品与包被β-淀粉样蛋白N端特异性单克隆抗体的树脂磁珠混合得到混合体系a于25～30℃下孵育2～4小时；
(2)去除混合体系a中的液体得到免疫沉淀的树脂磁珠，清洗免疫沉淀的树脂磁珠后对免疫沉淀的树脂磁珠进行洗脱，收集洗脱液；
(3)去除步骤(2)得到的洗脱液中的溶剂，用碳酸氢铵溶液复溶后与定量胰蛋白酶混匀后进行酶解反应，加入终止剂终止酶解反应后得到样本a，将样本a除盐得到样本b；
(4)将样本b进液相二级质谱仪检测Aβ40蛋白、Aβ42蛋白以及作为内标的15N-Aβ40蛋白和15N-Aβ42蛋白，以样本b中Aβ42蛋白和Aβ40蛋白的特征肽段在液相二级质谱仪中的信号定量Aβ40蛋白、Aβ42蛋白，其中Aβ40蛋白的特征肽段为肽段GAIIGLMVGGVV，Aβ42蛋白的特征肽段为肽段GAIIGLMVGGVVIA，内标15N-Aβ40蛋白和15N-Aβ42蛋白特征肽段分别为15N标记的肽段15N-[GAIIGLMVGGVV]、肽段15N-[GAIIGLMVGGVVIA]，通过选择特征肽段在液相二级质谱仪中的母离子、子离子进行定性和定量，其中肽段GAIIGLMVGGVV的母离子为1085.64+，15N-[GAIIGLMVGGVV]的母离子为1097.6+，肽段GAIIGLMVGGVVIA的母离子为635.38++，肽段15N-[GAIIGLMVGGVVIA]的母离子为642.36++；
所述肽段GAIIGLMVGGVV的子离子包括656.38(b7+)、755.45(b8+)、812.47(b9+)、869.49(b10+)和968.56(b11+)，
所述肽段15N-[GAIIGLMVGGVV]的子离子包括663.36(b7+)、763.42(b8+)、821.44(b9+)、879.46(b10+)、979.53(b11+)，
所述肽段GAIIGLMVGGVVIA的子离子包括656.38(b7+)、755.45(b8+)、812.47(b9+)、869.49(b10+)、968.56(b11+)、1067.63(b12+)、1180.71(b13+)；
所述肽段15N-[GAIIGLMVGGVVIA]的子离子包括663.36(b7+)，763.42(b8+)，821.44(b9+)，879.46(b10+)，979.53(b11+)，1079.59(b12+)，1193.67(b13+)。
血浆β-淀粉样蛋白检测方法的流程示意图如图1所示。
实验方法
一、仪器、试剂与数据处理
(一)、主要试剂的配制
1、Promega胰蛋白酶溶液
将Promega胰蛋白酶干粉用100μL 50mmol/L的醋酸溶液溶解后，定容配置为1g/LPromega胰蛋白酶溶液，保存于-20℃备用。工作液稀释至所需浓度。
2、Aβ42和Aβ40标准品溶液、15N-Aβ42和15N-Aβ40标准品溶液
(1)配置50μg/mLAβ42和Aβ40标准品溶液
分别将0.5mg rPeptideAβ42和0.5mg rPeptideAβ40标准品(购自苏州强耀生物技术有限公司)干粉用溶剂溶解后用，定容至10mL容量瓶，溶剂为氨水(体积分数1％)与乙腈(体积分数20％)的混合水溶液，作为母液-80℃保存，使用时配置工作液用上述溶剂稀释至所需浓度。
(2)15N-Aβ42和15N-Aβ40标准品标准品溶液
15N-Aβ42和15N-Aβ40标准品(购自苏州强耀生物技术有限公司)，配置、使用方法同上。
3、3％BSA-PBS
准确称量1.5g牛血清白蛋白(BSA)，加入50mL0.1mol/LpH7.4的磷酸缓冲盐溶液(PBS缓冲液)完全溶解样本后，4℃保存。
4、血浆样本
本研究所涉及的血浆样本均来源于广东省中医院检验科检测后剩余样本，已通过广东省中医院伦理审查(ZE2022-321-01)，不涉及患者具体信息，免除知情同意。收集检测后剩余血浆80mL用于质控品的制备，室温下使用磁力搅拌器充分混匀。
(1)质控品1：样本充分混匀后，使用移液器分装混合血浆样本至1.8mL冻存管，每管分装1mL，共分装20管，-80℃保存。
(2)低值加标样本：向20mL血浆样本中准确加入10μL 20ng/mLAβ42标准品以及10μL 100ng/mLAβ40标准品充分混匀后分装至1.8mL冻存管，每管分装1mL，共分装20管，-80℃保存。
(3)质控品2(中值加标样本)：向20mL血浆样本中准确加入10μL 100ng/mL Aβ42标准品以及10μL 400ng/mLAβ40标准品充分混匀后分钟至1.8mL冻存管，每管分装1mL，共分装20管，-80℃保存。
(4)质控品3(高值加标样本)：向20mL血浆样本中准确加入15μL 200ng/mL Aβ42标准品以及10μL 1000ng/mLAβ40标准品充分混匀后分钟至1.8mL冻存管，每管分装1mL，共分装20管，-80℃保存。
二、实验方法
(一)胰蛋白酶水解Aβ42蛋白和Aβ40蛋白的特征肽段
经Pubmed数据库检索，Aβ42的氨基酸序列如下：
DAEFRHDSGY EVHHQKLVFF AEDVGSNKGA IIGLMVGGVV IA
经Pubmed数据库检索，Aβ40的氨基酸序列如下：
DAEFRHDSGY EVHHQKLVFF AEDVGSNKGA IIGLMVGGVV
1、胰蛋白酶水解Aβ42蛋白和Aβ40蛋白的特征肽段分析
使用Expasy网站的PeptideMass模块对Aβ42和Aβ40经胰蛋白酶水解后产生的片段进行分析，结果见表1和表2。Aβ42全长蛋白预测分子量为4514.10，等电点为5.31，而Aβ40全长蛋白预测分子量为4329.86，等电点为5.31。
表1 Aβ42蛋白经胰蛋白酶水解片段
表2 Aβ40蛋白经胰蛋白酶水解片段
2、水解后多肽片段理化性质的检索分析
Aβ42和Aβ40经胰蛋白酶水解产生的各条多肽片段理化性质检索结果如表3和4所示。
表3 Aβ42经胰蛋白酶水解产生多肽片段的理化性质
表4 Aβ40经胰蛋白酶水解产生多肽片段的理化性质
3、特征肽段的选择
Aβ42和Aβ40的氨基酸序列高度相似，仅在羧基末端存在两个氨基酸的差异，因此在胰蛋白酶水解后产生的多肽片段中，只有来自羧基末端的多肽片段(序列29-42：GAIIGLMVGGVVIA；序列29-40：GAIIGLMVGGVV)能够特异性地将二者区分开。这两条序列长度合适，在5-20个氨基酸范围内，可溶于水溶液，不包含遗漏的胰蛋白酶水解位点，不含半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺等易发生化学修饰的氨基酸。并且通过BLAST分析，发现这两条序列均特异性存在于人β-淀粉样蛋白前体中。因此，最终选择GAIIGLMVGGVVIA作为Aβ42的特征肽段，GAIIGLMVGGVV作为Aβ40的特征肽段，分别用于Aβ42和Aβ40的定量分析。
4、特征肽段质谱扫描离子化片段分析
(1)合成特征肽段验证：合成肽段GAIIGLMVGGVV、肽段GAIIGLMVGGVVIA，肽段15N-[GAIIGLMVGGVVIA]、肽段15N-[GAIIGLMVGGVV]，分别配制成浓度为1μg/mL的标准品溶液，采用针泵进样的方式，在Q Exactive Plus高分辨质谱仪上进行Q1 MS一级全扫描以及MS/MS二级离子扫描以确定用于分析特征肽段的母离子和子离子信息。
(2)Aβ42和Aβ40及15N标记的Aβ42和Aβ40蛋白质标准品：0.25μgAβ42和Aβ40及15N标记的Aβ42和Aβ40蛋白标准品进行胰蛋白酶水解，采用针泵进样的方式，在Q Exactive Plus高分辨质谱仪上进行Q1 MS一级全扫描和MS/MS二级离子扫描，以确定蛋白标准品酶解后所产生特征肽段母离子和子离子信息。其中胰蛋白酶水解的方法为，将Aβ42和Aβ40及15N标记的Aβ42和Aβ40蛋白质标准品分别用100μL 100mM碳酸氢铵溶液溶解，加入0.5μg胰蛋白酶混匀，37℃酶解8小时，加入质量终浓度为0.1％的甲酸终止酶解反应。
特征肽段GAIIGLMVGGVVIA，GAIIGLMVGGVV及其15N均一化标记的内标肽段经skyline预测的质谱扫描离子对信息见表5。
表5特征肽段及其15N内标质谱扫描离子对预测
(1)特征肽段标准品GAIIGLMVGGVVIA
母离子扫描结果显示人工合成特征肽段标准品GAIIGLMVGGVVIA的[M+2H]2+离子具有更高响应，因此选择[M+2H]2+作为母离子，进行MS/MS二级扫描，如图2所示，为GAIIGLMVGGVVIA特征肽段MS/MS二级离子扫描质谱图。GAIIGLMVGGVVIA特征肽段母离子[M+2H]2+为635.38，子离子b7+-b13+分别为656.38，755.45，812.47，869.49，968.56，1087.63，1180.72。
(2)特征肽段标准品GAIIGLMVGGVV
母离子扫描结果显示人工合成特征肽段标准品GAIIGLMVGGVV的[M+H]+离子具有更高响应，因此选择[M+H]+作为母离子，进行MS/MS二级扫描，如图2所示，为GAIIGLMVGGVV特征肽段MS/MS二级离子扫描质谱图。GAIIGLMVGGVV特征肽段母离子[M+H]+为1085.64，子离子b7-b11分别为656.38，755.45，812.47，869.49，968.56。
(3)Aβ42蛋白标准品经胰蛋白酶水解产生的特征肽段
母离子扫描结果显示由Aβ42蛋白标准品经过胰蛋白酶水解产生的特征肽段GAIIGLMVGGVVIA的[M+2H]2+离子具有更高响应，因此选择[M+2H]2+作为母离子，进行MS/MS二级扫描，如图2所示，为Aβ42蛋白标准品胰蛋白酶水解后特征肽段MS/MS二级离子扫描质谱图。其母离子[M+2H]2+为635.38，子离子b7+-b13+分别为656.38，755.45，812.47，869.49，968.56，1087.63，1180.72。
(4)Aβ40蛋白标准品经胰蛋白酶水解产生的特征肽段
母离子扫描结果显示由Aβ40经过胰蛋白酶水解产生的特征肽段GAIIGLMVGGVV的[M+H]+离子具有更高响应，因此选择[M+H]+作为母离子，进行MS/MS二级扫描，如图2所示，为Aβ40蛋白标准品胰蛋白酶水解后特征肽段MS/MS二级离子扫描质谱图。酶切产生的GAIIGLMVGGVV的母离子[M+H]+为1085.64，子离子b7+-b11+分别为656.38，755.45，812.47，869.49，968.56。与使用skyline软件预测结果以及合成特征肽段GAIIGLMVGGVV质谱扫描结果基本一致。
(5)15N-Aβ42蛋白内标经胰蛋白酶水解产生的特征肽段
母离子扫描结果显示由15N-Aβ42经过胰蛋白酶水解产生的特征肽段的[M+2H]2+离子具有更高响应，因此选择[M+2H]2+作为母离子，进行MS/MS二级扫描，如图3所示，为15N-Aβ42蛋白内标胰蛋白酶水解后特征肽段MS/MS二级离子扫描质谱图。其母离子[M+2H]2+为642.51，子离子b7+-b13+分别为663.36，763.42，821.44，879.46，979.53，1079.59，1193.67。
(6)15N-Aβ40蛋白内标经胰蛋白酶水解产生的特征肽段
母离子扫描结果显示由15N-Aβ40经过胰蛋白酶水解产生的特征肽段的[M+H]+离子具有更高响应，因此选择[M+H]+作为母离子，进行MS/MS二级扫描，如图3所示，为15N-Aβ40蛋白内标胰蛋白酶水解后特征肽段MS/MS二级离子扫描质谱图。其母离子[M+H]+为1097.6，子离子b7+-b11+分别为663.36，763.42，821.44，879.46，979.53。与使用skyline软件预测结果基本一致。
5、离子对的确定及质谱参数优化
根据响应强度、信号稳定性等因素，最终确定了用于Aβ42和Aβ40定量的特征肽段及内标的离子对信息，汇总至表6。在LC-MS/MS检测中，锥孔电压与碰撞能直接影响离子进入质谱过程中的损失以及裂解程度，对方法灵敏度具有重要影响。对质谱参数优化的过程中针对锥孔电压与碰撞能进行了重点优化。不同锥孔电压与碰撞能对特征肽段标准品LC-MS/MS检测峰面积的影响见图4所示，图4为锥孔电压和碰撞能对特征肽段标准品LC-MS/MS检测峰面积的影响结果图，图4A代表特征肽段GAIIGLMVGGVVIA的优化结果，图4B代表特征肽段GAIIGLMVGGVV的优化结果，根据峰面积变化趋势，最终确定用于GAIIGLMVGGVVIA检测的锥孔电压为20V，碰撞电压为15V，用于GAIIGLMVGGVV检测的锥孔电压为20V，碰撞电压为28V。
优化后的其他质谱参数如下：毛细管电压设置为2.7kV、去溶剂温度设置为650℃、去溶剂气流设置为1200L/Hr、锥孔气流设置为150L/Hr。
表6特征肽段及其15N内标离子对信息
(二)色谱条件的确定和优化
1、色谱柱的选择
ACQUITYBEH C18色谱柱(1.7μm，2.1×50mm)、AtlantisTMPremier BEHC18 AX(1.7μm，2.1×100mm)和ACQUITYHSS T3(1.8μm，2.1×50mm)色谱柱对特征肽段标准品的分离情况见图5。图5A为ACQUITYBEH C18色谱柱对GAIIGLMVGGVV的分离效果。图5B为ACQUITYBEH C18色谱柱对GAIIGLMVGGVVIA的分离效果。图5C为AtlantisTM Premier BEH C18 AX色谱柱对GAIIGLMVGGVV的分离效果。图5D为AtlantisTMPremier BEH C18 AX色谱柱对GAIIGLMVGGVVIA的分离效果。图5E为ACQUITYHSST3色谱柱对GAIIGLMVGGVV的分离效果。图5F为ACQUITYHSS T3色谱柱对GAIIGLMVGGVVIA的分离效果。特征肽段在ACQUITYBEH C18色谱柱和AtlantisTMPremier BEH C18 AX色谱柱中的检测基线较低，峰形较为对称，而在ACQUITYHSST3色谱柱的中的基线较高且峰形不对称。考虑到特征肽段在ACQUITYBEH C18色谱柱中的检测响应更高，保留时间更合理，并且该色谱柱具有更宽的pH适用范围(pH 1-12)，在流动相优化方面具有更多的选择性，因此最终选择ACQUITYBEH C18色谱柱用于Aβ42和Aβ40特征肽段的定量分析。
2、流动相优化
相较于甲醇，在使用乙腈作为有机相时特征肽段标准品的响应更高且分离度更好，故最终选择乙腈作为有机相。在此基础上，对流动相pH以及离子对添加剂成分进行了比较，共得到了表7中汇总的5种候选流动相条件。对这5种流动相条件进行进一步的对比，结果见表8，在使用候选条件3(水相：氟化铵溶液；有机相：乙腈)作为流动相时检测到Aβ42特征肽段的面积显著高于其他条件，因此最终选择候选条件3作为候选参考方法的流动相。
表7候选流动相成分
表8不同流动相条件下特征肽段检测面积的比较(n＝3，)
注：各组正态性检验结果均＞0.05，满足正态分布；经方差齐性检验，符合方差齐性。
3、色谱条件的确定
经过优化后，最终确定色谱条件如下：色谱柱：ACQUITYBEH C18色谱柱(1.7μm，2.1×50mm)；柱温：40℃；流速：0.3mL/min；水相：20mmol/L氟化铵溶液；有机相：乙腈；梯度见表9。
表9流动相梯度
(三)待测样品的前处理方法
1、包被β-淀粉样蛋白N端特异性单克隆抗体的M270环氧树脂磁珠的制备(1)准确称取5mgM270环氧树脂磁珠(购自Thermo公司)于1.8mL EP管中；(2)加入1mL 0.1mol/L的pH为7.4的磷酸缓存盐溶液(Na2HPO4-NaH2PO4)重悬M270环氧树脂磁珠；(3)静置1min，去除EP管中液体；(4)重复步骤(2)和(3)1次；(5)将1mL的1moL/L的硫酸铵-磷酸缓冲盐溶液(0.1mol/L，pH7.4)与步骤(4)处理后的M270环氧树脂磁珠混合；(6)加入16.7μL的β-淀粉样蛋白N端特异性单克隆抗体(6E10单克隆抗体，购自Biolegend公司)，孵育8小时；(7)静置1min，去除EP管中液体；(8)加入1mL含质量浓度0.1％BSA的PBS重悬磁珠，并在25℃下静置10min，去除管中液体；(9)重复步骤(8)2次。即可得到包被β-淀粉样蛋白N端特异性单克隆抗体的M270环氧树脂磁珠。
2、免疫沉淀
(1)准确吸取含有目标物Aβ40蛋白、Aβ42蛋白的500μL待测血浆样本，加入终浓度为100pg/mL的15N-Aβ42和15N-Aβ42作为内标；所谓终浓度即将物质加入后得到的混合体系中加入物质在混合体系中的浓度；(2)充分涡旋混匀后，25℃下平衡40min；(3)每份样本中加入0.5mg包被β-淀粉样蛋白N端特异性单克隆抗体的M270环氧树脂磁珠，25℃下孵育3h，去除管中液体；(4)加入1mL磷酸缓存盐溶液重悬步骤(3)处理后的包被β-淀粉样蛋白N端特异性单克隆抗体的M270环氧树脂磁珠，静置1min后去除EP管中液体；(5)重复步骤(4)2次以清洗磁珠；(6)将洗脱液与步骤(5)处理后的包被β-淀粉样蛋白N端特异性单克隆抗体的M270环氧树脂磁珠混合于EP管中，将EP管置于摇床，1400rpm转速下洗脱10min；(7)将EP管置于磁力架上，静置1min，收集洗脱液于新EP管中；(8)重复步骤(6)和(7)1次，将两次洗脱液混合。
3、样本的酶解
(1)将免疫沉淀处理后洗脱收集的洗脱液样本在45℃条件下进行真空离心浓缩以去除溶剂；(2)加入100μL 100mM碳酸氢铵溶液复溶；(3)加入0.5μg胰蛋白酶，37℃酶解8h；(4)加入终浓度为0.1％的甲酸终止反应。得到样本a。
4、酶解后的样本a除盐
(1)活化：向C18 SPE柱中加入1mL甲醇，弃滤液，重复3次；(2)平衡：向C18 SPE柱中加入体积分数0.1％三氟乙酸(TFA)水溶液，弃滤液，重复3次；(3)上样：向C18 SPE柱中加入酶解后的样本a，弃滤液；(4)冲洗：向C18 SPE柱中加入含体积分数0.1％TFA和体积分数5％甲醇的水溶液，弃滤液，重复4次；(5)洗脱：向C18 SPE柱中加入含体积分数0.1％TFA和体积分数80％乙腈的水溶液，收集滤液于EP管中；(6)在45℃条件下将收集在EP管中的滤液进行真空离心浓缩，以去除溶剂成分；(7)加入复溶液溶解样本，复溶液为含体积分数0.1％TFA和体积分数50％乙腈的水溶液得到除盐后的样本b，将样本b上机进行LC-MS/MS检测。
四、待测样品的前处理方法的优化
(一)包被β-淀粉样蛋白N端特异性单克隆抗体的M270环氧树脂磁珠的制备过程、以及免疫沉淀的优化。
1、磁珠抗体包被及免疫沉淀的孵育方式
磁珠由于受重力的影响，在磁珠抗体包被以及免疫沉淀过程中容易沉积到试管底部，导致磁珠与抗体以及磁珠抗体复合物与目标蛋白的接触不充分，进而减少富集到的目标蛋白的绝对量。因此，通常在免疫沉淀过程中会采用转动孵育的方式以避免磁珠沉底。本课题选取了来自2个不同受试者的血浆样本，参照上述(三)待测样品的前处理方法，在其他条件保持不变的条件下，对比了抗体包被与免疫沉淀时同时应用缓慢转动孵育(Slowrotation)、和抗体包被与免疫沉淀时同时应用1200rpm转速的摇床孵育((1200rpm))两种方式对最终检测结果的影响。
实验结果如表10所示，该结果表明在1200rpm转速的摇床上进行抗体包被与免疫沉淀的孵育更有利于待测物的富集，因此选择抗体包被与免疫沉淀时同时应用1200rpm转速的摇床孵育作为抗体包被与免疫沉淀的孵育条件。
表10抗体包被与免疫沉淀过程孵育方式对检测的影响(n＝3，)
注：各组正态性检验P均＞0.05，满足正态分布；方差齐性检验P均＞0.05，符合方差齐性，使用两独立样本t检验比较1200rpm转速的摇床和缓慢转动两种孵育方式检测到特征肽段面积的差异。
(二)样本的酶解过程中的优化
1、酶解反应体积的优化
酶解反应体积对于酶解的效率具有一定的影响，通常来说相对适宜的反应体积更有利于酶与底物的作用。选择Aβ40、Aβ42、15N-Aβ40和15N-Aβ42标准品各25ng(50μL 500ng/mL)进行混合后，参照上述(三)待测样品的前处理方法，保持其他条件一致，对比不同酶解体积下特征肽段检测面积的大小，以确定最适酶解反应体积。
酶解反应体积对特征肽段检测面积的影响见表11。结果表明，Aβ42和Aβ40的酶解反应体积设置不宜过小，只有在适中的反应体积下，目标蛋白才能被高效地酶解。因此，最终设置酶解反应体积为100μL。
表11酶解反应体积的优化(n＝9，)
注：各组正态性检验P均＞0.05，满足整正态分布；Aβ40结果方差齐性检验P＝0.156，符合方差齐性，使用单因素方差分析进行多组间比较，两两比较采用L-S-D法，对于Aβ40特征肽段面积，100μL酶解体积组与50μL酶解体积组P＜0.001，100μL酶解体积组与200μL酶解体积组P＜0.001，100μL酶解体积组与300μL酶解体积组P＜0.001；Aβ42结果方差齐性检验P＝0.156，符合方差齐性，使用单因素方差分析进行多组间比较，两两比较采用L-S-D法，对于Aβ42特征肽段面积，100μL酶解体积组与50μL酶解体积组P＜0.001，100μL酶解体积组与200μL酶解体积组P＜0.001，100μL酶解体积组与300μL酶解体积组P＜0.001。
2、酶与底物比例的优化
酶与底物的比例是影响酶解效率的重要因素之一，决定了相同酶解时间下产生的特征肽段的绝对量。由于血浆样本在水解前需要进行免疫沉淀富集，最终进行酶解的样本中除了含有Aβ40、Aβ42及其内标外，还包含了M270环氧树脂磁珠上包被的单克隆抗体、封闭多余位点的BSA以及少量富集过程中非特异吸附的蛋白，这些干扰蛋白同样能够被胰蛋白酶所水解，在计算底物质量时应考虑在内。根据0.5mg包被了单克隆抗体的M270环氧树脂磁珠用于血浆样本的免疫沉淀，根据厂家的注释，1mg磁珠可结合的最低蛋白量为5μg左右，由此可推测血浆样本经免疫沉淀处理后的洗脱产物中总蛋白质量约为2.5μg。因此本实验通过向Aβ40和Aβ42标准品溶液中添加2.5μg的BSA以模拟血浆样本经免疫富集后的酶解底物中的总蛋白质量，参照上述(三)待测样品的前处理方法，保持其他条件一致，进行酶与底物比例的优化，具体分组设置见表12。此外，为了验证标准品样本的优化结果与实际血浆样本的一致性，本课题收集了临床检测后的混合血浆样本，按照与标准品组一致的分组设置，对实际血浆样本免疫沉淀处理后的产物进行了酶与底物比例的优化，具体分组见表13。
表12标准品样本酶与底物比例优化实验的分组设置
表13混合血浆样本酶与底物比例优化实验的分组设置
图6为标准品检测的结果，图7为血浆样本检测的结果，其中，图6A：Aβ40特征肽段绝对峰面积随酶与底物比例的变化；图6B：Aβ42特征肽段绝对峰面积随酶与底物比例的变化；图6C：Aβ40特征肽段与内标峰面积比随酶与底物比例的变化；图6D：Aβ42特征肽段与内标峰面积比随酶与底物比例的变化。图7A：Aβ40特征肽段绝对峰面积随酶与底物比例的变化；图7B：Aβ42特征肽段绝对峰面积随酶与底物比例的变化；图7C：Aβ40特征肽段与内标峰面积比随酶与底物比例的变化；图7D：Aβ42特征肽段与内标峰面积比随酶与底物比例的变化。
标准品组图6和血浆样本组图7特征肽段检测面积随酶与底物比例的变化趋势相似，均在酶与底物质量比为1:10至1:5时检测到特征肽段的面积最高，在此基础上继续增大酶的比例，特征肽段检测面积反而降低。此外，不同酶与底物比例组的特征肽段与其同位素内标的峰面积比值较为稳定，该结果表明胰蛋白酶对目标蛋白及其同位素标记的内标的酶解速率一致，酶与底物的比例仅影响相同酶解时间下，特征肽段的产生速率(特征肽段绝对峰面积)，而对最终的浓度测定(特征肽段与内标的峰面积比)无显著影响。为了保证样本的完全水解，最终确定以1:5的酶与底物的质量比加入胰蛋白酶对样本进行酶切处理，即胰蛋白酶与M270环氧树脂磁珠的质量比为1:1000。
3、酶解时间的优化
参照上述(三)待测样品的前处理方法，保持其他条件一致，酶与底物比例的优化得到的酶与底物、M270环氧树脂磁珠的比例，考察了不同孵育时间下的酶解效率。分别设置酶解反应时间为2h、4h、6h、12h、14h和16h，对相同样本在不同酶解反应时间下检测到的绝对峰面积进行了比较，并考察了不同酶解时间对特征肽段峰面积与其同位素标记内标的比值的影响。
特征肽段检测面积随酶解时间的变化趋势见图8。Aβ40特征肽段绝对峰面积(图8A)，Aβ42特征肽段绝对峰面积(图8B)，Aβ40特征肽段与内标峰面积比(图8C)，Aβ42特征肽段与内标峰面积比(图8D)随酶切反应时间的变化按照酶与底物1：5的质量比加入胰蛋白酶对Aβ40和Aβ42进行酶切，当酶解时间为12-16h时检测到的特征肽段绝对峰面积相对最高且基本保持稳定。此外，在酶解时间不同的样本中检测到的特征肽段与其同位素内标的峰面积比值较为稳定(图8C，D)，可认为胰蛋白酶对目标蛋白及其同位素标记的内标的酶解速率一致，酶解时间仅影响在相同酶与底物比例下，特征肽段的产生速率(特征肽段绝对峰面积)，而对最终的浓度测定(特征肽段与内标的峰面积比)无显著影响。为了确保待测样本尽量完全被胰蛋白酶水解，最终设置酶解反应时间为14h。
五、血浆β-淀粉样蛋白检测方法的性能评价及初步应用
(一)、标准曲线的建立及线性范围
使用质量浓度3％BSA的PBS溶液替代基质建立标准曲线y＝ax+b，对血浆样品中内源性Aβ42和Aβ40的浓度进行准确测定。
根据文献报道的血浆Aβ42和Aβ40的大致浓度范围，分别选择500pg/mL和1000pg/mL作为Aβ42和Aβ40的检测上限进行线性范围的验证。对标准品样本进行一系列的稀释得到待测样本(Aβ42/Aβ40：500/1000pg/mL，200/500pg/mL，100/200pg/mL，50/100pg/mL，20/50pg/mL，10/20pg/mL)，每天测定1批样本，重复测定6天，对所有结果进行线性回归分析，其线性相关系数r应至少大于0.999。
对于Aβ42检测，配制10到500pg/mL的一系列浓度的标准品，经6次重复测定得到的回归方程为：y＝0.9922x+1.296，r＝0.9998。候选参考方法线性范围为10-500pg/mL。对于Aβ40检测，配制20到1000pg/mL一系列浓度的标准品，经6次重复测定得到的回归方程为：y＝0.9961x+1.232，r＝0.9997。候选参考方法线性范围为20-1000pg/mL。
(二)精密度
参考CLSI-EP5《Precision Performance of Quantitative MeasurementMethods》进行候选方法的精密度评价，选择质控品1，质控品2和质控品3三个浓度水平的样本，每天处理3批样本，每批重复测定5次，重复测定3天。
实验结果如表14所示，对于Aβ40的检测，候选参考方法的批内精密度为2.67％-3.78％，批间精密度为3.68％-4.33％，对于Aβ42的检测，候选参考方法的批内精密度为3.43％-4.78％，批间精密度为4.21％-5.44％。
表14候选参考方法精密度
(三)正确度
采用加标回收实验进行正确度进行评价。按照低、中、高三个水平向基线血浆中添加已知浓度的Aβ42和Aβ40标准品，Aβ42加入的终浓度分别为10，50，150pg/mL，Aβ40加入的终浓度分别为50，200，500pg/mL。使用候选参考方法对基线血浆以及低、中、高加标样本进行检测，重复测量3批，每批重复检测5次，根据测量浓度与基线血浆浓度之差与加标浓度的比值计算回收率。
为进一步确认候选参考方法的正确度，对国际有证参考物质ERM-DA480/IFCC，ERM-DA481/IFCC和ERM-DA482/IFCC进行了检测，每个样本重复测定5次，比较候选参考方法结果与参考物质证书的认证值之间的偏倚。
(1)加标回收率
如表15所示，Aβ40的加标回收率为93.2％-105.6％，Aβ42的加标回收率为95.3％-108.2％，整体回收率在90％-110％之间。
表15候选参考方法加标回收率
(2)国际有证标准物质的检测
国际有证参考物质ERM-DA480/IFCC，ERM-DA481/IFCC和ERM-DA482/IFCC的检测结果见表16，候选参考方法的检测结果与参考物质的认证浓度之间的偏倚分别为-2.7％，-1.1％和-1.7％，均小于其不确定度。
表16国际有证标准物质的检测结果
*由于标准物质的浓度高于候选参考方法的测量范围，因此对标准物质进行稀释后检测，此处的测量浓度为经过稀释倍数修正后的浓度
(四)灵敏度
候选参考方法的检测限(Limit ofdetection，LOD)需满足信噪比(Signal tonoise，S/N)≥3；定量限(Limitofquantification，LOQ)需满足S/N≥10，并且CV＜10％。将20pg/mL样本进行一系列稀释：20pg/mL、10pg/mL、5pg/mL，根据不同浓度样本的S/N以及5次重复测量的CV确定LOD和LOQ。
对于Aβ40的检测，候选参考方法的LOD为10pg/mL(S/N＞3)，LOQ为20pg/mL(S/N≥10，CV＝5.1％，n＝5)。对于Aβ42的检测，候选参考方法的LOD为5pg/mL(S/N＞3)，LOQ为10pg/mL(S/N≥10，CV＝7.7％，n＝5)。色谱峰图见图9，图9A为Aβ40的LOD，图9B为Aβ40的LOQ，图9C为Aβ42的LOD，图9D为Aβ42的LOQ。
(五)稀释因子
使用3％BSA-PBS对混合血浆样本或脑脊液样本进行4，8和16倍稀释，将稀释与未稀释样本同时进行检测。稀释样本的测量浓度乘以稀释倍数得到稀释修正浓度，稀释修正浓度与未稀释样本测量浓度的偏倚小于10％为可接受范围。
经连续稀释的脑脊液或血浆样本中Aβ40和Aβ42的检测偏倚均在5％以内(表17)，可认为脑脊液和血浆样本经过最高16倍连续稀释后对定量结果无明显影响。
表17检测方法稀释因子验证
注：稀释修正浓度＝测量浓度×稀释倍数；偏倚＝(稀释修正浓度-未稀释样本测量浓度)×100％
(六)基质效应
使用纯溶剂基质(1％NH4OH+20％ACN)、血浆替代基质(3％BSA-PBS)和混合血浆基质分别对标准品进行系列稀释，比较三种不同基质的校准曲线的一致程度。若不同基质校准曲线斜率的比值在95-105％之间，则可认为基质效应对定量结果无明显影响。
实验结果如表18所示，3％BSA-PBS替代基质标准曲线、纯溶剂标准曲线以及血浆基质标准曲线的一致性较高，替代基质以及纯溶剂基质与血浆基质标准曲线斜率的比值均在99-102％之间，可认为基质效应对最终检测无明显影响。
表18不同基质标准曲线的比较
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (7)

1.一种血浆β-淀粉样蛋白检测方法，其特征在于，所述血浆β-淀粉样蛋白检测方法检测的目标物为Aβ40蛋白和Aβ42蛋白；
所述血浆β-淀粉样蛋白检测方法包括以下步骤：
（1）将15N-Aβ40蛋白和15N-Aβ42蛋白作为内标与待测血浆样品混匀，混匀后两种内标的终浓度为80~120pg/mL；将加入内标的待测血浆样品与包被β-淀粉样蛋白N端特异性单克隆抗体的树脂磁珠混合得到混合体系a于25~30℃下孵育2~4小时；
（2）去除混合体系a中的液体得到免疫沉淀的树脂磁珠，清洗免疫沉淀的树脂磁珠后对免疫沉淀的树脂磁珠进行洗脱，收集洗脱液；
（3）去除步骤（2）得到的洗脱液中的溶剂，用碳酸氢铵溶液复溶后与定量胰蛋白酶混匀后进行酶解反应，加入终止剂终止酶解反应后得到样本a，将样本a除盐得到样本b；
（4）将样本b进液相二级质谱仪检测Aβ40蛋白、Aβ42蛋白以及作为内标的15N-Aβ40蛋白和15N-Aβ42蛋白，以样本b中Aβ42蛋白和Aβ40蛋白的特征肽段在液相二级质谱仪中的信号定量Aβ40蛋白和Aβ42蛋白，其中Aβ40蛋白的特征肽段为肽段GAIIGLMVGGVV，Aβ42蛋白的特征肽段为肽段GAIIGLMVGGVVIA，内标15N-Aβ40蛋白和15N-Aβ42蛋白特征肽段分别为15N标记的肽段15N-[GAIIGLMVGGVV]、肽段15N-[GAIIGLMVGGVVIA]，通过选择特征肽段在液相二级质谱仪中的母离子和子离子进行定性和定量，其中肽段GAIIGLMVGGVV的母离子为1085.64+，15N-[GAIIGLMVGGVV]的母离子为1097.6+，肽段GAIIGLMVGGVVIA的母离子为635.38++，肽段15N-[GAIIGLMVGGVVIA]的母离子为642.36++；
所述肽段GAIIGLMVGGVV的子离子包括656.38、755.45、812.47、869.49和968.56，分别对应b7+、b8+、b9+、b10+和b11+；
所述肽段15N-[GAIIGLMVGGVV]的子离子包括663.36、763.42、821.44、879.46和979.53，分别对应b7+、b8+、b9+、b10+和b11+；
所述肽段GAIIGLMVGGVVIA的子离子包括656.38、755.45、812.47、869.49、968.56、1067.63和1180.71，分别对应b7+、b8+、b9+、b10+、b11+、b12+和b13+；
所述肽段15N-[GAIIGLMVGGVVIA]的子离子包括663.36，763.42，821.44，879.46，979.53，1079.59和1193.67，分别对应b7+、b8+、b9+、b10+、b11+、b12+和b13+；
所述步骤（4）中，液相二级质谱仪检测的液相色谱条件包括：
色谱柱：ACQUITY UPLC® BEH C18色谱柱：1.7μm，2.1×50mm；柱温：40℃；流动相流速：0.3 mL/min；流动相水相为18~22mmol/L氟化铵溶液，流动相有机相为乙腈；流动相的梯度为0~1分钟，水相体积保持为95%，1~3.5分钟，水相体积由95%变为10%，3.5~4.5分钟，水相体积保持为10%，4.5~4.6分钟水相体积由10%变为95%，4.6~6分钟后水相体积保持为95%；
所述步骤（4）中，液相二级质谱仪检测的质谱条件包括：用于肽段GAIIGLMVGGVVIA检测的锥孔电压为20 V，碰撞电压为15 V；用于肽段GAIIGLMVGGVV检测的锥孔电压为20 V，碰撞电压为28 V，毛细管电压设置为2.7 kV、去溶剂温度设置为650 ℃、去溶剂气流设置为1200L/Hr和锥孔气流设置为150 L/Hr。
2.根据权利要求1所述血浆β-淀粉样蛋白检测方法，其特征在于，所述肽段GAIIGLMVGGVV的定量子离子为968.56，对应b11+，所述肽段GAIIGLMVGGVV的定性子离子为755.45，对应b8+，所述肽段GAIIGLMVGGVVIA的定量子离子为1067.63，对应b12+，所述肽段GAIIGLMVGGVVIA的定性子离子为968.56，对应b11+。
3.根据权利要求1所述血浆β-淀粉样蛋白检测方法，其特征在于，所述步骤（3）中胰蛋白酶的用量为：胰蛋白酶的质量与步骤（1）中树脂磁珠的质量比例为1：（200~2000），步骤（3）中酶解的时间为12~16小时，步骤（3）中用于复溶的碳酸氢铵的溶液的浓度为80~120mM，体积为50~300 μL，步骤（3）中的终止剂为甲酸。
4.根据权利要求1所述血浆β-淀粉样蛋白检测方法，其特征在于，所述步骤（1）中所述树脂磁珠为M270环氧树脂磁珠，所述待测血浆样品与M270环氧树脂磁珠的用量比例为每1mL待测血浆样品与0.8~1.2mg包被β-淀粉样蛋白N端特异性单克隆抗体的M270环氧树脂磁珠混合。
5.根据权利要求4所述血浆β-淀粉样蛋白检测方法，其特征在于，所述包被β-淀粉样蛋白N端特异性单克隆抗体的M270环氧树脂磁珠的制备方法包括以下步骤：
（a）将M270环氧树脂磁珠用磷酸缓冲盐溶液活化M270环氧树脂磁珠后去除液相收集M270环氧树脂磁珠；
（b）将0.8~1.2moL/L的硫酸铵-磷酸缓冲盐溶液重悬M270环氧树脂后与β-淀粉样蛋白N端特异性单克隆抗体混合后孵育8~12小时后去除液体收集M270环氧树脂磁珠，所述β-淀粉样蛋白N端特异性单克隆抗体与所述M270环氧树脂磁珠的用量比例为3.0~3.5mL抗体比1gM270环氧树脂磁珠；
（c）将步骤（b）收集的M270环氧树脂磁珠与质量浓度0.08~0.12%的牛血清白蛋白的磷酸缓冲盐溶液混合静置10~15分钟后去除液体收集M270环氧树脂磁珠；M270环氧树脂磁珠与牛血清白蛋白的磷酸缓冲盐溶液的比例为4~6mgM270环氧树脂磁珠比1mL牛血清白蛋白的磷酸缓冲盐溶液；
（d）重复步骤（c）2~3次得到所述包被β-淀粉样蛋白N端特异性单克隆抗体的M270环氧树脂磁珠。
6.根据权利要求1所述血浆β-淀粉样蛋白检测方法，其特征在于，所述步骤（1）中，包被β-淀粉样蛋白N端特异性单克隆抗体的树脂磁珠与加入内标的待测血浆样品的比例为0.8~1.2mg包被β-淀粉样蛋白N端特异性单克隆抗体的树脂磁珠比1mL加入内标的待测血浆样品，所述步骤（2）中的洗脱液为甲酸水溶液和乙腈的混合液，其中，甲酸水溶液和乙腈的体积比为（0.8~1.2）：1，甲酸水溶液的质量浓度为1.8~2.2%。
7.根据权利要求1所述血浆β-淀粉样蛋白检测方法，其特征在于，所述步骤（3）中，将样本a除盐得到样本b的方法为：用活化、平衡后的C18 SPE柱，将样本a过C18 SPE柱，用冲洗液冲洗C18 SPE柱，然后用洗脱液洗脱C18 SPE柱并收集洗脱C18 SPE柱后的滤液得到样本b，其中冲洗液为体积分数95%的质量浓度0.1%的三氟乙酸水溶液与体积分数5%甲醇的混合液，洗脱液为体积分数20%的质量浓度0.1%的三氟乙酸水溶液与体积分数80%乙腈的混合液；所述C18 SPE柱为GL Science C18固相萃取柱。
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