CN116106554A - 一种利用液相色谱-质谱联用检测鹿角胶含量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于分析测试领域,具体涉及一种利用液相色谱‑质谱联用检测鹿角胶含量的方法。该方法通过以下方法实现：制备空白基质溶液、对照品溶液、供试品溶液；然后精密量取对照品溶液和供试品溶液，酶解，酶解结束后取出，放凉，即得；制备标准曲线溶液，分别精密吸取不同浓度的标准曲线溶液与供试品溶液，利用液相色谱‑质谱法进行检测即可。本发明首次使用肽段序列鹿角胶多肽A进行鹿角胶含量的检测，与传统的测定氨基酸和总氮量的方法相比，易于实施，专属性好，检测效率高，可以对鹿角胶的原料质量控制和生产工艺改善提供思路，对鹿角胶的质量控制具有重要意义。

Description

一种利用液相色谱-质谱联用检测鹿角胶含量的方法
技术领域
本发明属于分析测试领域,具体涉及一种利用液相色谱-质谱联用检测鹿角胶含量的方法。
背景技术
鹿角胶现有的含量测定方法为《中国药典》2020年版中对其中L-羟脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、L-脯氨酸的含量进行测定。由于以上四种氨基酸在胶原蛋白中含量非常异常高，这一方法实际测定的是鹿角胶中胶原蛋白的含量，并不具有物种专属性，这使得很多使用猪皮、牛皮、马皮等劣质皮料作为原料生产出的假药鹿角胶含量测定都合格，与鹿角胶质量控制初衷背道而驰。并且该方法供试品溶液制备过程需要进行复杂的盐酸水解以及氨基酸的衍生化，所使用的试剂毒性大，对实验操作的要求很高。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明首次提供了一种利用液相色谱-质谱联用检测鹿角胶含量的方法，与传统的测定氨基酸和总氮量的方法相比，易于实施，专属性好，检测效率高，可以对鹿角胶的原料质量控制和生产工艺改善提供思路，对鹿角胶的质量控制具有重要意义。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案为：
本发明提供了一种利用液相色谱-质谱联用检测鹿角胶含量的方法，包括以下步骤：
（1）空白基质溶液的制备：取驯鹿角胶，精密称定，至容量瓶中，加碳酸氢胺溶液适量，超声，然后加碳酸氢胺溶液至刻度，摇匀，滤过，即得；
（2）对照品溶液的制备：取鹿角胶多肽A对照品适量，精密称定，加空白基质溶液配置成溶液，即得；
（3）供试品溶液的制备：取鹿角胶样品，精密称定，置容量瓶中，加碳酸氢胺溶液适量，超声处理，然后加碳酸氢胺溶液至刻度，摇匀，滤过，即得；
（4）精密量取对照品溶液和供试品溶液，分别精密加入胰蛋白酶溶液，酶解，酶解结束后取出，放凉，即得；
（5）制备标准曲线溶液，分别精密吸取不同浓度的标准曲线溶液与供试品溶液，注入高效液相色谱－质谱联用仪，以对照品峰面积为纵坐标，对照品浓度为横坐标制备标准曲线；从标准曲线读出供试品溶液中相当于鹿角胶多肽A的量，计算即得。
进一步的，步骤（1）中，所述碳酸氢胺溶液的浓度为1%（v/v）；每20mg驯鹿角胶中加入碳酸氢胺溶液为5mL。3、根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述鹿角胶多肽A的肽段序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：TPVGGQPSVPGGPVR。
进一步的，步骤（2）中，所述对照品溶液的浓度为0.5μg/ml。
进一步的，步骤（3）中，所述碳酸氢胺溶液的浓度为1%（v/v）；每20mg鹿角胶样品中加入碳酸氢胺溶液为5mL。
进一步的，步骤（4）中，每90μl对照品溶液或供试品溶液中，加入10μL 10mg/mL的胰蛋白酶溶液；所述酶解为37℃下酶解12h。
进一步的，步骤（5）中，所述标准曲线溶液的制备方法为：精密量取对照品溶液0.1ml、0.5ml、1ml、2ml、3ml，分别置10ml量瓶中，加1%碳酸氢按溶液稀释至刻度。
进一步的，步骤（5）中，所述高效液相色谱－质谱的条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(色谱柱内径2.1mm)；以1%甲酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，进行梯度洗脱；流速为每分钟0.3ml，柱温为43 ℃；所述梯度洗脱的程序为：
。
进一步的，所述高效液相色谱－质谱中，采用三重四极杆质谱检测器，电喷雾离子化(ESI)正离子模式下多反应监测(MRM),监测离子对为：
。
本发明所提供的检测方法中，所述鹿角胶含特征多肽以鹿角胶多肽A的含量计应不得少于3.1μg/g，为梅花鹿角或马鹿的鹿角胶正品。
本发明选择肽段序列为TPVGGQPSVPGGPVR的多肽为对照品，将其命名为鹿角胶多肽A，进行人工合成，纯度95%，脱盐。选择702.88→865.49为定量离子，702.88→1107.56为定性离子对建立基于质谱的鹿角胶含量测定方法，并进行方法学实验。
本发明的有益效果为：本发明首次使用肽段序列鹿角胶多肽A进行鹿角胶含量的检测，与传统的测定氨基酸和总氮量的方法相比，易于实施，专属性好，检测效率高，可以对鹿角胶的原料质量控制和生产工艺改善提供思路，对鹿角胶的质量控制具有重要意义。
附图说明
图1为鹿角胶含量测定重复性实验质谱图。
图2为鹿角胶含量测定线性实验。
图3为鹿角胶含量测定专属性实验。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步的解释和说明。
本发明空白基质溶液制备过程中，所使用的驯鹿角胶的制备方法为：将驯鹿角粉碎，取250g，置1000ml水中浸泡，12小时换水1次，共换4次；浸泡后的样品置锅中，加水1000ml，加热110℃熬煮，保持水量稳定；每8小时取汁一次，煮至样品软烂（共取汁三次），将所得胶汁合并过滤，浓缩，干燥，即得。
实施例1
（1）空白基质溶液的制备：取驯鹿角胶，取20mg，精密称定，置5ml量瓶中，加1%（v/v）碳酸氢胺溶液适量，超声30分钟，加1%（v/v）碳酸氢胺溶液至刻度，摇匀，滤过，即得；
（2）对照品溶液的制备：取鹿角胶多肽A对照品适量，精密称定，加空白基质溶液配置成0.5μg/ml的溶液，即得；
（3）供试品溶液的制备：取鹿角胶样品，取20mg，精密称定，置5ml量瓶中，加1%（v/v）碳酸氢胺溶液适量，超声处理（功率250W,频率40KHz）30分钟，加1%（v/v）碳酸氢胺溶液至刻度，摇匀，滤过，即得；
（4）精密量取上述对照品溶液和供试品溶液各90μl，置微量进样小瓶中，精密加入10mg/ml胰蛋白酶溶液10μl，置37℃酶解过夜，取出，放凉，即得。
（5）以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(色谱柱内径2.1mm)；以1%甲酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，按下表1中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.3ml，柱温为43℃。
表1
。
采用三重四极杆质谱检测器，电喷雾离子化(ESI)正离子模式下多反应监测(MRM),监测离子对见下表2。
表2
。
（6）测定法：精密量取对照品溶液0.1ml、0.5ml、1ml、2ml、3ml，分别置10ml量瓶中，加1%碳酸氢按溶液稀释至刻度，制成标准曲线溶液。分别精密吸取不同浓度的标准曲线溶液与供试品溶液各5µ1，注入高效液相色谱－质谱联用仪，以对照品峰面积为纵坐标，对照品浓度为横坐标制备标准曲线。从标准曲线读出供试品溶液中相当于鹿角胶多肽A的量，计算即得。
规定：本品按干燥品计算，含特征多肽以鹿角胶多肽A的含量计应不得少于3.1μg/g。
效果验证-方法学实验：
（一）重复性实验
取同一批鹿角胶样品约20mg，平行称取6份，精密称定，按实施例1中，“供试品溶液制备方法”制备供试品溶液，进样分析，记录色谱图，如图1所示，计算鹿角胶多肽A的含量，结果6份平行样品的含量分别为14.23、14.77、13.87、14.04、14.46、14.02，平均值14.23,相对标准偏差（RSD）为2.3%，小于5.0%的限度。
（二）线性实验
不同浓度线性关系考察：取鹿角胶多肽A适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.5µg的溶液，精密量取对照品溶液0.1ml、0.5ml、1ml、2ml、3ml，分别置10ml量瓶中，加1% 碳酸氢胺溶液至刻度，混匀，照本发明提供的高效液相色谱法-质谱法试验，以702.88(双电荷)→865.49的峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，如图2所示。回归方程为y=4507.6x+13826，相关系数R2为0.9997，说明线性关系良好。
（三）回收率实验
精密称取同一批号3份样品约20mg，分别置5ml量瓶中，按高中低三个不同浓度分别精密加入鹿角胶多肽A对照品溶液（50ng /ml）1.25ml、2.5ml、3.75 ml，按供试品制备方法处理，按以上确定条件，进行含量测定。结果表明三个不同浓度的回收率分别为：101.85、105.83、107.37。
（四）专属性实验
精密称取梅花鹿角胶、马鹿角胶、驯鹿角胶、驼鹿角胶、白尾鹿角胶、马鹿鹿皮胶、驴皮胶、牛皮胶、马皮胶、猪皮胶20mg，分别置5ml量瓶中，按供试品制备方法处理，按以上确定条件，进行含量测定，如图3所示，结果发现仅梅花鹿角胶与马鹿角胶在鹿角胶多肽A的定量离子及定性离子条件下有响应，证明该含量测定方法专属性好。
（五）鹿角胶含量限度制定
根据6批样品的实测数据，确定鹿角胶中鹿角胶多肽A的含量范围为3.9-14.15μg/g，均值为11.15μg/g，选择含量最少一批鹿角胶多肽A含量的80%制定限度，即含特征多肽以鹿角胶多肽A的含量计应不得少于3.1μg/g。
对比例1
（1）对照品溶液的制备：取鹿角胶多肽A对照品适量，精密称定，加1%（v/v）碳酸氢胺溶液配置成0.5μg/ml的溶液，即得；
（2）供试品溶液的制备：取鹿角胶样品，取20mg，精密称定，置5ml量瓶中，加1%（v/v）碳酸氢胺溶液适量，超声处理（功率250W,频率40KHz）30分钟，加1%（v/v）碳酸氢胺溶液至刻度，摇匀，滤过，即得；
（3）精密量取上述对照品溶液和供试品溶液各90μl，置微量进样小瓶中，精密加入10mg/ml胰蛋白酶溶液10μl，置37℃酶解过夜，取出，放凉，即得。
（4）以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(色谱柱内径2.1mm)；以1%甲酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.3ml，柱温为43℃；其他检测条件同实施例1。
该对比例中，发明人使用碳酸氢铵溶液作为鹿角胶多肽A对照品的溶剂，在进行方法学实验时，回收率范围为70%-140%,不能符合方法学的要求；而本发明选择完全不含鹿角胶多肽A的驯鹿角胶溶液作为鹿角胶多肽A的溶剂进行回收率实验，结果符合要求。

Claims (10)

1.一种利用液相色谱-质谱联用检测鹿角胶含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）空白基质溶液的制备：取驯鹿角胶，精密称定，至容量瓶中，加碳酸氢胺溶液适量，超声，然后加碳酸氢胺溶液至刻度，摇匀，滤过，即得；
（2）对照品溶液的制备：取鹿角胶多肽A对照品适量，精密称定，加空白基质溶液配置成溶液，即得；
（3）供试品溶液的制备：取鹿角胶样品，精密称定，置容量瓶中，加碳酸氢胺溶液适量，超声处理，然后加碳酸氢胺溶液至刻度，摇匀，滤过，即得；
（4）精密量取对照品溶液和供试品溶液，分别精密加入胰蛋白酶溶液，酶解，酶解结束后取出，放凉，即得；
（5）制备标准曲线溶液，分别精密吸取不同浓度的标准曲线溶液与供试品溶液，注入高效液相色谱－质谱联用仪，以对照品峰面积为纵坐标，对照品浓度为横坐标制备标准曲线；从标准曲线读出供试品溶液中相当于鹿角胶多肽A的量，计算即得。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述碳酸氢胺溶液的浓度为1%（v/v）；每20mg驯鹿角胶中加入碳酸氢胺溶液为5mL。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述鹿角胶多肽A的肽段序列为：TPVGGQPSVPGGPVR。
4.根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述对照品溶液的浓度为0.5μg/ml。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，所述碳酸氢胺溶液的浓度为1%（v/v）；每20mg鹿角胶样品中加入碳酸氢胺溶液为5mL。
6.根据权利要求1、3、4和5任一项所述的方法，其特征在于，步骤（4）中，每90μl对照品溶液或供试品溶液中，加入10μL 10mg/mL的胰蛋白酶溶液；所述酶解为37℃下酶解12h。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（5）中，所述标准曲线溶液的制备方法为：精密量取对照品溶液0.1ml、0.5ml、1ml、2ml、3ml，分别置10ml量瓶中，加1%碳酸氢按溶液稀释至刻度。
8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于，步骤（5）中，所述高效液相色谱－质谱的条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(色谱柱内径2.1mm)；以1%甲酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，进行梯度洗脱；流速为每分钟0.3ml，柱温为43 ℃；所述梯度洗脱的程序为：
。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述高效液相色谱－质谱中，采用三重四极杆质谱检测器，电喷雾离子化(ESI)正离子模式下多反应监测(MRM),监测离子对为：
。
10.根据权利要求1-9任一项所述的方法，其特征在于，所述鹿角胶含特征多肽以鹿角胶多肽A的含量计应不得少于3.1μg/g，为梅花鹿角或马鹿的鹿角胶正品。
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