JP2022007101A - Ａβペプチドを測定するための抗体セット、Ａβペプチドの測定方法及び試薬キット - Google Patents
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Abstract
【課題】本発明は、血液中のAβペプチドのより優れた測定を可能にする手段を提供することを目的とする。【解決手段】イムノアッセイにより血液試料中のAβペプチドを測定するための抗体セットであって、抗体セットが、Aβペプチドに特異的に結合する捕捉抗体及び検出抗体を含み、捕捉抗体が、AβペプチドのＮ末端残基を含むエピトープに結合する抗体であり、検出抗体が、捕捉抗体が結合するエピトープとは異なるエピトープに結合する抗体であり、Aβペプチドが、Aβ40及びAβ42の少なくとも１つである、抗体セットにより、上記課題を解決する。【選択図】図１０Ｃ
Description
特許法第３０条第２項適用申請有り 令和１年１１月３０日に、第１２回アルツハイマー病 臨床試験会議（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌｓ ｏｎ Ａｌｚｈｍｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ）の要旨集が公開、 令和１年１２月４日の第１２回アルツハイマー病臨床試験会議（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌｓ ｏｎ Ａｌｚｈｍｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ）にて発表、および 令和２年３月６日の「第１７回 技術説明会」にて配信
本発明は、Aβペプチドを測定するための抗体セットに関する。本発明は、Aβペプチドの測定方法に関する。本発明は、試薬キットに関する。
被検者から採取した生体試料中のAβペプチドは、アルツハイマー病のバイオマーカーとなることが知られている。生体試料の中でも、脳脊髄液(CSF)はAβペプチドを比較的多く含むことから、CSF中のAβペプチドを定量的に測定する方法が確立されている。例えば、非特許文献１には、CSF中のAβペプチドを液体クロマトグラフィー質量分析法(LC-MS)により測定することが記載されている。
Leinenbach A.ら，Mass Spectrometry-Based Candidate Reference Measurement Procedure for Quantification of Amyloid-β in Cerebrospinal Fluid. Clinical Chemistry 60:7 987-994 (2014)
CSFの採取は侵襲的であるので、被検者への負担が大きい。そのため、近年、採取の負担が少ない血液を生体試料に用いるAβペプチドの測定方法が開発されている。しかし、CSFに比べて血液に含まれるAβペプチドは少ないことから、精度よくAβペプチドを測定する方法が求められている。本発明は、血液中のAβペプチドを精度よく測定することを可能にする手段を提供することを目的とする。
本発明は、イムノアッセイにより血液試料中のAβペプチドを測定するための抗体セットであって、抗体セットが、Aβペプチドに特異的に結合する捕捉抗体及び検出抗体を含み、捕捉抗体が、AβペプチドのＮ末端残基を含むエピトープに結合する抗体であり、検出抗体が、捕捉抗体が結合するエピトープとは異なるエピトープに結合する抗体であり、Aβペプチドが、Aβ40及びAβ42の少なくとも１つである、抗体セットを提供する。また、本発明は、Aβペプチドに特異的に結合する捕捉抗体及び検出抗体を含む抗体セットを用いるAβペプチドの測定方法を提供する。また、本発明はAβペプチドに特異的に結合する捕捉抗体及び検出抗体を含む試薬キットを提供する。
本発明は、血液中のAβペプチドを精度よく測定することを可能にする。
本実施形態の一つは、イムノアッセイにより血液試料中のAβペプチドを測定するための抗体セットである。抗体セットとは、イムノアッセイに用いられる捕捉抗体及び検出抗体を少なくとも含む、複数の抗体の組み合わせをいう。イムノアッセイの種類は特に限定されず、例えば、酵素結合免疫吸着法(ELISA)、免疫沈降／ウェスタンブロット法、免疫複合体転移法(特開平１-254868号公報参照)などの公知の免疫測定方法から適宜選択できる。それらの中でもELISA法が好ましい。ELISA法の種類は、サンドイッチ法、競合法、直接法、間接法などのいずれであってもよいが、好ましくはサンドイッチ法である。本実施形態の抗体セットを用いるイムノアッセイは、HISCL（登録商標）シリーズ(シスメックス株式会社)などの市販の免疫測定装置により行ってもよい。
本明細書において「血液試料」との用語は、Aβペプチドを含む血液試料、及びAβペプチドを含むことが疑われる血液試料を包含する。血液試料は、例えば血液(全血)、血漿、血清などが挙げられる。これらの中でも、血漿及び血清が好ましい。血液試料は、必要に応じて適切な水性媒体で希釈してもよい。そのような水性媒体は、後述の測定を妨げないかぎり特に限定されず、例えば水、生理食塩水、緩衝液などが挙げられる。緩衝液は、中性付近のpH(例えば６以上８以下のpH)で緩衝作用を有する緩衝液が好ましい。そのような緩衝液は、例えばHEPES、MES、PIPESなどのグッド緩衝液、トリス緩衝生理食塩水(TBS)、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)などが挙げられる。
血液試料の由来は特に限定されず、例えば、被検者から採取した血液及びそれから調製した血漿又は血清であってもよい。また、市販のプール血漿、健常者血漿などを用いてもよい。必要に応じて、血液試料に、内部標準物質としての標識Aβペプチドを添加してもよい。被検者は特に限定されず、例えば、健常者、認知機能に異常がある者及びその異常の疑いがある者などが挙げられる。認知機能の異常は、例えば、軽度認知機能異常(MCI)、アルツハイマー型認知症などが挙げられる。
Aβペプチドは、アミロイドβ前駆体タンパク(APP)がβセクレターゼ及びγセクレターゼによる処理を受けることで産生されるポリペプチドである。Aβペプチドは、特に言及しない限り、いずれの長さのポリペプチドも含むが、通常39～43のアミノ酸からなるポリペプチドである。Aβペプチドとしては、40アミノ酸残基からなるAβ40(DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV : 配列番号１)及び42アミノ酸残基からなるAβ42(DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA : 配列番号２)が好ましい。
Aβペプチドは、単量体であってもよいし、多量体の形態であってもよい。多量体は、重合体とも呼ばれ、複数の単量体のAβペプチドが物理的又は化学的に重合あるいは凝集して形成される。多量体は、単量体のAβペプチドが複数含まれていればよく、その他の分子が含まれていてもよい。多量体において、単量体のAβペプチド同士は共有結合などによって強固に結合している必要はない。多量体には、より緩やかな結合によって複数の単量体のAβペプチドが集合した凝集体も含まれる。Aβペプチドの多量体としては、例えばAβオリゴマーなどが挙げられる。
本明細書において「抗体」との用語は、全長の抗体及びそのフラグメントを包含する。抗体のフラグメントとしては、例えばFab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fd'、Fv、軽鎖、重鎖抗体の重鎖可変領域(VHH)、還元型IgG(rIgG)、一本鎖抗体(scFv)などが挙げられる。Aβペプチドに特異的に結合する抗体は、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体のいずれであってもよいが、好ましくはモノクローナル抗体である。
捕捉抗体とは、被検物質と特異的に結合する抗体であって、固相に固定されている。被検物質と捕捉抗体とが結合することにより、被検物質が固相上に固定される。検出抗体とは、被検物質と特異的に結合する抗体である。検出抗体は、標識物質で標識されていることが好ましい。該標識物質については後述の通りである。検出抗体は、通常、固相に固定されていないが、標識物質自体が粒子などの固相担体である場合もある。本実施形態の抗体セットは、Aβペプチドに特異的に結合する捕捉抗体及び検出抗体を含む。Aβペプチドに特異的に結合する捕捉抗体は、AβペプチドのＮ末端残基を含むエピトープに結合する抗体である。Aβペプチドに特異的に結合する検出抗体は、捕捉抗体が結合するエピトープとは異なるエピトープに結合する抗体である。本実施形態の抗体セットにおいて、Aβペプチドは、Aβ40及びAβ42の少なくとも１つである。
本実施形態において、捕捉抗体が結合する、AβペプチドのＮ末端残基を含むエピトープは、AβペプチドのＮ末端残基を含み、且つAβペプチドのアミノ酸配列の一部からなる領域をいう。捕捉抗体の好ましいエピトープは、AβペプチドのＮ末端残基を含み、且つAβペプチドのＮ末端から数えて１～16番目のアミノ酸残基からなる領域に含まれる。そのようなエピトープとしては、例えば、AβペプチドのＮ末端から数えて１～５番目、１～６番目、１～７番目、１～８番目、１～９番目、１～10番目、１～11番目、１～12番目、１～13番目、１～14番目、１～15番目又は１～16番目のアミノ酸残基からなる領域が挙げられる。そのようなエピトープに結合する抗体としては、例えば、AβペプチドのＮ末端のアミノ酸残基から数えて１～16番目の領域をエピトープとして認識するクローン82E1の抗体(82E1抗体と呼ぶ)、及びAβペプチドのＮ末端から数えて１～８番目の領域をエピトープとして認識するクローン2H4の抗体(2H4抗体と呼ぶ)が挙げられる。それらの中でも82E1抗体が特に好ましい。これらのモノクローナル抗体は市販されている。
本実施形態において、検出抗体が結合するエピトープは、上記の捕捉抗体が結合するエピトープと異なる。換言すると、捕捉抗体と検出抗体とは抗原であるAβペプチドとの結合において実質的に競合しない。検出抗体のエピトープは、AβペプチドのＣ末端残基を含むことが好ましい。検出抗体が結合する、AβペプチドのＣ末端残基を含むエピトープは、AβペプチドのＣ末端残基を含み、且つAβペプチドのアミノ酸配列の一部からなる領域をいう。検出抗体の好ましいエピトープは、AβペプチドのＣ末端残基を含み、且つAβ40のＮ末端から数えて35～40番目のアミノ酸残基又はAβ42のＮ末端から数えて36～42番目のアミノ酸残基からなる領域に含まれる。そのようなエピトープとしては、例えば、Aβ40のＮ末端から数えて35～40番目のアミノ酸残基からなる領域、及びAβ42のＮ末端から数えて36～40番目のアミノ酸残基からなる領域が挙げられる。AβペプチドのＣ末端残基を含むエピトープに結合する抗体としては、例えば、Aβ42のＮ末端から数えて36～42番目の領域をエピトープとして認識するクローンH31L21の抗体(H31L21抗体と呼ぶ)、及びAβ40のＮ末端から数えて35～40番目の領域をエピトープとして認識とするクローン1A10の抗体(1A10抗体と呼ぶ)が挙げられる。これらのモノクローナル抗体は市販されている。
本実施形態の抗体セットと異なる組み合わせの抗体セットを用いた測定方法がWO2007/022015Aに記載されている。この文献に記載の方法では、捕捉抗体として1A10抗体を用い、検出抗体として82E1抗体を用いる。この文献には、捕捉抗体として82E1抗体を用いるとAβ検出の感度を低下させると記載されている。しかし、本実施形態では、捕捉抗体として、82E1抗体のようなAβペプチドのＮ末端残基を含むエピトープに結合する抗体をイムノアッセイに用いることで、Aβペプチドの高感度の検出が可能である。
抗体セットに含まれる捕捉抗体及び検出抗体はそれぞれ、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体のいずれであってもよいが、好ましくはモノクローナル抗体である。好ましい実施形態では、捕捉抗体及び検出抗体の両方がモノクローナル抗体である。
本実施形態では、捕捉抗体は、あらかじめ固相に固定されていることが好ましい。固相は、抗体を固定可能な不溶性の担体であればよい。抗体の固相への固定の態様は、特に限定されない。例えば、抗体と固相とを直接結合させてもよいし、抗体と固相とを別の物質を介して間接的に結合させてもよい。直接の結合としては、例えば物理的吸着などが挙げられる。間接的な結合としては、例えば、抗体と特異的に結合する分子を固相上に固定化し、該分子と抗体との結合を介して、抗体を固相上に固定することが挙げられる。抗体と特異的に結合する分子としては、プロテインＡ又はＧ、抗体を特異的に認識する抗体(二次抗体)などが挙げられる。また、抗体と固相との間を介在する物質の組み合わせを用いて、抗体を固相上に固定することもできる。そのような物質の組み合わせとしては、ビオチン類とアビジン類、ハプテンと抗ハプテン抗体などの組み合わせが挙げられる。ビオチン類とは、ビオチン、並びにデスチオビオチン及びオキシビオチンなどのビオチン類縁体を含む。アビジン類とは、アビジン、並びにストレプトアビジン及びタマビジン(登録商標)などのアビジン類縁体を含む。ハプテンと抗ハプテン抗体の組み合わせとしては、2, 4-ジニトロフェニル(DNP)基を有する化合物と抗DNP抗体との組み合わせが挙げられる。例えば、あらかじめビオチン類(又はDNP基を有する化合物)で修飾した抗体と、あらかじめアビジン類(又は抗DNP抗体)を結合した固相とを用いることにより、ビオチン類とアビジン類との結合(又はDNP基と抗DNP抗体との結合)を介して、抗体を固相上に固定できる。
固相の素材は特に限定されず、例えば、有機高分子化合物、無機化合物、生体高分子などから選択できる。有機高分子化合物としては、ラテックス、ポリスチレン、ポリプロピレン、スチレン－メタクリル酸共重合体、スチレン－グリシジル(メタ)アクリレート共重合体、スチレン－スチレンスルホン酸塩共重合体、メタクリル酸重合体、アクリル酸重合体、アクリロニトリルブタジエンスチレン共重合体、塩化ビニル－アクリル酸エステル共重合体、ポリ酢酸ビニルアクリレートなどが挙げられる。無機化合物としては、磁性体(酸化鉄、酸化クロム、コバルト及びフェライトなど)、シリカ、アルミナ、ガラスなどが挙げられる。生体高分子としては、不溶性アガロース、不溶性デキストラン、ゼラチン、セルロースなどが挙げられる。これらのうちの２種以上を組み合わせて用いてもよい。固相の形状は特に限定されず、例えば粒子、マイクロプレート、マイクロチューブ、試験管などが挙げられる。それらの中でも粒子が好ましく、磁性粒子が特に好ましい。
検出抗体は、標識物質で標識されていることが好ましい。標識物質は特に限定されず、例えば、それ自体がシグナルを発生する物質(以下、「シグナル発生物質」ともいう)であってもよいし、他の物質の反応を触媒してシグナルを発生させる物質であってもよい。シグナル発生物質としては、例えば、蛍光物質、放射性同位元素などが挙げられる。蛍光物質としては、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、ローダミン、Alexa Fluor(登録商標)などの蛍光色素、GFPなどの蛍光タンパク質などが挙げられる。放射性同位元素としては、125Ｉ、14Ｃ、32Ｐなどが挙げられる。他の物質の反応を触媒して検出可能なシグナルを発生させる物質としては、例えば酵素が挙げられる。標識物質は、酵素であることがより好ましい。酵素としては、例えば、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、グルコシダーゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、チロシナーゼ、酸性ホスファターゼ、ルシフェラーゼなどが挙げられる。それらの中でも、アルカリホスファターゼが特に好ましい。
シグナルを検出する方法自体は、当該技術において公知である。本実施形態では、上記の標識物質に由来するシグナルの種類に応じた測定方法を適宜選択すればよい。例えば、標識物質が酵素である場合、該酵素に対する基質を反応させることによって発生する光、色などのシグナルを、分光光度計などの公知の装置を用いて測定することにより行うことができる。
酵素の基質は、該酵素の種類に応じて公知の基質から適宜選択できる。例えば、酵素としてアルカリホスファターゼを用いる場合、基質として、CDP-Star(登録商標)(4-クロロ-3-(メトキシスピロ[1, 2-ジオキセタン-3, 2'-(5'-クロロ)トリクシロ[3. 3. 1. 13, 7]デカン]-4-イル)フェニルリン酸２ナトリウム)、CSPD(登録商標)(3-(4-メトキシスピロ[1, 2-ジオキセタン-3, 2-(5'-クロロ)トリシクロ[3. 3. 1. 13, 7]デカン]-4-イル)フェニルリン酸２ナトリウム)などの化学発光基質、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルリン酸(BCIP)、5-ブロモ-6-クロロ－インドリルリン酸２ナトリウム、p-ニトロフェニルリン酸などの発色基質が挙げられる。また、酵素としてペルオキシダーゼを用いる場合、基質としては、ルミノール及びその誘導体などの化学発光基質、2, 2'-アジノビス(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸アンモニウム)(ABTS)、1, 2-フェニレンジアミン(OPD)、3, 3',5, 5'-テトラメチルベンジジン(TMB)などの発色基質が挙げられる。
標識物質が放射性同位体である場合は、シグナルとしての放射線を、シンチレーションカウンターなどの公知の装置を用いて測定できる。また、標識物質が蛍光物質である場合は、シグナルとしての蛍光を、蛍光マイクロプレートリーダーなどの公知の装置を用いて測定できる。なお、励起波長及び蛍光波長は、用いた蛍光物質の種類に応じて適宜決定できる。
イムノアッセイの一例として、本実施形態の抗体セットを用いるサンドイッチELISA法により血液試料中のAβペプチドを測定する場合について、以下に説明する。まず、血液試料と捕捉抗体とを混合することにより、該血液試料中のAβペプチドと捕捉抗体との複合体を形成する。そして、複合体を含む溶液と、捕捉抗体を固定できる固相とを接触することにより、複合体を固相上に形成する。あるいは、捕捉抗体をあらかじめ固定させた固相を用いてもよい。すなわち、捕捉抗体を固定した固相と血液試料とを接触することにより、該血液試料中のAβペプチドと捕捉抗体との複合体を固相上に形成する。次いで、固相上に形成された複合体と、検出抗体とを接触することにより、Aβペプチドと捕捉抗体と検出抗体とのサンドイッチ複合体を固相上に形成する。
そして、固相上に形成された複合体を、当該技術において公知の方法で検出することにより、血液試料に含まれるAβペプチドの測定値を取得できる。例えば、検出抗体として、標識物質で標識した抗体を用いた場合は、その標識物質により生じるシグナルを検出することにより、血液試料におけるAβペプチドの測定値を取得できる。あるいは、検出抗体に対する標識二次抗体を用いた場合も、同様にしてAβペプチドの測定値を取得できる。標識物質については、上述のとおりである。
本明細書において、「シグナルを検出する」とは、シグナルの有無を定性的に検出すること、シグナル強度を定量すること、及び、シグナルの強度を半定量的に検出することを含む。半定量的な検出とは、シグナルの強度を、「シグナル発生せず」、「弱」、「中」、「強」などのように段階的に示すことをいう。本実施形態では、シグナルの強度を定量的に検出することが好ましい。
シグナルの検出結果は、血液試料中のAβペプチドの測定結果として用いることができる。例えば、シグナルの強度を定量する場合は、シグナル強度の測定値自体又は該測定値から取得される値を、Aβペプチドの測定結果として用いることができる。シグナル強度の測定値から取得される値としては、例えば、該測定値からネガティブコントロールの測定値又はバックグラウンドの値を差し引いた値などが挙げられる。ネガティブコントロールは適宜選択できるが、例えば、Aβペプチドを含まない溶液(例えば緩衝液) である。
本実施形態では、シグナル強度の測定値を検量線に当てはめて、Aβペプチドの量又は濃度の値を決定してもよい。検量線は、Aβペプチドを既知濃度で含むキャリブレータを、血液試料と同様に、本実施形態のイムノアッセイにより測定し、得られた測定値から作成できる。具体的には、Ｘ軸にキャリブレータ中のAβペプチドの濃度をとり、Ｙ軸に測定値(例えばシグナル強度)をとったＸＹ平面に、複数のキャリブレータから取得したAβペプチドの測定値をプロットし、最小二乗法などの公知の方法により直線又は曲線を得ることで、検量線を作成できる。Aβペプチドを既知濃度で含むキャリブレータは、例えば、Aβペプチドを含まない緩衝液に合成Aβペプチドを任意の濃度で添加して調製できる。
本実施形態の抗体セットを用いるイムノアッセイでは、複合体の形成と検出との間に、複合体を形成していない未反応の遊離成分を除去するB/F分離を行ってもよい。B/F分離については後述する。
本実施形態の抗体セットを用いるイムノアッセイは、市販の全自動免疫測定装置により行ってもよい。全自動免疫測定装置とは、ユーザが血液試料などの生体試料をセットして測定開始の指示を入力すると、測定試料の調製及びその免疫測定を自動的に行って、被検物質の測定結果を出力する装置である。そのような全自動免疫測定装置としては、例えばHISCL(登録商標)-5000やHISCL(登録商標)-800などのHISCL（登録商標）シリーズ(シスメックス株式会社) 又はHI-1000（シスメックス株式会社）が挙げられる。
他方、Aβペプチドは、抗体で捕捉したAβペプチドを質量分析法により測定する方法(以下、「測定方法」とも呼ぶ)により測定することができる。この測定方法は、有機溶媒を含む塩基性溶液により、Aβペプチドと抗体との複合体からAβペプチドを遊離し、遊離したAβペプチドを質量分析法により測定することを特徴とする。
従来、抗体で捕捉された被検物質(すなわち、抗体と被検物質との複合体)から被検物質を遊離する場合は、酸性溶液が用いられる。これは、酸性溶液が一般に、被検物質と抗体との結合を解離する作用に優れるからである。例えば特開2018-194374号公報では、有機溶媒を含んでもよいpH１～４の酸性水溶液により複合体からAβペプチドを遊離することが記載されている。しかし、後述の実施例に示されるように、本発明者らは、遊離したAβペプチドを含む酸性溶液は、液体クロマトグラフィーと組み合わせた質量分析には適さないことを見出した。具体的には、遊離したAβペプチドを含む該酸性溶液をそのまま液体クロマトグラフィーに用いると、投入されたAβペプチドの一部が液体クロマトグラフィー装置の流路及びカラムに残存し、残存したAβペプチドが次のサンプルの測定に持ち越される現象(キャリーオーバーと呼ぶ)が生じた。キャリーオーバーが生じると、Aβペプチドの正確な測定ができない。キャリーオーバーを低減するためには、酸性溶液でAβペプチドを遊離した後、塩基性溶液で溶媒交換することが考えられる。しかしながら、この方法ではキャリーオーバーを低減できたとしても溶媒交換によってAβペプチドが損失するため、感度よく測定することが困難な場合がある。これに対して、有機溶媒を含む塩基性溶液を用いる本実施形態の測定方法では、キャリーオーバーするAβペプチドの量が顕著に低減される。よって、遊離したAβペプチドを含む塩基性溶液をそのまま液体クロマトグラフィーに用いても、Aβペプチドの正確な測定が可能であり、溶媒交換も不要である。
上記の測定方法では、まず、血液試料にAβペプチドに特異的に結合する抗体を混合して、Aβペプチドと抗体との複合体を形成する。Aβペプチドと抗体との複合体は、血液試料と、Aβペプチドに特異的に結合する抗体とを混合することにより形成できる。
上記の測定方法では、抗体は、Aβペプチドと特異的に結合できるモノクローナル抗体が好ましい。そのような抗体としては、例えば、82E1抗体、AβペプチドのＮ末端のアミノ酸残基から数えて３～８番目の領域をエピトープとして認識するクローン6E10の抗体(6E10抗体と呼ぶ)、AβペプチドのＮ末端のアミノ酸残基から数えて４～10番目の領域をエピトープとして認識するクローンWO-2の抗体(WO-2抗体と呼ぶ)、2H4抗体、H31L21抗体、Aβ42のＮ末端から数えて33～42番目の領域をエピトープとして認識とするクローンG2-11の抗体(G2-11抗体と呼ぶ)、Aβ42のＮ末端から数えて33～42番目の領域をエピトープとして認識とするクローン16C11の抗体(16C11抗体と呼ぶ)、Aβ42のＮ末端から数えて34～42番目の領域をエピトープとして認識とするクローン21F12の抗体(21F12抗体と呼ぶ)、1A10抗体などが挙げられる。これらのモノクローナル抗体は市販されている。
上記の測定方法では、Aβペプチドに特異的に結合する抗体として、Aβ40及びAβ42の一方又は両方に結合する抗体を用いることが好ましい。Aβ40に特異的に結合する抗体としては、例えばクローン1A10の抗体が挙げられる。Aβ42に特異的に結合する抗体としては、例えばクローンH31L21、G2-11、16C11及び21F12の抗体が挙げられる。Aβ40及びAβ42の両方に結合する抗体としては、例えばクローン82E1、6E10、WO-2及び2H4の抗体が挙げられる。これらの抗体を用いることにより、血液試料中のAβペプチドのうち、Aβ40及び／又はAβ42を選択的に捕捉できる。この場合、本実施形態の測定方法の遊離工程において、Aβ40及びAβ42の少なくとも１つを遊離することができ、測定工程において、Aβ40及びAβ42の少なくとも１つの測定値を取得できる。
上記の測定方法では、Aβ40及びAβ42の両方に結合する抗体を用いることが好ましい。この場合、上記の測定方法の遊離工程において、Aβ40及びAβ42を遊離することができ、測定工程において、Aβ40の測定値及びAβ42の測定値を取得できる。
上記の測定方法では、抗体により捕捉されたAβペプチドを選択的に取得するために、Aβペプチドと抗体との複合体を固相上に形成することが好ましい。複合体を含む溶液と、抗体を固定できる固相とを接触させることにより、複合体を固相上に形成できる。あるいは、Aβペプチドに特異的に結合する抗体をあらかじめ固相に固定して用いてもよい。固相に固定された抗体を用いることで、固相上に複合体を形成できる。具体的には、Aβペプチドに特異的に結合する抗体が固定された固相と、血液試料とを混合することにより、複合体が固相上に形成される。そして、未反応の成分と固相とを分離し、固相を回収することにより、複合体を選択的に取得できる。固相として粒子を用いる場合、上記の測定方法における複合体の形成工程は、一般的な免疫沈降法に相当する。
次いで、上記の測定方法では、有機溶媒を含む塩基性溶液(以下、「遊離試薬」とも呼ぶ)により複合体からAβペプチドを遊離する。遊離試薬は、抗体とAβペプチドとの結合を解離する作用を有すると考えられる。好ましい実施形態では、固相上に形成された複合体を含む溶液と、遊離試薬とを混合する。これにより、複合体からAβペプチドが遊離し、混合液中には、遊離したAβペプチドと、抗体が固定された固相とが存在する。例えば固相が磁性粒子である場合、遠心分離又は磁気分離により、抗体が固定された固相と、Aβペプチドを含む溶液とを分離することで、Aβペプチドを含む溶液を回収できる。
複合体と遊離試薬との接触の条件は特に限定されず、例えば、４℃以上42℃以下の温度の遊離試薬と、複合体とを接触させ、１分以上10分以下の時間で静置又は撹拌すればよい。遊離試薬の使用量は特に限定されず、例えば、１サンプル当たり10μL以上50μL以下の範囲から適宜決定できる。
遊離試薬は、塩基性溶液と有機溶媒とを混合するか、又は、水と塩基性物質と有機溶媒とを混合することにより得ることができる。塩基性溶液は、水と塩基性物質とを混合することにより得ることができる。アンモニア水などの市販の塩基性溶液を用いてもよい。塩基性物質としては、例えば、アンモニウムイオンを供与する物質などが挙げられる。アンモニウムイオンを供与する物質としては、例えばアンモニア、炭酸アンモニウム、重炭酸アンモニウムなどが挙げられる。遊離試薬中の塩基性物質は、１種類であってもよいし、２種類以上であってもよい。
有機溶媒としては、例えば、アセトニトリル、アセトン、１－プロパノール、２－プロパノール、ヘキサン、エタノール、ジメチルスルホキシド又はメタノールなどが挙げられる。遊離試薬中の有機溶媒は、１種類であってもよいし、２種類以上であってもよい。本実施形態では、遊離試薬は、有機溶媒として少なくともアセトニトリルを含むことが好ましく、有機溶媒としてアセトニトリルのみを含むことがより好ましい。
溶出試薬中の有機溶媒の濃度は特に限定されないが、20%以上、30%以上又は40%以上であることが好ましい。また、65%以下、60%以下又は55%以下であることが好ましい。なお、本明細書において有機溶媒の濃度「％」はすべて体積／体積％（v/v%）である。
遊離試薬のpHは、当業者が塩基性であると認識するpHであれば特に限定されない。遊離試薬のpHは、10.85以上、10.9以上、10.95以上、11.0以上、11.05以上、11.1以上、11.15以上、11.2以上、11.25以上、11.3以上、11.35以上又は11.4以上であることが好ましい。最も好ましいのは、遊離試薬のpHが11.4以上である。これにより、複合体からAβペプチドを特に効率よく遊離できる。また、遊離試薬のpHは、14.0以下、13.5以下、13.0以下、12.5以下、12.4以下、12.35以下、12.3以下、12.25以下、12.2以下、12.15以下、12.1以下、12.05以下又は12.0以下であることが好ましい。
遊離試薬のpHは、塩基性物質の添加量(又は濃度)によって調整できる。塩基性物質としてアンモニア又はその塩を用いる場合、遊離試薬中のアンモニウムイオンのモル濃度は、5.29mM以上、10.57mM以上、26.43mM以上、52.85mM以上、105.71mM以上、又は132.14mM以上であることが好ましい。また、当該モル濃度は、1586mM以下、1533mM以下、又は1480mM以下であることが好ましい。例えば、塩基性物質がアンモニアである場合、遊離試薬中のアンモニアの濃度は、0.01%以上、0.02% 以上、0.05% 以上、0.1% 以上、0.2% 以上又は0.25%以上であることが好ましい。また、当該濃度は、３%以下、2.9% 以下又は2.8%以下であることが好ましい。なお、本明細書においてアンモニアの濃度「％」は全て重量／重量％（w/w%）である。
遊離試薬は、複合体からのAβペプチドの遊離、及び質量分析法によるAβペプチドの測定に影響しない程度に安定化剤などの添加物が含まれていてもよい。添加物としては、牛血清アルブミン(BSA)、ヒトアルブミン、卵白アルブミン、グルコース等の単類、マルトース等の二糖類、マンニトール、ソルビトール等の糖アルコール、又はグリシンなどのアミノ酸等が挙げられる。添加物は、１種でもよいし、２種以上でもよい。
上記の測定方法は、複合体形成工程と、遊離工程との間に、複合体を形成していない未反応の遊離成分を除去する洗浄工程を含んでもよい。この洗浄工程は、B/F(Bound/Free)分離を含む。未反応の遊離成分とは、複合体を構成しない成分であり、例えば、Aβペプチドと結合しなかった抗体が挙げられる。洗浄方法は特に限定されないが、例えば、複合体を固相上に形成させている場合、固相が粒子であれば、遠心分離や磁気分離により粒子を回収し、上清を除去することにより、複合体と、未反応の遊離成分とを分離できる。固相がマイクロプレートやマイクロチューブなどの容器であれば、未反応の遊離成分を含む液を除去することにより、複合体と、未反応の遊離成分とを分離できる。未反応の遊離成分を除去した後、複合体を捕捉した固相をPBSなどの適切な水性媒体で洗浄してもよい。
そして、上記の測定方法では、遊離されたAβペプチドを質量分析法により測定する。質量分析法は、遊離されたAβペプチドが測定できれば特に限定されず、Aβペプチドを測定できる公知のイオン化法を用いることができる。そのようなイオン化法としては、例えばエレクトロスプレーイオン化(ESI)法、大気圧化学イオン化(APCI)法又はマトリックス支援レーザー脱離イオン化(MALDI)法などが挙げられる。これらのうち、ESI法が特に好ましい。
質量分析法に用いられる質量分析計は特に限定されず、公知の質量分析計から適宜選択できる。例えば、四重極(Q)型質量分析計、イオントラップ型(IT)型質量分析計、飛行時間(TOF)型質量分析計、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴(FTICR)型質量分析計、IT-TOF型質量分析計、Q-TOF型質量分析計、及びトリプル四重極(QqQ)型質量分析計などが挙げられる。これらのうち、MS/MS測定が可能な質量分析計を用いて測定することが好ましく、トリプル四重極型質量分析計を用いて測定することがより好ましい。
質量分析法では、質量分析計と液体クロマトグラフィー装置が組み合わされた液体クロマトグラフィー-質量分析(Liquid Chromatography-Mass Spectrometry : LC-MS)が用いられることが好ましく、液体クロマトグラフィーと、MS/MS測定が可能な質量分析計とを組み合わせたLC-MS/MSが用いられることがより好ましい。
液体クロマトグラフィー装置としては、質量分析計に接続できる限り特に限定されず、市販のHPLC(高速液体クロマトグラフィー : High Performance Liquid Chromatography)装置を用いることができる。液体クロマトグラフィー装置に接続するカラムは特に限定されず、市販のHPLC用カラムを用いることができる。本実施形態では、遊離試薬中に遊離したAβペプチドを液体クロマトグラフィー装置に供することができる。そのため、溶媒交換などのような測定前の処理が不要である。
カラムは特に限定されないが、例えば、逆相カラムを用いることができる。逆相カラムの充填材としては、例えば、シリカ系の充填材、ポリマー系の充填材などが挙げられる。それらの中でも、シリカ系の充填材が好ましい。シリカ系の充填材を有する逆相カラムとしては、耐塩基性のODSカラムがより好ましい。
液体クロマトグラフィーに用いる溶媒(移動相)としては、遊離試薬と同じ組成の溶液、又は遊離試薬に用いられる塩基性溶液を用いることができる。移動相中の有機溶媒の濃度は、特に限定されず、測定条件に応じて適宜設定できる。液体クロマトグラフィーは、単一濃度の移動相を用いたイソクラティック法を用いて行ってもよいし、組成の異なる複数種の移動相を組み合わせて用いるステップワイズ法又はグラジエント法を用いて行ってもよい。
測定における移動相の流速は、装置及びカラムの材質、耐圧性などの性質に応じて適宜設定できる。移動相の流速は、質量分析が適切に行われる流速に設定されることが好ましい。また、カラム温度や測定装置への試料の導入量なども、測定装置及びカラムにあわせて適宜設定できる。
上記の測定方法では、液体クロマトグラフィー装置でも測定を行い、試料に関する情報を取得してもよい。測定を行う検出器としては、例えば、UV検出器、蛍光検出器、示唆屈折率検出器、電気伝導度検出器又は電気化学検出器などが挙げられる。
質量分析法でのAβペプチドの測定は、用いるイオン化法及び質量分析計に合わせて公知の技術から適切に設定できる。このうち、トリプル四重極型質量分析計を用いる場合、Aβペプチドが、測定モードをポジティブイオン測定モードにした多重反応モニタリング(MRM)測定によって測定されることが好ましい。
トリプル四重極型質量分析計はコリジョンセル(Q2)を挟んでその前後に第１の四重極(Q1)及び第３の四重極(Q3)を備えている。測定対象物は、イオン源でイオン化されてプレカーサイオンとなり、Q1にて設定された特定の質量電荷比(m/z)を有するイオンのみがフィルターを通過してQ2に導入される。Q2に導入された特定の質量電荷比を有するプレカーサイオンは、不活性ガスと衝突して開裂し、プロダクトイオンとなる。Q2からQ3に送られたプロダクトイオンは、Q3で再びフィルターにかけられ、特定の質量を有するイオンのみがフィルターを通過してQ3から検出器へと送られ、シグナルが検出される。これにより、特定のプレカーサイオンに対する特定のプロダクトイオンが検出器で検出される。ここで、Q1にて設定される特定の質量電荷比と、Q3にて設定される特定の質量電荷比との組み合わせをMRMトランジションと呼ぶ。MRM測定では、このMRMトランジションを複数設定することで、同時に複数のプロダクトイオンを検出できる。これにより、測定対象物中に含まれる複数の物質を同時に測定できる。例えば、Aβ40及びAβ42を含む試料に対して、それぞれのMRMトランンジションを設定することで２種のAβペプチドを同時に測定しそれぞれの測定値を取得できる。
MRM測定において、測定モードは特に限定されないが、質量分析計をポジティブイオン測定モードで用いることが好ましい。また、MRM測定におけるコーン電圧及びコリジョンエネルギーも特に限定されず、当業者によって適宜適切な条件に設定できる。
Aβ40に対するMRMトランジションとしては、例えばプレカーサイオン/プロダクトイオン=1083/1953.6とすることができ、Aβ42に対するMRMトランジシションとしては、プレカーサイオン／プロダクトイオン=1129/1078.5とすることができる。このようにMRMトランジションを設定することで、Aβペプチドを高感度に検出できる。
上記の測定方法では、血液試料と、標識された内部標準物質とを混合し、内部標準物質の測定値に基づいてAβペプチドの測定値を取得してもよい。内部標準物質としては、Aβペプチドの定量が可能な物質であれば特に限定されないが、安定同位体で標識されたAβペプチドであることが好ましい。安定同位体で標識されたAβペプチドとしては、例えば、N15安定同位体で標識したAβ40及びAβ42が挙げられる。内部標準物質の添加量は、測定装置が測定可能な濃度であれば特に限定されず、測定装置の分析能力に合わせて適宜設定できる。
Aβペプチドを検出するためのMRMトランジションとともに、内部標準として安定同位体で標識したAβペプチドに対してもMRMトランジションを設定して測定し、測定値を取得できる。N15安定同位体で標識したAβ40に対するMRMトランジシションとしては、プレカーサイオン／プロダクトイオン=1096/1066.5とすることができ、N15安定同位体で標識したAβ42に対するMRMトランジシションとしてはプレカーサイオン／プロダクトイオン=1142.5/1091.5とすることができる。
本実施形態の抗体セットを用いて全自動免疫測定装置により血液試料中のAβペプチドを測定する場合、当該血液試料を上記の測定方法で測定した場合と同程度の定量性で、Aβペプチドを測定できる。具体的には、本実施形態の抗体セットの捕捉抗体及び検出抗体を用いる全自動免疫測定装置による測定で得られるAβペプチドの測定値Ｘと、質量分析法による測定で得られるAβペプチドの測定値Ｙとを直線回帰分析した場合に算出される相関係数ｒが0.8以上、好ましくは0.85以上、より好ましくは0.9以上である。相関係数ｒを算出する手順について、以下に説明する。
全自動免疫測定装置による測定は、捕捉抗体と、アルカリホスファターゼ(ALP)で標識された検出抗体とを用いて血液試料中のAβペプチドを測定することを含む。一般に、全自動免疫測定装置による測定では、捕捉抗体を含む試薬と、固相としての磁性粒子を含む試薬と、ALP標識検出抗体を含む試薬と、ALP基質溶液を含む試薬とを用いる。好ましい実施形態では、捕捉抗体は、あらかじめビオチン類で標識され、磁性粒子には、あらかじめアビジン類が固定されている。あるいは、磁性粒子に固定された捕捉抗体を含む試薬と、ALP標識検出抗体を含む試薬と、ALP基質溶液を含む試薬とを用いる。好ましい実施形態では、血液試料を希釈する緩衝液を含む試薬と、ALPと基質との反応を促進するための緩衝液(以下、測定用緩衝液とも呼ぶ)を含む試薬とをさらに用いてもよい。血液試料を希釈する緩衝液は、上記の本実施形態の測定方法について述べたことと同様である。測定用緩衝液は、ALPの酵素反応に必要な金属イオンを含み、且つ当該反応に適したpH及び塩濃度を有する緩衝液であり、例えばR4試薬(シスメックス株式会社)などが挙げられる。これらの試薬を全自動免疫測定装置に備え、Aβペプチドを含む血液試料をセットして測定を開始すると、上述のサンドイッチELISA法による血液試料中のAβペプチドの測定が行われる。血液試料は、１つであってもよいし、複数であってもよい。
質量分析法による測定では、全自動免疫測定装置による測定と同じ血液試料を測定する。質量分析法による測定は、血液試料中のAβペプチドを抗Aβモノクローナル抗体である6E10抗体により免疫沈降すること、免疫沈降されたAβペプチドと抗体との複合体からAβペプチドを、有機溶媒を含む塩基性溶液によって遊離すること、遊離したAβペプチドを含む溶液を液体クロマトグラフィーで分離すること、及び、分離されたAβペプチドをイオン化してトリプル四重極質量分析計により測定することを含む。この質量分析法による測定の詳細は、本実施形態の測定方法について述べたことと同様である。
好ましい実施形態では、HISCL(登録商標)-5000(シスメックス株式会社)を用いて測定値Ｘを取得し、質量分析法として、所定の遊離試薬を用いる処理、所定のカラムを用いるLC分離及び所定の質量分析計を用いる測定により測定値Ｙを取得する。すなわち、本実施形態の抗体セットの捕捉抗体及び検出抗体を用いるHISCL(登録商標)-5000による測定で得られるAβペプチドの測定値Ｘと、質量分析法による測定で得られるAβペプチドの測定値Ｙとを直線回帰分析した場合に算出される相関係数ｒが0.8以上、好ましくは0.85以上、より好ましくは0.9以上である。ここで、HISCL(登録商標)-5000による測定は、捕捉抗体とアルカリホスファターゼで標識された検出抗体とを用いて、血液試料中のAβペプチドを測定することを含む。具体的には、次のとおりである。HISCL(登録商標)-5000による測定では、ビオチン標識捕捉抗体を含むR1試薬と、ストレプトアビジン固定化磁性粒子を含むR2試薬と、ALP標識検出抗体を含むR3試薬と、測定用緩衝液を含むR4試薬と、ALP基質溶液を含むR5試薬とを用いる。これらの試薬をHISCL(登録商標)-5000に備え、Aβペプチドを含む血液試料をセットして測定を開始すると、まず、血液試料とR1試薬とが混合されて、Aβペプチドとビオチン標識捕捉抗体との複合体が形成される。ここに、R2試薬が添加されて、ビオチンとストレプトアビジンとの結合を介して、該複合体が磁性粒子上に形成される。ここで、磁性粒子を集磁して液体を除き、HISCL(登録商標)洗浄液で磁性粒子を洗浄する(B/F分離)。磁性粒子にR3試薬を添加して、Aβペプチドとビオチン標識捕捉抗体とALP標識検出抗体との複合体を磁性粒子上に形成する。ここで、上記と同様にしてB/F分離を行い、磁性粒子にR4試薬及びR5試薬を添加して、化学発光強度を測定し、測定値Ｘを取得する。
質量分析法による測定では、全自動免疫測定装置による測定と同じ血液試料を測定する。好ましい実施形態において、質量分析法による測定は、血液試料中のAβペプチドを抗Aβモノクローナル抗体である6E10抗体により免疫沈降すること、免疫沈降されたAβペプチドと抗体との複合体から前記Aβペプチドを、0.56%アンモニア及び40%アセトニトリルを含む溶液によって遊離すること、遊離したAβペプチドを含む溶液をACQUITY(登録商標) UPLC(登録商標) ペプチド BEH C18 カラムを用いるACQUITY(登録商標) UPLC(登録商標) H-クラス バイオ システムによる液体クロマトグラフィーで分離すること、及び分離されたAβペプチドを、エレクトロスプレーイオン化法を用いるXevo(登録商標) TQ-XSトリプル四重極型質量分析計を用いて測定することを含む。ここで、質量分析計による測定は、多重反応モニタリング(MRM)測定である。このMRM測定において、質量分析計をポジティブイオン測定モードで用い、MRMトランジションが、Aβ40ペプチドに対してプレカーサイオン/プロダクトイオン=1083.4/1054、及びAβ42ペプチドに対してプレカーサイオン/プロダクトイオン=1129.5/1078.8である。このような質量分析法により血液試料を測定して、測定値Ｙを取得する。
全自動免疫測定装置による測定値Ｘ及び質量分析法による測定値Ｙはいずれも、シグナル強度であってもよいし、検量線などから取得したAβペプチドの量又は濃度の値であってもよい。相関係数ｒの算出では、Ｘ軸に全自動免疫測定装置による測定値Ｘをとり、Ｙ軸に質量分析法による測定値ＹをとったＸＹ平面に、各測定法により血液試料から取得したAβペプチドの測定値をプロットして、回帰直線を取得してもよい。相関係数ｒは、公知の直線回帰分析で算出できる。直線回帰分析としては、例えば最小二乗法が挙げられる。本実施形態では、相関係数ｒは0.85以上となることが好ましく、0.9以上となることがより好ましい。相関係数の算出自体は、例えばExcel(登録商標)(マイクロソフト社)などのソフトウェアにより行うことができる。
さらなる実施形態は、Aβペプチドに特異的に結合する捕捉抗体及び検出抗体を含む抗体セットを用いるイムノアッセイにより、Aβペプチドをインビトロで測定する方法である。このイムノアッセイは、Aβペプチドに特異的に結合する捕捉抗体として、AβペプチドのＮ末端残基を含むエピトープに結合する抗体を用い、Aβペプチドに特異的に結合する検出抗体として、捕捉抗体が結合するエピトープとは異なるエピトープに結合する抗体を用いることを特徴とする。本実施形態において、Aβペプチドは、Aβ40及びAβ42の少なくとも１つである。本実施形態では、上記の抗体セットを用いることが好ましい。
イムノアッセイは、上記の捕捉抗体及び検出抗体を用いることにより、質量分析を用いる本実施形態のAβペプチドの測定方法と同程度の定量性で、Aβペプチドを測定できる。具体的には、イムノアッセイに用いられる抗体セットは、捕捉抗体及び検出抗体を用いる全自動免疫測定装置による測定で得られるAβペプチドの測定値Ｘと、質量分析法による測定で得られるAβペプチドの測定値Ｙとを直線回帰分析した場合、0.8以上の相関係数ｒが算出される抗体セットである。より好ましい実施形態では、イムノアッセイに用いられる抗体セットは、0.85以上の相関係数ｒとなる抗体セットであり、さらに好ましい実施形態は、0.9以上の相関係数ｒとなる抗体セットである。全自動免疫測定装置及び質量分析法による測定の詳細は、本実施形態の抗体セットについて述べたことと同様である。
さらなる実施形態では、イムノアッセイに用いられる抗体セットは、捕捉抗体及び検出抗体を用いるHISCL(登録商標)-5000による測定で得られるAβペプチドの測定値Ｘと、所定の遊離試薬を用いる処理、所定のカラムを用いるLC分離及び所定の質量分析計を用いる質量分析法による測定で得られるAβペプチドの測定値Ｙとを直線回帰分析した場合、0.8以上の相関係数ｒが算出される抗体セットであることが好ましい。より好ましい実施形態では、イムノアッセイに用いられる抗体セットは、0.85以上の相関係数ｒとなる抗体セットであり、さらに好ましい実施形態は、0.9以上の相関係数ｒとなる抗体セットである。HISCL(登録商標)-5000及び質量分析法による測定の詳細は、本実施形態の抗体セットについて述べたことと同様である。
さらなる実施形態は、Aβペプチドを測定するための試薬キットである。すなわち、上記の本実施形態の抗体セットの捕捉抗体と検出抗体とを含む、Aβペプチドを測定するための試薬キット(以下、「試薬キット」ともいう)が提供される。捕捉抗体及び検出抗体については、上述の通りである。本実施形態の試薬キットは、１つ以上の試薬を含む。
本実施形態の試薬キットは、Aβペプチドと捕捉抗体が結合した複合体からAβペプチドを遊離するための有機溶媒を含む塩基性溶液を含んでいてもよい。有機溶媒を含む塩基性溶液については、上述のとおりである。
検出抗体は、標識物質で標識されていてもよい。標識物質は特に限定されないが、酵素であることが好ましい。あるいは、試薬キットは、検出抗体を標識するための標識物質をさらに含んでいてもよい。また、標識物質が酵素である場合、試薬キットは、酵素に対する基質をさらに含んでいてもよい。標識物質及び基質については、上述の通りである。捕捉抗体、検出抗体、標識物質及び基質の形態は特に限定されず、固体(例えば粉末、結晶、凍結乾燥品など)であってもよいし、液体(例えば溶液、懸濁液、乳濁液など)であってもよい。
本実施形態では、各試薬を収容した容器を箱に梱包して、ユーザに提供してもよい。箱には、添付文書を同梱していてもよい。添付文書には、試薬キットの構成、使用方法、当該試薬キットにより得られた全自動免疫測定装置の測定結果と質量分析計による測定結果との関係などについて記載されていてもよい。そのような試薬キットの例を以下にいくつかの図で示す。本実施形態はこれらの例に限定されない。
本実施形態の試薬キットの一例を、図１Ａに示す。図１Ａにおいて、１０は、試薬キットを示し、１１は、Aβペプチドの捕捉抗体を含む試薬を収容した第１容器を示し、１２は、Aβペプチドの検出抗体を含む試薬を収容した第２容器を示し、１３は、梱包箱を示し、１４は、添付文書を示す。この例において、試薬キットは、捕捉抗体を固定化するための固相をさらに含んでもよい。固相については、上述のとおりである。
さらなる実施形態の試薬キットの一例を、図１Ｂに示す。図１Ｂにおいて、２０は、試薬キットを示し、２１は、Aβペプチドの捕捉抗体を含む試薬を収容した第１容器を示し、２２は、Aβ40の検出抗体を含む試薬を収容した第２容器を示し、２３は、Aβ42の検出抗体を含む試薬を収容した第３容器を示し、２４は、梱包箱を示し、２５は、添付文書を示す。この例において、試薬キットは、捕捉抗体を固定化するための固相をさらに含んでもよい。固相の詳細は、固相については、上述のとおりである。
さらなる実施形態の試薬キットの一例を、図１Ｃに示す。図１Ｃにおいて、３０は、試薬キットを示し、３１は、Aβ40ペプチドの捕捉抗体を含む試薬を収容した第１容器を示し、３２は、Aβ40の検出抗体を含む試薬を収容した第２容器を示し、３３は、Aβ42の検出抗体を含む試薬を収容した第３容器を示し、３４は、有機溶媒を含む塩基性溶液を含む試薬を収容した第４容器を示し、３５は、梱包箱を示し、３６は、添付文書を示す。この例において、試薬キットは、捕捉抗体を固定化するための固相をさらに含んでもよい。固相については、上述のとおりである。
さらなる実施形態の試薬キットの一例を、図１Ｄに示す。図１Ｄにおいて、４０は、試薬キットを示し、４１は、Aβペプチドの捕捉抗体を含む試薬を収容した第１容器を示し、４２は、Aβ40の、酵素で標識された検出抗体を含む試薬を収容した第２容器を示し、４３は、Aβ42の、酵素で標識された検出抗体を含む試薬を収容した第３容器を示し、４４は、磁性粒子を含む試薬を収容した第４容器を示し、４５は、洗浄用試薬を収容した第５容器を示し、４６は、酵素の基質を収容した第６試薬を示し、４７は、梱包箱を示し、４８は、添付文書を示す。
本実施形態の試薬キットは、Aβペプチドのキャリブレータを含んでもよい。キャリブレータの一例としては、Aβ40定量用キャリブレータ及びAβ42定量用キャリブレータが挙げられる。Aβ40定量用キャリブレータは、例えば、Aβ40を含まない緩衝液(ネガティブコントロール)と、Aβ40を既知濃度で含む緩衝液とを備えていてもよい。別のキャリブレータの例は、Aβ40及びAβ42のいずれも含まない緩衝液(ネガティブコントロール)と、Aβ40を既知濃度で含む緩衝液と、Aβ42を既知濃度で含む緩衝液とを備える。別のキャリブレータの例は、Aβ40及びAβ42のいずれも含まない緩衝液(ネガティブコントロール)と、Aβ40及びAβ42をそれぞれ既知濃度で含む緩衝液とを備える。
以下、実施例によって本発明を更に具体的に説明する。
実施例１：有機溶媒を含む塩基性溶液を用いる免疫沈降と、質量分析法とを組み合わせて用いる血漿Aβペプチドの測定
有機溶媒を含む塩基性溶液を用いて、Aβペプチドと、Aβペプチドに特異的に結合する抗体との複合体からAβペプチドを遊離し、質量分析法を用いてAβペプチドを測定した。
有機溶媒を含む塩基性溶液を用いて、Aβペプチドと、Aβペプチドに特異的に結合する抗体との複合体からAβペプチドを遊離し、質量分析法を用いてAβペプチドを測定した。
(１) 免疫沈降を用いるAβペプチドの捕捉・遊離
(1.1) 血液試料
Aβペプチドを含む血液試料として、ロットの異なる５種の市販の血漿試料(ProMedeX社)を用いた。
(1.1) 血液試料
Aβペプチドを含む血液試料として、ロットの異なる５種の市販の血漿試料(ProMedeX社)を用いた。
(1.2) Aβペプチドに特異的に結合する抗体
Aβペプチドに特異的に結合する抗体としては、市販のマウスモノクローナル抗Aβ抗体である6E10抗体(BioLegend社)を用いた。6E10抗体を、慣用の手法により、磁性粒子(M-270 Epoxy-activated Dynabeads : Thermo Fisher Scientific社)に固定化した。
Aβペプチドに特異的に結合する抗体としては、市販のマウスモノクローナル抗Aβ抗体である6E10抗体(BioLegend社)を用いた。6E10抗体を、慣用の手法により、磁性粒子(M-270 Epoxy-activated Dynabeads : Thermo Fisher Scientific社)に固定化した。
(1.3) Aβペプチド
検量線の作成のため、Aβ40ペプチド及びAβ42ペプチドをAnaSpec社より購入した。内部標準物質として、安定同位体15Nで標識したAβ40ペプチド及びAβ42ペプチドである15N-Aβ40及び15N-Aβ42(rPeptide社)を用いた。Aβ40ペプチドについては、3%BSAを含むPBS溶液中に、それぞれ終濃度が10.8 pg/ml、21.7 pg/ml、43.3pg/ml、86.6 pg/ml、173.2 pg/ml、346.4 pg/ml及び692.8 pg/mlになるように懸濁した。Aβ42ペプチドについては、3%BSAを含むPBS溶液中に、それぞれ終濃度が2.8 pg/ml、5.6 pg/ml、11.3 pg/ml、22.6 pg/ml、45.2 pg/ml、90.3 pg/ml及び180.6 pg/mLになるように懸濁した。15N-Aβ40及び15N-Aβ42については、3%BSAを含むPBS溶液中に、それぞれ500 pg/mlになるように同一溶液中に懸濁した。
検量線の作成のため、Aβ40ペプチド及びAβ42ペプチドをAnaSpec社より購入した。内部標準物質として、安定同位体15Nで標識したAβ40ペプチド及びAβ42ペプチドである15N-Aβ40及び15N-Aβ42(rPeptide社)を用いた。Aβ40ペプチドについては、3%BSAを含むPBS溶液中に、それぞれ終濃度が10.8 pg/ml、21.7 pg/ml、43.3pg/ml、86.6 pg/ml、173.2 pg/ml、346.4 pg/ml及び692.8 pg/mlになるように懸濁した。Aβ42ペプチドについては、3%BSAを含むPBS溶液中に、それぞれ終濃度が2.8 pg/ml、5.6 pg/ml、11.3 pg/ml、22.6 pg/ml、45.2 pg/ml、90.3 pg/ml及び180.6 pg/mLになるように懸濁した。15N-Aβ40及び15N-Aβ42については、3%BSAを含むPBS溶液中に、それぞれ500 pg/mlになるように同一溶液中に懸濁した。
(1.4) 有機溶媒を含む塩基性溶液の調製
有機溶媒を含む塩基性溶液(遊離試薬)として、純水12.8mlに28%濃アンモニア水(ナカライテスク社)1.2mlと、アセトニトリル(関東化学社)6.0mlを加えて混合し、1.68%アンモニア/30%アセトニトリル溶液を調製した。
有機溶媒を含む塩基性溶液(遊離試薬)として、純水12.8mlに28%濃アンモニア水(ナカライテスク社)1.2mlと、アセトニトリル(関東化学社)6.0mlを加えて混合し、1.68%アンモニア/30%アセトニトリル溶液を調製した。
(1.5) 免疫沈降
1.5 mlのサンプルチューブ(Eppendorf社)に250μlの血漿試料又は上記(1.3)で調製した各Aβ40ペプチド溶液若しくはAβ42ペプチド溶液を加えた。上記溶液を含む各サンプルチューブに、上記(1.3)で調製した15N-Aβ40及び15N-Aβ42を含む溶液250μlを加え、室温にて30分静置した。静置後、各試料溶液に上記(1.2)で調製した6E10抗体を固定化した磁性粒子(4μg抗体/0.4mg磁性粒子)懸濁液40μlを加え、室温でローテーターを用い１時間転倒混和し、Aβペプチドと抗体との複合体を形成した。これらの溶液を、磁気スタンドを用いて集磁して上清を除いた。
1.5 mlのサンプルチューブ(Eppendorf社)に250μlの血漿試料又は上記(1.3)で調製した各Aβ40ペプチド溶液若しくはAβ42ペプチド溶液を加えた。上記溶液を含む各サンプルチューブに、上記(1.3)で調製した15N-Aβ40及び15N-Aβ42を含む溶液250μlを加え、室温にて30分静置した。静置後、各試料溶液に上記(1.2)で調製した6E10抗体を固定化した磁性粒子(4μg抗体/0.4mg磁性粒子)懸濁液40μlを加え、室温でローテーターを用い１時間転倒混和し、Aβペプチドと抗体との複合体を形成した。これらの溶液を、磁気スタンドを用いて集磁して上清を除いた。
(1.6) 洗浄工程
上清を除いた後、サンプルチューブに残った磁性粒子に、１mLの3% BSAを含むPBS溶液を加え混和後、再び集磁して上清を除いた。この操作を、１mLの3% BSAを含むPBS溶液で２回、１ mLの50 mM 酢酸アンモニウム溶液で２回、１mLの超純水で1回続けて行い、磁性粒子を洗浄した。
上清を除いた後、サンプルチューブに残った磁性粒子に、１mLの3% BSAを含むPBS溶液を加え混和後、再び集磁して上清を除いた。この操作を、１mLの3% BSAを含むPBS溶液で２回、１ mLの50 mM 酢酸アンモニウム溶液で２回、１mLの超純水で1回続けて行い、磁性粒子を洗浄した。
(1.7) 複合体からのAβペプチドの遊離
上記(1.6)での磁性粒子の洗浄後、洗浄液を除去して残った磁性粒子に、上記(1.4)で調製した遊離試薬25μL添加して混合し、１分間静置した。磁性粒子を再び集磁し、上清を溶出液として回収した。
上記(1.6)での磁性粒子の洗浄後、洗浄液を除去して残った磁性粒子に、上記(1.4)で調製した遊離試薬25μL添加して混合し、１分間静置した。磁性粒子を再び集磁し、上清を溶出液として回収した。
(２) 質量分析法
上記(1.7)で調製した溶出液をLC-MS/MSに供してMRM測定を行い、Aβペプチドを測定した。LC-MS/MSの液体クロマトグラフィー部分にはACQUITY(登録商標) UPLC(登録商標) H-クラス バイオ システム(Waters社：以下UPLCとも呼称する)を用いた。カラムとしては、逆相カラムであるACQUITY(登録商標) UPLC(登録商標)ペプチド BEH C18 カラム(Waters社)を用いた。質量分析計としては、Xevo(登録商標) TQ-XSトリプル四重極型質量分析計(Waters社：以下TQ-XS質量分析計とも呼称する)を用いた。
上記(1.7)で調製した溶出液をLC-MS/MSに供してMRM測定を行い、Aβペプチドを測定した。LC-MS/MSの液体クロマトグラフィー部分にはACQUITY(登録商標) UPLC(登録商標) H-クラス バイオ システム(Waters社：以下UPLCとも呼称する)を用いた。カラムとしては、逆相カラムであるACQUITY(登録商標) UPLC(登録商標)ペプチド BEH C18 カラム(Waters社)を用いた。質量分析計としては、Xevo(登録商標) TQ-XSトリプル四重極型質量分析計(Waters社：以下TQ-XS質量分析計とも呼称する)を用いた。
各溶出液をUPLCのオートサンプラーに置き、溶出液10μlをUPLCに導入しグラジエントにかけ分画した。グラジエントの条件は以下のように行った。
グラジエントに供されてカラムから溶出した溶離液はそのままUPLCに接続されたTQ-XS質量分析計に供された。TQ-XS質量分析計は、エレクトロスプレーイオン化法を用い、ポジティブイオンモードで測定した。MRM測定の条件は以下の表２のように設定した。
(３) 測定結果
LC-MS/MSを用いた測定結果を図２、図３Ａ及び図３Ｂに示した。図２にはAβ40ペプチド、Aβ42ペプチド、15N-Aβ40及び15N-Aβ42に対するMRM測定の結果を、図３Ａ及び図３Ｂには測定した血漿検体中のAβ40ペプチド及びAβ42ペプチド濃度を示す。これらの結果より、有機溶媒を含む塩基性溶液を用いて、複合体からAβペプチドを遊離させ、質量分析法を用いてAβペプチドを測定できることが示された。
LC-MS/MSを用いた測定結果を図２、図３Ａ及び図３Ｂに示した。図２にはAβ40ペプチド、Aβ42ペプチド、15N-Aβ40及び15N-Aβ42に対するMRM測定の結果を、図３Ａ及び図３Ｂには測定した血漿検体中のAβ40ペプチド及びAβ42ペプチド濃度を示す。これらの結果より、有機溶媒を含む塩基性溶液を用いて、複合体からAβペプチドを遊離させ、質量分析法を用いてAβペプチドを測定できることが示された。
図４Ａ及び図４Ｂに、上記(1.3)で調製した濃度既知のAβペプチドを用いて検出された測定値を基にして検量線を作成した結果を記載する。図４Ａ及び図４Ｂのように、Aβ40ペプチド及びAβ42ペプチドのいずれにおいても、R2が0.999以上となる検量線を作成することができた。また、100 pg/ml以下の低濃度のAβペプチドも検出可能であった。このことから、有機溶媒を含む塩基性溶液と、質量分析法とを組み合わせた上記測定方法が、高感度にAβペプチドを測定可能であり、また、優れた定量性を有していることが示された。
実施例２：溶出効率の比較
遊離試薬の組成を変更し、遊離試薬の組成の違いによる複合体からのAβペプチドの溶出効率を、以下の計算式に基づいて算出して比較した。
遊離試薬の組成を変更し、遊離試薬の組成の違いによる複合体からのAβペプチドの溶出効率を、以下の計算式に基づいて算出して比較した。
[溶出効率(%)] = [試料CのAβペプチド濃度] / ([試料AのAβペプチド濃度] - [試料BのAβペプチド濃度]) × 100
(１) 遊離試薬中の塩基性物質についての比較
(1.1) 遊離試薬の調製
純水に、以下の表３の組成になるようにDDM(n-ドデシル-β-D-マルトシド、Sigma-Aldrich社)、アセトニトリル及び／又は28%濃アンモニア水を適宜選択して混合し、様々な遊離試薬を調製した。ここでは、塩基性物質又は有機溶媒を含まない溶液も便宜上、遊離試薬と呼称した。調製後、塩基性物質を含む溶液のpHを、pHメーター(株式会社堀場製作所)を用いて測定した。
(1.1) 遊離試薬の調製
純水に、以下の表３の組成になるようにDDM(n-ドデシル-β-D-マルトシド、Sigma-Aldrich社)、アセトニトリル及び／又は28%濃アンモニア水を適宜選択して混合し、様々な遊離試薬を調製した。ここでは、塩基性物質又は有機溶媒を含まない溶液も便宜上、遊離試薬と呼称した。調製後、塩基性物質を含む溶液のpHを、pHメーター(株式会社堀場製作所)を用いて測定した。
(1.2) 試料調製
実施例１の(1.3)で用いたAβ40ペプチドを、1000 pg/mlになるように3%BSAを含むPBS溶液中に懸濁して、試料Aを調製した。試料AのAβペプチド濃度は、Aβ40ペプチドの初濃度に該当する。
実施例１の(1.3)で用いたAβ40ペプチドを、1000 pg/mlになるように3%BSAを含むPBS溶液中に懸濁して、試料Aを調製した。試料AのAβペプチド濃度は、Aβ40ペプチドの初濃度に該当する。
(1.3) 免疫沈降
上記(1.2)で調製した試料Aに対して、実施例１の(1.5)と同様に免疫沈降を行い、磁性粒子を回収した。この際、集磁後の上清を回収し、試料Bとして保存した。試料BのAβペプチド濃度は、Aβペプチドに特異的に結合する抗体で捕捉しきれなかったAβペプチドの濃度に該当する。
上記(1.2)で調製した試料Aに対して、実施例１の(1.5)と同様に免疫沈降を行い、磁性粒子を回収した。この際、集磁後の上清を回収し、試料Bとして保存した。試料BのAβペプチド濃度は、Aβペプチドに特異的に結合する抗体で捕捉しきれなかったAβペプチドの濃度に該当する。
(1.4) 洗浄・溶出
上記(1.3) で回収した磁性粒子に対して、実施例１の(1.6)と同様に洗浄操作を行い、洗浄液を除去した。洗浄後の磁性粒子に対して、上記(1.1)で調製した各遊離試薬15μlを添加し、1分間静置し、Aβペプチドを遊離させた。静置後、磁性粒子を集磁し、上清を回収した。回収した上清に300mM Tris、300mM NaClを含むpH中和液(pH 7.4)を混合して、試料Cを得た。試料CのAβペプチド濃度は、免疫沈降によって捕捉後遊離したAβペプチドの濃度に該当する。
上記(1.3) で回収した磁性粒子に対して、実施例１の(1.6)と同様に洗浄操作を行い、洗浄液を除去した。洗浄後の磁性粒子に対して、上記(1.1)で調製した各遊離試薬15μlを添加し、1分間静置し、Aβペプチドを遊離させた。静置後、磁性粒子を集磁し、上清を回収した。回収した上清に300mM Tris、300mM NaClを含むpH中和液(pH 7.4)を混合して、試料Cを得た。試料CのAβペプチド濃度は、免疫沈降によって捕捉後遊離したAβペプチドの濃度に該当する。
(２) イムノアッセイによる測定
上記の試料A、B及びCについて、全自動免疫測定装置HISCL（登録商標）-5000(シスメックス株式会社)を用いるイムノアッセイにより各試料中のAβペプチド濃度を測定した。R1試薬(捕捉用抗体試薬)は、82E1抗体を、慣用の手法によりビオチンで標識して、pH7.5の1%BSA、0.1M Tris-HCl、0.15M NaCl、0.1% NaN3を含むバッファーに溶解して調製した。R2試薬(固相)として、ストレプトアビジン結合磁性粒子を含むHISCL（登録商標） R2試薬(シスメックス株式会社)を用いた。R3試薬(検出用抗体試薬)は、1A10抗体を慣用の手法によりアルカリホスファターゼ(ALP)で標識して、pH7.5の1%BSA、0.1M Tris-HCl、0.15M NaCl、0.1% NaN3を含むバッファーに溶解して調製した。R4試薬(測定用緩衝液)として、HISCL（登録商標） R4試薬(シスメックス株式会社)を用いた。R5試薬(ALP基質溶液)として、HISCL（登録商標） R5試薬(シスメックス株式会社)を用いた。
上記の試料A、B及びCについて、全自動免疫測定装置HISCL（登録商標）-5000(シスメックス株式会社)を用いるイムノアッセイにより各試料中のAβペプチド濃度を測定した。R1試薬(捕捉用抗体試薬)は、82E1抗体を、慣用の手法によりビオチンで標識して、pH7.5の1%BSA、0.1M Tris-HCl、0.15M NaCl、0.1% NaN3を含むバッファーに溶解して調製した。R2試薬(固相)として、ストレプトアビジン結合磁性粒子を含むHISCL（登録商標） R2試薬(シスメックス株式会社)を用いた。R3試薬(検出用抗体試薬)は、1A10抗体を慣用の手法によりアルカリホスファターゼ(ALP)で標識して、pH7.5の1%BSA、0.1M Tris-HCl、0.15M NaCl、0.1% NaN3を含むバッファーに溶解して調製した。R4試薬(測定用緩衝液)として、HISCL（登録商標） R4試薬(シスメックス株式会社)を用いた。R5試薬(ALP基質溶液)として、HISCL（登録商標） R5試薬(シスメックス株式会社)を用いた。
HISCL（登録商標）-5000による測定手順は、次のとおりであった。試料A、B又はC(30μL)と、R1試薬(110μL)とを混合し、4分間42℃で反応させた。反応後、R2試薬(30μL)を添加し、3分間42℃で反応させた。得られた混合液中の磁性粒子を集磁して上清を除き、HISCL（登録商標）洗浄液(300μL)を加えて磁性粒子を洗浄した。上清を除き、磁性粒子にR3試薬(100μL)を添加して混合し、5分間42℃で反応させた。得られた混合液中の磁性粒子を集磁して上清を除き、HISCL（登録商標）洗浄液(300μL)を再び加えて磁性粒子を洗浄した。上清を除き、磁性粒子にR4試薬(50μL)及びR5試薬(100μL)を添加して、化学発光強度を測定した。キャリブレータ(検量線作成用抗原)として、Aβ40ペプチドを、それぞれ0 pg/ml、8.6 pg/ml、33.3 pg/ml、99.2pg/ml、319.1 pg/ml及び1188.1 pg/mlになるように0.1% BSA、0.14M トリエタノールアミン、0.15M NaCl、0.1% NaN3を含むpH7.0の溶液に懸濁して調製した各溶液を用い、同様に測定して検量線を作成した。測定で得られた化学発光強度を検量線に当てはめて、Aβ40ペプチドの濃度を決定した。
(３) 測定結果
表３の比較試薬１～３及び試薬１～９についての溶出効率の測定結果を図５に示した。図５に示されたように、有機溶媒のみ、又は塩基性溶液のみの遊離試薬では溶出効率が低く、Aβペプチドの遊離試薬として有機溶媒及び塩基性物質を含む遊離試薬を用いると、高い溶出効率が得られることが示された。特に、pHが11.4以上12.0以下の試薬は70%を越える高い溶出効率が得られることが示された。
表３の比較試薬１～３及び試薬１～９についての溶出効率の測定結果を図５に示した。図５に示されたように、有機溶媒のみ、又は塩基性溶液のみの遊離試薬では溶出効率が低く、Aβペプチドの遊離試薬として有機溶媒及び塩基性物質を含む遊離試薬を用いると、高い溶出効率が得られることが示された。特に、pHが11.4以上12.0以下の試薬は70%を越える高い溶出効率が得られることが示された。
(４) 遊離試薬の有機溶媒についての比較
上記(1.1)において、表３の遊離試薬の代わりに以下の表４の遊離試薬を用いて溶出効率を測定した。比較試薬5及び試料17～23では、試料としてAβ40ペプチドの代わりにAβ42ペプチドを用いた。Aβ42ペプチドを用いた際は、検出抗体として1A10抗体に代えてH31L21抗体を用い、キャリブレータとしては、Aβ42ペプチドをそれぞれ0 pg/ml、0.5 pg/ml、6.1 pg/ml、65.2 pg/ml及び804.5 pg/mlになるように0.1% BSA、0.14M トリエタノールアミン、0.15M NaCl、0.1% NaN3を含むpH7.0の溶液に懸濁して調製した各溶液を用いた。上記以外は(１)及び(２)と同様の操作を行い、各遊離試薬についての溶出効率を測定した。
上記(1.1)において、表３の遊離試薬の代わりに以下の表４の遊離試薬を用いて溶出効率を測定した。比較試薬5及び試料17～23では、試料としてAβ40ペプチドの代わりにAβ42ペプチドを用いた。Aβ42ペプチドを用いた際は、検出抗体として1A10抗体に代えてH31L21抗体を用い、キャリブレータとしては、Aβ42ペプチドをそれぞれ0 pg/ml、0.5 pg/ml、6.1 pg/ml、65.2 pg/ml及び804.5 pg/mlになるように0.1% BSA、0.14M トリエタノールアミン、0.15M NaCl、0.1% NaN3を含むpH7.0の溶液に懸濁して調製した各溶液を用いた。上記以外は(１)及び(２)と同様の操作を行い、各遊離試薬についての溶出効率を測定した。
比較試薬4及び試料10～16についての測定結果を図６Ａに、比較試薬5及び試料17～23についての測定結果を図６Ｂに示した。図６Ａ及び図６Ｂより、有機溶媒を含まない比較試薬4及び5よりも、試料10～16及び17～23の方が優れた溶出効率を示すことが分かった。遊離試薬が塩基性物質及び有機溶媒を含むことによって、優れた溶出効率が得られることが示された。
実施例３：キャリーオーバー測定
従来、抗体で捕捉されたAβペプチドと抗体との複合体からAβペプチドを遊離する際には、酸性溶液が用いられる。ここでは、複合体を溶出させる遊離試薬の酸性・塩基性条件による、液体クロマトグラフィー装置へのAβペプチドのキャリーオーバーについて測定した。
従来、抗体で捕捉されたAβペプチドと抗体との複合体からAβペプチドを遊離する際には、酸性溶液が用いられる。ここでは、複合体を溶出させる遊離試薬の酸性・塩基性条件による、液体クロマトグラフィー装置へのAβペプチドのキャリーオーバーについて測定した。
(１) 試料調製
酸性の遊離試薬として、純水にギ酸(富士フイルム和光純薬株式会社)及びアセトニトリルを混合し、0.1%ギ酸、50%アセトニトリルの組成を有する酸性の遊離試薬を調製した(ここでは、酸性の溶液も便宜上、遊離試薬と呼称する)。また、実施例１の(1.4)と同様にして遊離試薬(1.68% アンモニア、50%アセトニトリル)を調製した。これらの遊離試薬に、実施例１の(1.3)と同じAβ40ペプチドを100 fmol/ulの終濃度となるように添加した(Aβ40ペプチド含有溶液)。また、酸性の遊離試薬、塩基性の遊離試薬それぞれに、Aβ40ペプチドを含まない溶液(Aβ40ペプチド未含有溶液)も用意した。
酸性の遊離試薬として、純水にギ酸(富士フイルム和光純薬株式会社)及びアセトニトリルを混合し、0.1%ギ酸、50%アセトニトリルの組成を有する酸性の遊離試薬を調製した(ここでは、酸性の溶液も便宜上、遊離試薬と呼称する)。また、実施例１の(1.4)と同様にして遊離試薬(1.68% アンモニア、50%アセトニトリル)を調製した。これらの遊離試薬に、実施例１の(1.3)と同じAβ40ペプチドを100 fmol/ulの終濃度となるように添加した(Aβ40ペプチド含有溶液)。また、酸性の遊離試薬、塩基性の遊離試薬それぞれに、Aβ40ペプチドを含まない溶液(Aβ40ペプチド未含有溶液)も用意した。
(２) 試料の液体クロマトグラフィーへの導入
上記(１)で調製した４種の溶液をLC-MS/MSに供した。LC-MS/MSの装置及び用いたカラムは実施例１の(２)の質量分析法に記載のものを用いた。各溶液を、UPLCのオートサンプラーに置き、各溶液10μlをUPLCに導入し分画した。UPLCの分析条件は以下の表５のように行った。質量分析法におけるMRM測定の条件は実施例１の表２のとおりである。
上記(１)で調製した４種の溶液をLC-MS/MSに供した。LC-MS/MSの装置及び用いたカラムは実施例１の(２)の質量分析法に記載のものを用いた。各溶液を、UPLCのオートサンプラーに置き、各溶液10μlをUPLCに導入し分画した。UPLCの分析条件は以下の表５のように行った。質量分析法におけるMRM測定の条件は実施例１の表２のとおりである。
UPLCに、上記(１)で調製した２種のAβ40ペプチド含有溶液及びそれらに対応するAβ40未含有溶液を、Aβ40ペプチド未含有溶液(バックグラウンド)、Aβ40ペプチド含有溶液、Aβ40ペプチド未含有溶液(キャリーオーバー測定)の順番で供し、その際に得られたシグナル強度を比較した結果を図７に示した。図７より、酸性の遊離試薬を用いた場合、塩基性の遊離試薬を用いた場合に比べ多量のキャリーオーバーが発生していることがわかった。一方、塩基性の遊離試薬をAβペプチドの遊離試薬とすれば、キャリーオーバーを顕著に抑えることができた。よって、質量分析法を用いるAβペプチドの連続した分析には、塩基性の遊離試薬を用いることが適切であることが示された。
参考例：遊離試薬の酸性・塩基性についての比較
上記実施例３のように、酸性の遊離試薬を用いて遊離したAβペプチドをLC-MS/MSで測定するとキャリーオーバーが発生した。この参考例では、複合体からのAβペプチドの遊離時に、塩基性の遊離試薬を用いる場合と、遊離時には酸性の遊離試薬を用いるが、その後塩基性の遊離試薬に置換してLC-MS/MSに供した場合とで検出されるAβペプチド量の違いについて比較した。
上記実施例３のように、酸性の遊離試薬を用いて遊離したAβペプチドをLC-MS/MSで測定するとキャリーオーバーが発生した。この参考例では、複合体からのAβペプチドの遊離時に、塩基性の遊離試薬を用いる場合と、遊離時には酸性の遊離試薬を用いるが、その後塩基性の遊離試薬に置換してLC-MS/MSに供した場合とで検出されるAβペプチド量の違いについて比較した。
(１) 試料調製
Aβペプチド試料としては、実施例１の(1.3)と同じAβ40ペプチド及びAβ42ペプチドを用い、３%BSA溶液中にAβ40ペプチドが50 pg/ml若しくは190 pg/mlになるように調製した溶液、又は３%BSA溶液中にAβ42ペプチドが26 pg/ml若しくは103 pg/mlになるように調製した溶液をそれぞれ準備して用いた。酸性の遊離試薬として、純水に、トリフルオロ酢酸(TFA、富士フイルム和光純薬株式会社)及びアセトニトリルを混合して、0.1%TFA、30%アセトニトリルの組成を有する酸性溶液を調製した。塩基性の遊離試薬として、実施例１の(1.4)と同様にして1.68% アンモニア、50%アセトニトリル溶液を調製した。
Aβペプチド試料としては、実施例１の(1.3)と同じAβ40ペプチド及びAβ42ペプチドを用い、３%BSA溶液中にAβ40ペプチドが50 pg/ml若しくは190 pg/mlになるように調製した溶液、又は３%BSA溶液中にAβ42ペプチドが26 pg/ml若しくは103 pg/mlになるように調製した溶液をそれぞれ準備して用いた。酸性の遊離試薬として、純水に、トリフルオロ酢酸(TFA、富士フイルム和光純薬株式会社)及びアセトニトリルを混合して、0.1%TFA、30%アセトニトリルの組成を有する酸性溶液を調製した。塩基性の遊離試薬として、実施例１の(1.4)と同様にして1.68% アンモニア、50%アセトニトリル溶液を調製した。
(２) 測定
(2.1) 免疫沈降
上記(１)で調製した各試料に対して、実施例１の(1.5)と同様にして内部標準を加え、6E10抗体を固定化した磁性粒子を加え、複合体を形成した。
(2.1) 免疫沈降
上記(１)で調製した各試料に対して、実施例１の(1.5)と同様にして内部標準を加え、6E10抗体を固定化した磁性粒子を加え、複合体を形成した。
(2.2) Aβペプチドの溶出
上記(2.1)で調製した各複合体に対して、実施例１の(1.6)と同様の洗浄工程を行った後、上記(１)で調製した25μLの酸性の遊離試薬又は塩基性の遊離試薬を添加して混合し、１分間静置した。磁性粒子を再び集磁し、上清を溶出液として回収した。
上記(2.1)で調製した各複合体に対して、実施例１の(1.6)と同様の洗浄工程を行った後、上記(１)で調製した25μLの酸性の遊離試薬又は塩基性の遊離試薬を添加して混合し、１分間静置した。磁性粒子を再び集磁し、上清を溶出液として回収した。
(2.3) 溶媒交換
上記(2.2)で回収した各溶出液のうち、酸性の遊離試薬を用いて得られた溶出液に対して、スピンドライヤースタンダード VC-96R(タイテック株式会社)を用いて、SpinDryerモードで、回転数：1500 r/min、温度：55℃の条件で1時間減圧乾燥を行い、溶媒を揮発させた。減圧乾燥後の残留物に対して、上記(１)で調製した25μLの塩基性の遊離試薬を添加して残留物を再懸濁した。
上記(2.2)で回収した各溶出液のうち、酸性の遊離試薬を用いて得られた溶出液に対して、スピンドライヤースタンダード VC-96R(タイテック株式会社)を用いて、SpinDryerモードで、回転数：1500 r/min、温度：55℃の条件で1時間減圧乾燥を行い、溶媒を揮発させた。減圧乾燥後の残留物に対して、上記(１)で調製した25μLの塩基性の遊離試薬を添加して残留物を再懸濁した。
(2.4) 質量分析法
上記(2.2)で回収した、各塩基性の遊離試薬を用いて得られた溶出液(溶液Ｘとする)及び上記(2.3)で再懸濁した溶液(溶液Ｙとする) を実施例１の(２)と同様にしてLC-MS/MSに供し、MRM測定を行った。
上記(2.2)で回収した、各塩基性の遊離試薬を用いて得られた溶出液(溶液Ｘとする)及び上記(2.3)で再懸濁した溶液(溶液Ｙとする) を実施例１の(２)と同様にしてLC-MS/MSに供し、MRM測定を行った。
(３) 測定結果
溶液A及び溶液Bの測定結果を図８Ａ～図９Ｄにそれぞれ示す。図８Ａが190 pg/mlのAβペプチド40を用いた溶液Ｘ、図８Ｂが190 pg/mlのAβ40ペプチドを用いた溶液Ｙ、図８Ｃが103 pg/mlのAβ42ペプチドを用いた溶液Ｘ、図８Ｄが103 pg/mlのAβ42ペプチドを用いた溶液Ｙ、図９Ａが50 pg/mlのAβ40ペプチドを用いた溶液Ｘ、図９Ｂが50 pg/mlのAβ40ペプチドを用いた溶液Ｙ、図９Ｃが26 pg/mlのAβ42ペプチドを用いた溶液Ｘ及び図９Ｄが26 pg/mlのAβ42を用いた溶液Ｙの測定結果を示す。これらの結果より、全ての濃度のAβペプチドの例において、溶液Ｙを用いる場合よりも、溶液Ｘを用いた場合の方が、面積値が大きかった。試料処理において、上記(2.3)のようなプロセスを用いると、Aβペプチドの損失が発生していることが示唆された。
溶液A及び溶液Bの測定結果を図８Ａ～図９Ｄにそれぞれ示す。図８Ａが190 pg/mlのAβペプチド40を用いた溶液Ｘ、図８Ｂが190 pg/mlのAβ40ペプチドを用いた溶液Ｙ、図８Ｃが103 pg/mlのAβ42ペプチドを用いた溶液Ｘ、図８Ｄが103 pg/mlのAβ42ペプチドを用いた溶液Ｙ、図９Ａが50 pg/mlのAβ40ペプチドを用いた溶液Ｘ、図９Ｂが50 pg/mlのAβ40ペプチドを用いた溶液Ｙ、図９Ｃが26 pg/mlのAβ42ペプチドを用いた溶液Ｘ及び図９Ｄが26 pg/mlのAβ42を用いた溶液Ｙの測定結果を示す。これらの結果より、全ての濃度のAβペプチドの例において、溶液Ｙを用いる場合よりも、溶液Ｘを用いた場合の方が、面積値が大きかった。試料処理において、上記(2.3)のようなプロセスを用いると、Aβペプチドの損失が発生していることが示唆された。
実施例４：イムノアッセイでの測定値と、質量分析法による測定値との比較
有機溶媒を含む塩基性溶液を遊離試薬として用いて、複合体からAβペプチドを遊離し、得られた溶出液に対して、イムノアッセイ又は質量分析法をそれぞれ行い、得られた測定値を比較した。
有機溶媒を含む塩基性溶液を遊離試薬として用いて、複合体からAβペプチドを遊離し、得られた溶出液に対して、イムノアッセイ又は質量分析法をそれぞれ行い、得られた測定値を比較した。
(１)試薬調製
(1.1) 血漿試料
健常者由来の血漿を18検体購入し用いた。
(1.1) 血漿試料
健常者由来の血漿を18検体購入し用いた。
(1.2)Aβペプチド
実施例１の(1.3)に記載のAβ40ペプチド及びAβ42ペプチドを用いた。
実施例１の(1.3)に記載のAβ40ペプチド及びAβ42ペプチドを用いた。
(1.3)ペプチドスパイク試料
上記(1.1)の血漿試料のうち、５検体を混合して混合試料を調製した。この混合試料を８つに分け、それぞれに上記(1.2)のAβ40ペプチド及びAβ42ペプチドを、添加後のAβ40ペプチド濃度が48.5 pg/mL、57.7 pg/mL、56.8 pg/mL、112.0 pg/mL、120.3 pg/mL、127.8 pg/mL、248.0 pg/mL、513.7 pg/mL増加する量、及び添加後のAβ42ペプチド濃度が5.7 pg/mL、6.6 pg/mL、7.5 pg/mL、13.4 pg/mL、13.7 pg/mL、14.7 pg/mL、29.3 pg/mL、54.2 pg/mL増加する量を添加し、ペプチドスパイク試料とした。
上記(1.1)の血漿試料のうち、５検体を混合して混合試料を調製した。この混合試料を８つに分け、それぞれに上記(1.2)のAβ40ペプチド及びAβ42ペプチドを、添加後のAβ40ペプチド濃度が48.5 pg/mL、57.7 pg/mL、56.8 pg/mL、112.0 pg/mL、120.3 pg/mL、127.8 pg/mL、248.0 pg/mL、513.7 pg/mL増加する量、及び添加後のAβ42ペプチド濃度が5.7 pg/mL、6.6 pg/mL、7.5 pg/mL、13.4 pg/mL、13.7 pg/mL、14.7 pg/mL、29.3 pg/mL、54.2 pg/mL増加する量を添加し、ペプチドスパイク試料とした。
(1.4) Aβペプチドに特異的に結合する抗体
実施例１の(1.2)に記載の6E10抗体を用いた。また、内部標準物質として、実施例１の(1.2)に記載の15N- Aβ40及び15N- Aβ42を用いた。15N- Aβ40及び15N- Aβ42は、３%BSAを含むPBS溶液中に、それぞれ500 pg/mlになるように同一溶液中に懸濁して調製した。
実施例１の(1.2)に記載の6E10抗体を用いた。また、内部標準物質として、実施例１の(1.2)に記載の15N- Aβ40及び15N- Aβ42を用いた。15N- Aβ40及び15N- Aβ42は、３%BSAを含むPBS溶液中に、それぞれ500 pg/mlになるように同一溶液中に懸濁して調製した。
(1.5) 質量分析法における検量線作成用の試料
Aβ40ペプチドについては、３%BSAを含むPBS溶液中に、それぞれ10.8 pg/ml、21.7 pg/ml、43.3pg/ml、86.6 pg/ml、173.2 pg/ml、346.4 pg/ml及び692.8 pg/mlになるように懸濁した。Aβ42ペプチドについては、３%BSAを含むPBS溶液中に、それぞれ2.8 pg/ml、5.6 pg/ml、11.3 pg/ml、22.6 pg/ml、45.2 pg/ml、90.3 pg/ml及び180.6 pg/mLになるように懸濁し、検量線作成用の試料として調製した。
Aβ40ペプチドについては、３%BSAを含むPBS溶液中に、それぞれ10.8 pg/ml、21.7 pg/ml、43.3pg/ml、86.6 pg/ml、173.2 pg/ml、346.4 pg/ml及び692.8 pg/mlになるように懸濁した。Aβ42ペプチドについては、３%BSAを含むPBS溶液中に、それぞれ2.8 pg/ml、5.6 pg/ml、11.3 pg/ml、22.6 pg/ml、45.2 pg/ml、90.3 pg/ml及び180.6 pg/mLになるように懸濁し、検量線作成用の試料として調製した。
(1.6) HISCL(登録商標)-5000測定用のキャリブレータ
HISCL（登録商標）-5000測定用のキャリブレータとして、Aβ40ペプチドを、それぞれ0 pg/ml、8.6 pg/ml、33.3 pg/ml、99.2pg/ml、319.1 pg/ml及び1188.1 pg/mlになるように0.1% BSA、0.14M トリエタノールアミン、0.15M NaCl、0.1% NaN3を含むpH7.0の溶液に懸濁して調製した。
HISCL（登録商標）-5000測定用のキャリブレータとして、Aβ40ペプチドを、それぞれ0 pg/ml、8.6 pg/ml、33.3 pg/ml、99.2pg/ml、319.1 pg/ml及び1188.1 pg/mlになるように0.1% BSA、0.14M トリエタノールアミン、0.15M NaCl、0.1% NaN3を含むpH7.0の溶液に懸濁して調製した。
(1.7) 有機溶媒を含む塩基性溶液の調製
有機溶媒を含む塩基性溶液(遊離試薬)として、実施例１の(1.4)に記載のように、1.68%アンモニア、30%アセトニトリル溶液を調製した。
有機溶媒を含む塩基性溶液(遊離試薬)として、実施例１の(1.4)に記載のように、1.68%アンモニア、30%アセトニトリル溶液を調製した。
(２)質量分析法を用いる測定
(2.1) 免疫沈降
1.5 mlのサンプルチューブ(Eppendorf社)に250μlの上記(1.1)の血漿試料、上記(1.3)のペプチドスパイク試料又は上記(1.5)で調製した各Aβ40ペプチド溶液若しくはAβ42ペプチド溶液を加えた。上記溶液を含む各サンプルチューブに、上記(1.4)で調製した15N- Aβ40及び15N- Aβ42を含む溶液250μlを加え、室温にて30分静置した。静置後、各試料溶液に上記(1.4)で調製した6E10抗体を固定化した磁性粒子(４mg抗体/0.4mg 磁性粒子)懸濁液40μlを加え、室温でローテーターを用い1時間転倒混和した。これらの溶液を、磁気スタンドを用いて集磁して上清を除いた。
(2.1) 免疫沈降
1.5 mlのサンプルチューブ(Eppendorf社)に250μlの上記(1.1)の血漿試料、上記(1.3)のペプチドスパイク試料又は上記(1.5)で調製した各Aβ40ペプチド溶液若しくはAβ42ペプチド溶液を加えた。上記溶液を含む各サンプルチューブに、上記(1.4)で調製した15N- Aβ40及び15N- Aβ42を含む溶液250μlを加え、室温にて30分静置した。静置後、各試料溶液に上記(1.4)で調製した6E10抗体を固定化した磁性粒子(４mg抗体/0.4mg 磁性粒子)懸濁液40μlを加え、室温でローテーターを用い1時間転倒混和した。これらの溶液を、磁気スタンドを用いて集磁して上清を除いた。
(2.2) 洗浄工程
上清を除いた後、サンプルチューブに残った磁性粒子に、１mLの3% BSAを含むPBS溶液を加え混和後、再び集磁して上清を除いた。この操作を、１mLの3% BSAを含むPBS溶液で２回、１mLの50 mM 酢酸アンモニウム溶液で２回、１mLの超純水で1回続けて行い、磁性粒子を洗浄した。
上清を除いた後、サンプルチューブに残った磁性粒子に、１mLの3% BSAを含むPBS溶液を加え混和後、再び集磁して上清を除いた。この操作を、１mLの3% BSAを含むPBS溶液で２回、１mLの50 mM 酢酸アンモニウム溶液で２回、１mLの超純水で1回続けて行い、磁性粒子を洗浄した。
(2.3) Aβペプチドの遊離
上記(2.2)での磁性粒子の洗浄後、洗浄液を除去して残った磁性粒子に、上記(1.7)で調製した遊離試薬を25μL添加して混合し、1分間静置した。磁性粒子を再び集磁し、上清を溶出液として回収した。
上記(2.2)での磁性粒子の洗浄後、洗浄液を除去して残った磁性粒子に、上記(1.7)で調製した遊離試薬を25μL添加して混合し、1分間静置した。磁性粒子を再び集磁し、上清を溶出液として回収した。
(2.4) 質量分析法
上記(2.3)で調製した溶出液を、LC-MS/MSに供してMRM測定を行った。LC-MS/MSの条件は実施例１の(２)と同様にして行った。
上記(2.3)で調製した溶出液を、LC-MS/MSに供してMRM測定を行った。LC-MS/MSの条件は実施例１の(２)と同様にして行った。
(３) イムノアッセイを用いる測定
上記(２)とは別に、上記(1.1)の血漿試料、上記(1.3)のペプチドスパイク試料に対して、HISCL(登録商標)-5000を用いるイムノアッセイによりAβペプチド濃度を測定した。R1試薬(捕捉用抗体試薬)は、82E1抗体を、慣用の手法によりビオチンで標識して、pH7.5の1%BSA、0.1M Tris-HCl、0.15M NaCl、0.1% NaN3を含むバッファーに溶解して調製した。R2試薬(固相)として、ストレプトアビジン結合磁性粒子を含むHISCL(登録商標) R2試薬(シスメックス株式会社)を用いた。R3試薬(検出用抗体試薬)は、1A10抗体を慣用の手法によりアルカリホスファターゼ(ALP)で標識して、pH7.5の1%BSA、0.1M Tris-HCl、0.15M NaCl、0.1% NaN3を含むバッファーに溶解して調製した。R4試薬(測定用緩衝液)として、HISCL(登録商標) R4試薬(シスメックス株式会社)を用いた。R5試薬(ALP基質溶液)として、HISCL(登録商標) R5試薬(シスメックス株式会社)を用いた。
上記(２)とは別に、上記(1.1)の血漿試料、上記(1.3)のペプチドスパイク試料に対して、HISCL(登録商標)-5000を用いるイムノアッセイによりAβペプチド濃度を測定した。R1試薬(捕捉用抗体試薬)は、82E1抗体を、慣用の手法によりビオチンで標識して、pH7.5の1%BSA、0.1M Tris-HCl、0.15M NaCl、0.1% NaN3を含むバッファーに溶解して調製した。R2試薬(固相)として、ストレプトアビジン結合磁性粒子を含むHISCL(登録商標) R2試薬(シスメックス株式会社)を用いた。R3試薬(検出用抗体試薬)は、1A10抗体を慣用の手法によりアルカリホスファターゼ(ALP)で標識して、pH7.5の1%BSA、0.1M Tris-HCl、0.15M NaCl、0.1% NaN3を含むバッファーに溶解して調製した。R4試薬(測定用緩衝液)として、HISCL(登録商標) R4試薬(シスメックス株式会社)を用いた。R5試薬(ALP基質溶液)として、HISCL(登録商標) R5試薬(シスメックス株式会社)を用いた。
HISCL(登録商標)-5000による測定手順は、上記(1.1)の血漿試料又は上記(1.3)のペプチドスパイク試料を用いること以外は、実施例２の(２)と同様にして行った。
(４) 相関係数の算出
上記(２)及び(３)において測定されたAβ40ペプチド及びAβ42ペプチドの各測定結果について、横軸に質量分析法を用いて測定した結果、縦軸にHISCL(登録商標)-5000を用いて測定した結果をプロットし、プロットされた各データを用いて相関係数rを計算した結果を図１０及び図１１に示す。図１０Ａは血漿試料中のAβ40ペプチドの測定結果を示すグラフであり、図１０Ｂはペプチドスパイク試料中のAβ40ペプチドの測定結果を示すグラフであり、図１０Ｃは図１０Ａ及び図１０Ｂの測定結果の両方を含むグラフである。図１１Ａは血漿試料中のAβ42ペプチドの測定結果を示すグラフであり、図１１Ｂはペプチドスパイク試料中のAβ42ペプチドの測定結果を示すグラフであり、図１１Ｃは図１１Ａ及び図１１Ｂの測定結果の両方を含むグラフである。
上記(２)及び(３)において測定されたAβ40ペプチド及びAβ42ペプチドの各測定結果について、横軸に質量分析法を用いて測定した結果、縦軸にHISCL(登録商標)-5000を用いて測定した結果をプロットし、プロットされた各データを用いて相関係数rを計算した結果を図１０及び図１１に示す。図１０Ａは血漿試料中のAβ40ペプチドの測定結果を示すグラフであり、図１０Ｂはペプチドスパイク試料中のAβ40ペプチドの測定結果を示すグラフであり、図１０Ｃは図１０Ａ及び図１０Ｂの測定結果の両方を含むグラフである。図１１Ａは血漿試料中のAβ42ペプチドの測定結果を示すグラフであり、図１１Ｂはペプチドスパイク試料中のAβ42ペプチドの測定結果を示すグラフであり、図１１Ｃは図１１Ａ及び図１１Ｂの測定結果の両方を含むグラフである。
(５) 捕捉抗体を変えて相関係数を測定した場合
比較例として、上記(３)において、Aβ42ペプチドの捕捉抗体を82E1から6E10に代えて同様の実験を行った。6E10抗体は、AβペプチドのＮ末端のアミノ酸残基から数えて３～８番目の領域エピトープとして認識する抗体である。その測定結果と、上記(２)で測定したAβ42ペプチドの測定結果とを用いて上記(４)と同様にプロットした結果を図１２に示す。図１２より、捕捉抗体を6E10抗体にすると、イムノアッセイの結果が質量分析測定の結果と相関しないことが示された。図１２の結果、及び図１０～図１１の結果から、捕捉抗体として82E1抗体を用いることで、質量分析法を用いた測定の結果とイムノアッセイを用いた測定との間に高い相関性があることが示された。
比較例として、上記(３)において、Aβ42ペプチドの捕捉抗体を82E1から6E10に代えて同様の実験を行った。6E10抗体は、AβペプチドのＮ末端のアミノ酸残基から数えて３～８番目の領域エピトープとして認識する抗体である。その測定結果と、上記(２)で測定したAβ42ペプチドの測定結果とを用いて上記(４)と同様にプロットした結果を図１２に示す。図１２より、捕捉抗体を6E10抗体にすると、イムノアッセイの結果が質量分析測定の結果と相関しないことが示された。図１２の結果、及び図１０～図１１の結果から、捕捉抗体として82E1抗体を用いることで、質量分析法を用いた測定の結果とイムノアッセイを用いた測定との間に高い相関性があることが示された。
１０、２０、３０、４０： 試薬キット
１１、２１、３１、４１： 第１容器
１２、２２、３２、４２： 第２容器
２３、３３、４３： 第３容器
３４、４４： 第４容器
４５： 第５容器
４６： 第６容器
１３、２４、３５、４７： 梱包箱
１４、２５、３６、４８： 添付文書
１１、２１、３１、４１： 第１容器
１２、２２、３２、４２： 第２容器
２３、３３、４３： 第３容器
３４、４４： 第４容器
４５： 第５容器
４６： 第６容器
１３、２４、３５、４７： 梱包箱
１４、２５、３６、４８： 添付文書
Claims (20)
- イムノアッセイにより血液試料中のAβペプチドを測定するための抗体セットであって、
前記抗体セットが、前記Aβペプチドに特異的に結合する捕捉抗体及び検出抗体を含み、
前記捕捉抗体が、前記AβペプチドのＮ末端残基を含むエピトープに結合する抗体であり、前記検出抗体が、前記捕捉抗体が結合するエピトープとは異なるエピトープに結合する抗体であり、前記Aβペプチドが、Aβ40及びAβ42の少なくとも１つである、抗体セット。 - 前記捕捉抗体及び前記検出抗体を用いるHISCL(登録商標)-5000による測定で得られるAβペプチドの測定値Ｘと、質量分析法による測定で得られるAβペプチドの測定値Ｙとを直線回帰分析した場合に算出される相関係数ｒが0.8以上であり、
前記HISCL(登録商標) -5000による測定が、前記捕捉抗体とアルカリホスファターゼで標識された前記検出抗体とを用いて、前記血液試料中のAβペプチドを測定することを含み、
前記質量分析法による測定が、前記血液試料中のAβペプチドを抗Aβモノクローナル抗体6E10により免疫沈降すること、免疫沈降された前記Aβペプチドと前記抗体との複合体から前記Aβペプチドを、0.56%アンモニア及び40%アセトニトリルを含む溶液によって遊離すること、遊離した前記Aβペプチドを含む溶液をACQUITY(登録商標) UPLC(登録商標) ペプチド BEH C18 カラムを用いるACQUITY(登録商標) UPLC(登録商標) H-クラス バイオ システムによる液体クロマトグラフィーで分離すること、及び分離された前記Aβペプチドを、エレクトロスプレーイオン化法を用いるXevo(登録商標) TQ-XSトリプル四重極型質量分析計を用いて測定することを含み、
前記質量分析計による測定が多重反応モニタリング(MRM)測定であり、前記MRM測定において、前記質量分析計をポジティブイオン測定モードで用い、MRMトランジションが、Aβ40ペプチドに対してプレカーサイオン/プロダクトイオン=1083.4/1054、及びAβ42ペプチドに対してプレカーサイオン/プロダクトイオン=1129.5/1078.8である、
請求項１に記載の抗体セット。 - 前記捕捉抗体及び前記検出抗体を用いる全自動免疫測定装置による測定で得られるAβペプチドの測定値Ｘと、質量分析法による測定で得られるAβペプチドの測定値Ｙとを直線回帰分析した場合に算出される相関係数ｒが0.8以上であり、
前記全自動免疫測定装置による測定が、前記捕捉抗体と、アルカリホスファターゼで標識された前記検出抗体とを用いて前記血液試料中のAβペプチドを測定することを含み、
前記質量分析法による測定が、前記血液試料中のAβペプチドを抗Aβモノクローナル抗体6E10により免疫沈降すること、免疫沈降された前記Aβペプチドと前記抗体との複合体から前記Aβペプチドを、有機溶媒を含む塩基性溶液によって遊離すること、遊離した前記Aβペプチドを含む溶液を液体クロマトグラフィーで分離すること、及び、分離された前記Aβペプチドをイオン化してトリプル四重極質量分析計により測定することを含む、
請求項１に記載の抗体セット。 - 血液試料中のAβペプチドをインビトロで測定する方法であって、
前記Aβペプチドに特異的に結合する捕捉抗体及び検出抗体を含む抗体セットを用いるイムノアッセイにより、前記Aβペプチドを測定する工程を含み、
前記捕捉抗体が、前記AβペプチドのＮ末端残基を含むエピトープに結合する抗体であり、前記検出抗体が、前記捕捉抗体が結合するエピトープとは異なるエピトープに結合する抗体であり、前記Aβペプチドが、Aβ40及びAβ42の少なくとも１つである、
Aβペプチドの測定方法。 - 前記抗体セットが、前記捕捉抗体及び前記検出抗体を用いるHISCL(登録商標) -5000による測定で得られるAβペプチドの測定値Ｘと、質量分析法による測定で得られるAβペプチドの測定値Ｙとを直線回帰分析した場合、0.8以上の相関係数ｒが算出される抗体セットであり、
前記HISCL(登録商標) -5000による測定が、前記捕捉抗体とアルカリホスファターゼで標識された前記検出抗体とによって、前記血液試料中のAβペプチドを測定することを含み、
前記質量分析法による測定が、前記血液試料中のAβペプチドを抗Aβモノクローナル抗体6E10により免疫沈降すること、免疫沈降された前記Aβペプチドと前記抗体との複合体から前記Aβペプチドを、0.56%アンモニア及び40%アセトニトリルを含む溶液によって遊離すること、遊離した前記Aβペプチドを含む溶液をACQUITY(登録商標) UPLC(登録商標)ペプチド BEH C18 カラムを用いるACQUITY(登録商標) UPLC(登録商標) H-クラス バイオ システムによる液体クロマトグラフィーで分離すること、及び分離された前記Aβペプチドを、エレクトロスプレーイオン化法を用いるXevo(登録商標) TQ-XSトリプル四重極型質量分析計を用いて測定することを含み、
前記質量分析計による測定が多重反応モニタリング(MRM)測定であり、前記MRM測定において、前記質量分析計をポジティブイオン測定モードで用い、MRMトランジションが、Aβ40ペプチドに対してプレカーサイオン/プロダクトイオン=1083.4/1054、及びAβ42ペプチドに対してプレカーサイオン/プロダクトイオン=1129.5/1078.8である、
請求項４に記載の方法。 - 前記抗体セットが、前記捕捉抗体及び前記検出抗体を用いる全自動免疫測定装置による測定で得られるAβペプチドの測定値Ｘと、質量分析法による測定で得られるAβペプチドの測定値Ｙとを直線回帰分析した場合、0.8以上の相関係数ｒが算出される抗体セットであり、
前記全自動免疫測定装置による測定が、前記捕捉抗体と、アルカリホスファターゼで標識された前記検出抗体とを用いて前記血液試料中のAβペプチドを測定することを含み、
前記質量分析による測定が、前記血液試料中のAβペプチドを抗Aβモノクローナル抗体6E10により免疫沈降すること、免疫沈降された前記Aβペプチドと前記抗体との複合体から前記Aβペプチドを、有機溶媒を含む塩基性溶液によって遊離すること、遊離した前記Aβペプチドを含む溶液を液体クロマトグラフィーで分離すること、及び、分離された前記Aβペプチドをイオン化してトリプル四重極質量分析計により測定することを含む、
請求項４に記載の方法。 - 前記相関係数ｒが、0.85以上である、請求項１～６のいずれか１項に記載の抗体セット又は方法。
- 前記相関係数ｒが、0.9以上である、請求項１～７のいずれか１項に記載の抗体セット又は方法。
- 前記検出抗体が、前記AβペプチドのＣ末端残基を含むエピトープに結合する抗体である、請求項１～８のいずれか１項に記載の抗体セット又は方法。
- 前記捕捉抗体のエピトープが、前記AβペプチドのＮ末端から数えて１～16番目のアミノ酸残基からなる領域に含まれ、前記検出抗体のエピトープが、前記AβペプチドのＮ末端から数えて35～40番目又は36～42番目のアミノ酸残基からなる領域に含まれる、請求項１～９のいずれか１項に記載の抗体セット又は方法。
- 前記捕捉抗体がモノクローナル抗体であり、前記検出抗体がモノクローナル抗体である、請求項１～１０のいずれか１項に記載の抗体セット又は方法。
- 前記塩基性溶液のpHが、11.4以上である、請求項１～１１のいずれか１項に記載の抗体セット又は方法。
- 前記塩基性溶液が、アンモニウムイオンを含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載の抗体セット又は方法。
- 前記捕捉抗体が、固相に固定されている、請求項１～１３のいずれか１項に記載の抗体セット又は方法。
- 前記固相が、磁性粒子である、請求項１４に記載の抗体セット又は方法。
- 前記検出抗体が、標識物質で標識されている、請求項１～１５のいずれか１項に記載の抗体セット又は方法。
- 前記標識物質が、酵素である、請求項１６に記載の抗体セット又は方法。
- 前記酵素が、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、グルコシダーゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、チロシナーゼ、酸性ホスファターゼ及びルシフェラーゼから選択される少なくとも１つである、請求項１７に記載の抗体セット又は方法。
- 請求項１～３のいずれか１項に記載の捕捉抗体と検出抗体とを含む、試薬キット。
- 前記酵素に対する基質をさらに含む、請求項１９に記載の試薬キット。
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| WO2022181273A1 (ja) * | 2021-02-25 | 2022-09-01 | 株式会社 島津製作所 | ペプチド測定における品質管理用標準溶液、及びペプチド測定の品質管理 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20210405061A1 (en) | 2021-12-30 |
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