CN114591399B - 一种中药制剂中筛查驯鹿鹿茸投料的特征多肽及其应用 - Google Patents

一种中药制剂中筛查驯鹿鹿茸投料的特征多肽及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种中药制剂中筛查驯鹿鹿茸投料的特征多肽及其应用。本发明提供的特征多肽具体为：肽段1如SEQ ID No.1所示：VDEVGAEALGR。本发明提供的特征多肽针对含有鹿源成分中药制剂中掺伪驯鹿鹿茸具有优异的专属性，特异性强，可用于检查含有鹿源成分中药制剂中是否掺伪驯鹿鹿茸，具有良好的应用前景。

Description

一种中药制剂中筛查驯鹿鹿茸投料的特征多肽及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种中药制剂中筛查驯鹿鹿茸投料的特征多肽及其应用。
背景技术
鹿茸为鹿科动物梅花鹿或马鹿的雄鹿未骨化密生茸毛的幼角，前者习称“花鹿茸”，后者习称“马鹿茸”。梅花鹿为国家一级保护动物，马鹿为重点的国家二级保护动物，现已禁止非法捕猎与贸易，因此鹿茸价格昂贵，市场需求量较大，部分不法分子利用价格相对较低的驯鹿鹿茸、充当鹿茸投料生产含鹿茸中药制剂，加之相应的质量控制指标缺失，导致中成药质量难以保证。
发明内容
针对现有技术中存在的技术空白，本发明提供了一种筛查中药制剂中使用驯鹿鹿茸投料的特征多肽。
本发明还提供了上述特征多肽在检查定坤丹掺伪驯鹿鹿茸中的应用。
本发明为了实现上述目的所采用的技术方案为：
本发明提供了一种中药制剂中筛查驯鹿鹿茸投料的特征多肽，所述特征多肽如SEQ ID No.1所示：VDEVGAEALGR。
上述特征多肽的质荷比为558.29(z=2)。
本发明还提供了一种用于筛查驯鹿鹿茸投料的中药制剂的试剂盒，所述试剂盒中包含权利要求1所述的特征多肽。
本发明还提供了一种利用上述特征多肽筛查驯鹿鹿茸投料的方法，包括以下步骤：
（1）对待测样品进行前处理，得待检测溶液；
（2）将待检测溶液通过液相-三重四级杆质谱法进行检测，分析对比待检测溶液中的质谱结果同肽段1的质谱图，当质谱图中出现肽段1的质谱图时，可判断待测样品为驯鹿鹿茸或掺伪驯鹿鹿茸。
进一步的，所述待测样品的前处理具体过程为：取相当于鹿茸添加量50mg的样品，精密称定，加水15ml，振摇20分钟，离心（4000rpm，10min），弃去上层水液，如法清洗2次。所得沉淀精密加入50ml变性缓冲液和5ml DTT溶液，摇匀，置90℃处理4h，取出放冷至室温，离心（12000rpm，10min）。精密量取上清液500μL，精密加入100μL IAA溶液，避光反应30min，混匀，离心（12000rpm，10min）；精密量取上清液100μL，精密加入900μL碳酸氢铵溶液和5μL牛胰蛋白酶溶液，37℃酶解15min；然后置90℃处理10min，取出放冷至室温，离心（12000rpm，10min），取上清液，即得。
上述变性缓冲液具体制备过程为：称取573.1g 盐酸胍，121.1g 三羟甲基氨基甲烷，0.734g乙二胺四乙酸，加水溶解，加浓盐酸调pH至8.0，加水稀释至1L，摇匀，即得；所述DTT溶液的浓度为0.5M；所述IAA溶液的浓度为0.55M。
进一步的，所述牛胰蛋白酶溶液的具体制备过程为：液称取牛胰蛋白酶适量，用乙酸溶液溶解，制成浓度为10mg/ml的溶液，临用现配；所述乙酸溶液的浓度为2%。
本发明所使用的液相-三重四级杆质谱法中，液相条件为：液相条件为：色谱柱为ACQUITY UPLC® BEH C18 (2.1×50mm，1.7μm)，柱温43℃，流速0.3mL/min，流动相A为0.1%甲酸乙腈溶液，B为0.1%甲酸溶液，进行梯度洗脱。
上述梯度洗脱的条件为：0~25min,95%B→80%B；25~40min, 80%B→50%B，进样量为5 μL。
本发明所使用的液相-三重四级杆质谱法中，质谱条件：采用质谱检测器，电喷雾离子化（ESI），正离子模式下，进行多反应监测；鞘气流速46L/hr；辅助气流速850 L/hr；喷雾电压3.5KV；离子源温度150℃；辅助气温度400℃；锥孔电压30V，碰撞电压35V)；选择m/z（二电荷）558.29→673.37 558.29 →772.43作为检测离子对。
本发明的有益效果为：
（1）本发明提供的特征多肽及检测方法，为掺伪驯鹿鹿茸的中药制剂的检查提供了解决方案。
（2）本发明提供的特征多肽针对掺伪驯鹿鹿茸的中药制剂具有优异的专属性和稳定性，特异性强，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为m/z（二电荷）558.29的二级质谱图及y离子、b离子归属。
图2 为 m/z（二电荷）558.29的专属性实验结果。
具体实施方式
下面通过具体的实施方式对本发明的技术方案作进一步的解释和说明。
（一）仪器和试剂：Thermo EASY-nLC 1000纳升液相，Thermo ScientificOrbitrap-Fusion高分辨质谱，AB Triple Quad 6500+高效液相色谱质谱联用仪，赛多利斯XSE205电子天平，胰蛋白酶（Sigma公司生产，批号：SLBG6452V）盐酸胍、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、乙二胺四乙酸(EDTA)、二硫苏糖醇（DTT）、碘代乙酰胺（IAA）、碳酸氢铵、乙酸均为分析纯。甲酸、乙腈均为色谱纯。
用于进行实验的为鹿茸、定坤丹样品，由企业提供，经山东省农业科学院PCR实验检定鹿源。
实施例1
1、测定条件
1.1 液相-三重四极杆质谱测定条件
液相条件：色谱柱为ACQUITY UPLC® BEH C18 (2.1×50mm，1.7μm)，柱温43℃，流速0.3mL/min，流动相A为0.1%甲酸乙腈溶液，B为0.1%甲酸溶液，进行梯度洗脱。上述梯度洗脱的条件为：0~25min,95%B→80%B；25~40min, 80%B→50%B，进样量为5 μL。质谱条件：采用质谱检测器，电喷雾离子化（ESI），正离子模式下，进行多反应监测；鞘气流速46L/hr；辅助气流速850 L/hr；喷雾电压3.5KV；离子源温度150℃；辅助气温度400℃；锥孔电压30V，碰撞电压35V)；选择m/z（二电荷）558.29→673.37；558.29 →772.43作为检测离子对。液
2、供试品溶液的制备
样品：使用定坤丹样品进行测定。取本品大蜜丸适量，剪碎，取3.0g，精密称定；或取水蜜丸适量，研细，取2.0g，精密称定，加水15ml，振摇20分钟，离心（4000rpm，10min），弃去上层水液，如法清洗2次。所得沉淀精密加入50ml变性缓冲液和5ml DTT溶液，摇匀，置90℃处理4h，取出放冷至室温，离心（12000rpm，10min）。精密量取上清液500μL，精密加入100μL IAA溶液，避光反应30min，混匀，离心（12000rpm，10min）；精密量取上清液100μL，精密加入900μL碳酸氢铵溶液和5μL牛胰蛋白酶溶液，37℃酶解15min；然后置90℃处理10min，取出放冷至室温，离心（12000rpm，10min），取上清液，即得。
阴性样品：根据不同厂家处方制备不含鹿茸的阴性样品，同供试品溶液制备方法制成阴性样品溶液。
实验结果见表1，结果图片见图2。
表1 专属性实验结果
对比例1
使用《中国药典》2020年版第一部鹿角胶项下鉴别离子对(m/z)765.5（二电荷）→554.1、(m/z)765.5（二电荷）→733.2对鹿茸样品进行测定，发现马鹿茸、梅花鹿茸、驯鹿茸、驼鹿茸均出现吸收峰，不具备专属性。
序列表
<110> 山东省食品药品检验研究院
<120> 一种中药制剂中筛查驯鹿鹿茸投料的特征多肽及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 1
VDEVGAEALGR 11

Claims (7)

1.一种利用特征多肽筛查驯鹿鹿茸投料的方法，其特征在于，所述特征多肽如SEQ IDNo.1所示：VDEVGAEALGR；所述特征多肽的质荷比为558.29(z=2)；
包括以下步骤：
（1）对待测样品进行前处理，得待检测溶液；
（2）将待检测溶液通过液相-三重四级杆质谱法进行检测，分析对比待检测溶液中的质谱结果同特征多肽的质谱图，当质谱图中出现特征多肽的质谱图时，可判断待测样品中掺伪了驯鹿鹿茸成分。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待测样品的前处理具体过程为：取相当于鹿茸添加量50mg的样品，精密称定，加水15ml，振摇20分钟，4000rpm转速下离心10min，弃去上层水液，如法清洗2次；所得沉淀精密加入50ml变性缓冲液和5ml DTT溶液，摇匀，置90℃处理4h，取出放冷至室温，12000rpm转速下离心10min；精密量取上清液500μL，精密加入100μL IAA溶液，避光反应30min，混匀，12000rpm转速下离心10min；精密量取上清液100μL，精密加入900μL碳酸氢铵溶液和5μL牛胰蛋白酶溶液，37℃酶解15min；然后置90℃处理10min，取出放冷至室温，12000rpm转速下离心10min，取上清液，即得。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述变性缓冲液具体制备过程为：称取573.1g 盐酸胍，121.1g 三羟甲基氨基甲烷，0.734g乙二胺四乙酸，加水溶解，加浓盐酸调pH至8.0，加水稀释至1L，摇匀，即得；所述DTT溶液的浓度为0.5M；所述IAA溶液的浓度为0.55M。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述牛胰蛋白酶溶液的具体制备过程为：称取牛胰蛋白酶适量，用乙酸溶液溶解，制成浓度为10mg/ml的溶液，临用现配；所述乙酸溶液的浓度为2%。
5.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述液相-三重四级杆质谱法中，液相条件为：色谱柱为ACQUITY UPLC® BEH C18：2.1×50mm，1.7μm，柱温43℃，流速0.3mL/min，流动相A为0.1%甲酸乙腈溶液，B为0.1%甲酸溶液，进行梯度洗脱。
6.根据权利要求5所述的方法，所述梯度洗脱的条件为：0~25min,95%B→80%B；25~40min, 80%B→50%B，进样量为5 μL。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述液相-三重四级杆质谱法中，质谱条件：采用质谱检测器，电喷雾离子化ESI，正离子模式下，进行多反应监测；鞘气流速46L/hr；辅助气流速850 L/hr；喷雾电压3.5KV；离子源温度150℃；辅助气温度400℃；锥孔电压30V，碰撞电压35V；选择m/z（二电荷）558.29→673.37 558.29 →772.43作为检测离子对。
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CN112098579B (zh) * 2020-09-01 2021-11-23 南京中医药大学 一种区分鹿皮胶或鹿角胶的特征肽段及其检测方法
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