CN110850000A - 液相色谱串联质谱定量意蜂蜜mrjp2的方法 - Google Patents

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honey
mrjp2
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杨术鹏
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周金慧
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张金震
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Abstract

本发明提供一种液相色谱串联质谱定量意蜂蜜MRJP2的方法。本发明筛选出意蜂蜜王浆主蛋白2（MRJP2）的特征肽段，并开发液相色谱串联质谱的定量方法，所述方法包括：筛选特征肽段，制作标准曲线，样品前处理，液相色谱分离以及串联质谱检测，软件定量肽段等步骤。本发明提供的意蜂蜜中MRJP2的定量方法，具有较高的准确度、精确度和灵敏度，且稳定性强，适用于准确定量意蜂蜜中MRJP2。可用于辅助意蜂蜜真实性评价。此外该定量方法对保护蜂蜜消费者的权益和维护蜂产品行业的健康发展具有重要现实意义。

Description

液相色谱串联质谱定量意蜂蜜MRJP2的方法
本发明涉及食品检测领域，具体地说，涉及一种液相色谱串联质谱定量意蜂蜜MRJP2的方法。
背景技术
蜂蜜是蜜蜂采集蜜源植物的花蜜或蜜露与其分泌物混合，经过一段时间酿制后形成的一类具有甜味食品。蜂蜜作为传统的天然食品，具有美容、养颜、安神等保健功能，深受百姓喜爱。蜂蜜的生产劳动强度高、周期长、产量易受到蜜源、天气等因素影响，从而导致蜂蜜的生产成本较高，总产量有限，导致市场上的蜂蜜供不应求。一些不法企业为了追逐巨额利润，在蜂蜜的生产、加工、销售等环节，通过掺入蔗糖、转化糖、果糖、葡萄糖、果葡糖浆等制造掺假蜂蜜，严重扰乱了蜂蜜的正常生产及销售秩序。因此加强对蜂蜜真伪鉴别技术的研究是目前亟需开展的工作。
王浆主蛋白2（major royal jelly protein 2，MRJP2），是蜂蜜中的主要蛋白质之一，是蜂蜜中含量比较丰富的蛋白质。研究结果表明MRJP2的含量相对恒定，若是掺入了糖浆等外源性物质，则其含量必定发生较大的变化，因此MRJP2含量可用以辅助鉴别蜂蜜的掺假现象。对于如何准确定量蜂蜜中MRJP2的含量，目前尚无相关报道。
液相色谱串联质谱技术由于其高选择性和高灵敏度，非常适用于复杂生物基质中蛋白质的准确表征、鉴定和定量。通过高分辨质谱的蛋白质定量可以通过将蛋白样品用胰蛋白酶消化后检测整个蛋白质或特征肽段来实现。肽段水平的检测可以通过分析靶蛋白质的序列中的特征肽段来满足定性要求，进而可用于定量。该方法的关键点是为靶蛋白和合适的内标肽段选择一种或多种特异性特征肽段。在此策略基础上，提出本发明。
发明内容
本发明的目的是提供一种液相色谱串联质谱定量意蜂蜜MRJP2的方法。
本发明的另一目的是将该方法用于生产和商业中对蜂蜜的质量控制和真实性鉴定。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种液相色谱串联质谱定量意蜂蜜MRJP2的方法，所述方法包括质谱法检测意蜂蜜中MRJP2的特征肽段，含有以下特征肽段：
特征肽段1：IVNDDFNFDDVNFR；
特征肽段2：GDALIVYQNADDSFHR。
所述方法还包括对蜂蜜样品进行前处理的步骤，前处理使用的试剂包括：
(1)提取缓冲液：0.01 M PBS，pH7.4；
(2)胰蛋白酶液20 ng/μL，溶剂为40mM碳酸氢氨溶液；
(3)特征肽段1、2的标准品。
本发明提供的利用液相色谱串联质谱测定意蜂蜜中MRJP2蛋白含量的方法，包括以下步骤：
A、配制含有固定浓度的稳定同位素内标肽段的不同浓度的特征肽段标准品溶液，进入质谱检测并绘制标准曲线；
B、待测蜂蜜样品的前处理：提取蜂蜜中的蛋白质，用胰蛋白酶液对样品蛋白进行酶切，对酶解产物除盐；
C、向待测样本中添加稳定同位素内标肽段使其浓度与步骤A中的浓度相同，采用相同方法进行液相色谱串联质谱检测；
D、对照标准曲线，获得待测样本中特征肽段的浓度，从而实现对MRJP2的定量检测；
优选地，液相色谱条件如下：
色谱柱：C18柱；流动相组成：流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为含0.1%甲酸的乙腈；梯度洗脱条件为：0-0.5 min，5%的B；0.5-1.0 min，5-15%的B；1.0-6.5 min，15-40%的B；6.5-7.0 min，40-95%的B；7.0-8.5 min，95%的B；8.5-8.6 min，95-5%B，8.6-10.0 min，5%的B；流速：0.3 mL/min；进样量：5.0 µL。
优选地，质谱条件如下：
离子源参数：鞘气的流速（sheath gas flow rate）38 L/min；辅助气的流速（aux gasflow rate）15 L/min；电喷雾电压（spray voltage）3.2 KV；离子导管的温度（capillarytemperature）275℃；S-lens RF level设为60；离子源温度（Heater temperature）380℃；
采集的模式为正离子模式下的Full MS-ddMS2：
其中，Full MS的具体参数设置如下：分辨率（Resolution）：70000；AGC Target：3e6；Maximum IT：100 ms；Scan range：200-1500 Da；Spectrum data：Centroid；Inclusion：on；
其中，dd-MS2的具体参数设置如下：分辨率（Resolution）：17500，AGC Target：1e5；Maximum IT：50 ms；Loop count：2；Isolation window：2.0 Da；NCE：15，25，35；Spectrumdata：Centroid；而dd settings中，Minimum AGC：8.0e3；Apex trigger：2-6 s；Excludeisotope：on；Dynamic exclus：4.0 s；If idle：pick other。
本发明成功筛选出意蜂定量特征肽段IVNDDFNFDDVNFR，其特异性通过Uniprot数据库进行了验证；并选择稳定的内标（IS）肽段，以便在蜂蜜中准确、灵敏地定量MRJP2。
优选地，所述稳定同位素内标肽段为：IVNDDFNFDDVNFR*，其中，R*表示精氨酸中的碳置换为13C，氮置换为15N。
进一步，所述特征肽段在质谱中所产生的检测信号的母离子具有865.39446质荷比；包含质荷比为1026.46125、1517.62597的子离子。
所述稳定同位素内标肽段在质谱中产生的检测信号的母离子为m/z: 母离子为m/z: 870.39862，同时包含质荷比为1036.47473、1527.63977的子离子。
前述的方法，步骤C得到的标准曲线为Y=0.007651X+0.01499，R2=0.9987，其中，Y为特征肽段/稳定同位素内标肽段的峰面积比，X为特征肽段的浓度；MRJP2蛋白的线性检测范围为10-1000 ng/mL，最低检出限为10 ng/mL。
该方法采用UHPLC-Q Exactive Plus（超高效液相色谱-四级杆串联高分辨静电轨道阱）检测蜂蜜样本，通过比较其图谱中MRJP2特征肽段/ IS肽段峰面积比，推算MRJP2含量，进而判定蜂蜜是否掺假，主要基于MRJP2的特征肽段的母离子在液质上的峰面积和稳定同位素标记的内标（IS）肽段的在液质上的峰面积。
应当理解的是，对上述所用试剂或原料的用量进行等比例扩大或者缩小后的技术方案，与上述内容实质等同，均属于本发明保护范围。
本发明采用UHPLC-Q Exactive plus仪器对蜂蜜中的MRJP2定量，基于高分辨质谱提供的精确质量数，该方法具有较高的特异性和灵敏度。基于本方法采用的仪器和参数，不同分析实验室和检测机构可以依据液相串联高分辨质谱技术的相关知识，对其中的参数进行一定调整，上述调整均属于本发明保护范围。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
研究发现，意蜂MRJP2的含量相对恒定，本发明据此建立起一套蜂蜜真实性评价的方法，用于辅助蜂蜜掺假的鉴别。本发明提供的意蜂MRJP2蛋白含量的检测方法，具有特异性强、灵敏度高、准确度和精确度好等优点，适用于意蜂MRJP2的准确定量。该方法对于维护蜂蜜消费行业健康发展和蜂蜜消费者的权益意义重大。
附图说明
图1为本发明实施例1中通过UHPLC-Q Exactive plus提取的意蜂MRJP2的特征肽段及其同位素内标肽段的离子流图。
图2为本发明实施例1中通过UHPLC-Q Exactive plus检测的意蜂MRJP2的特征肽段及其同位素内标肽段的质谱图。
图3为本发明实施例1中通过UHPLC-Q Exactive plus检测的意蜂MRJP2的特征肽段及其同位素内标肽段的二级碎片质谱图。
图4为本发明实施例1中备选的特征肽段在参考样品中的响应（相对丰度）。
图5为本发明实施例1中来自不同蜂蜜样本中MRJP2的含量的定量结果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
以下实施例中涉及的仪器与试剂：
1.质谱仪(Q-Exactive)，美国Thermo Fisher Scientific公司；
2.台式低温离心机(Microfuge 22R Centrifuge)，美国 BeckMAN Coul TER公司；
3.全波长酶标仪(Multiskan GO)，美国Thermo Fisher Scientific公司；
4.电子分析天平((PL203)，德国METTLERTOLEDO公司；
5. pH计(DELTA 320)，德国METTLER TOLEDO公司；
6.蒸发浓缩仪(Speed-Vacsvstem, RVC2-18)，德国 MarinChrist公司；
7.超纯水机(Milli-QGradient)，美国Millipore公司；
8.超低温冰箱(MDF-U3286S)，日本SANYO公司；
9.1290 Infinity 液相色谱-6495三重四级杆质谱，美国Agilent Technologies公司；
10.二硫苏糖醇(DL-Dithiothreitol, DTT)，中国Solarbio公司；
11.碘乙酰胺(Iodoacetamide, IAA)，美国Merk公司；
12.Bradford法蛋白质定量试剂盒，中国Solarbio公司；
13.碳酸氢铵(NH4HCO3)，美国Sigma公司。
实施例1 利用液相色谱串联质谱测定意蜂MRJP2含量的方法
1. 样品来源
从市场或者蜂农处购买真实的意蜂蜜样本共20份。
2. 实验步骤
（1）溶液配制
5M Urea溶液：称取Urea 4.5 g，超纯水定容到15 mL。
100 mM DTT：称取DTT 308.5 mg，40 mM NH4HCO3溶液定容到20 mL，每管l mL分装，-20℃冰箱保存待用。
40 mM NH4HCO3溶液：称取0.316 g NH4HCO3，用超纯水定容100 mL，4℃冰箱保存待用。
100 mM IAA溶液：称取IAA 0.39 g，用40 mM的NH4HCO3溶液定溶至20 mL，-20℃冰箱保存待用。
5%的B。流速：0.3 mL/min；进样量：5.0 µL。
所述的质谱条件如下：
离子源参数：鞘气温度350 ℃；鞘气流速12 L/min；辅助气温度290 ℃；辅助气流速11L/min；毛细管电压正模式3.5kV；iFunnel参数正模式高压200V、低压100V，采集的模式为正离子模式下的MRM模式。通过绘制特征肽段/IS肽段峰面积比与分析物浓度来绘制校准曲线。
（5）蜂蜜样本的数据处理
根据特征肽段/IS肽段峰面积比带入公式求得特征肽段浓度，再根据式（2）得到意蜂MRJP2蛋白的含量。
X=(ФcVM1)/(M2m) 式（2）
其中，X为（ng/g）是蜂蜜样品意蜂MRJP2的含量，Ф是酶解蛋白体积占总样品体积比例，c（ng/mL）是特征肽段在胰蛋白酶消化物中的浓度，V（mL）是胰蛋白酶消化物的体积，M1、M2是MRJP2和特征肽段的摩尔质量，m（g）是蜂蜜样品的质量。以达到对蜂蜜样品中MRJP2定量的目的。
对蜂农处采集的真实意蜂蜜样本的MRJP2的肽段进行匹配检测，结果整理为图结果见图4，从图4中可以看出在蜂蜜中，本发明筛选的MRJP2特征肽段IVNDDFNFDDVNFR和GDALIVYQNADDSFHR的响应最高，表明在不同参考样品中其含量相对稳定，由此可以体现其含量相对稳定，且适合作为定量意蜂蜜样本中可以作为定量蜂蜜样本中MRJP2的含量的肽段。
根据对蜂农处采集的真实蜂蜜样本中MRJP2的含量的定量结果整理为图的含量的定量结果见图5，从图5中可以看出在蜂蜜中MRJP2含量相对稳定，并且结果重复性好。
实施例2 定量意蜂MRJP2对意蜂蜜样品的真实性检测
1. 样品来源
从市场购买真实的蜂蜜样本
2. 实验步骤
（3）蜂蜜样本的前处理
①准确称取待测蜂蜜10 g至50 mL离心管中，加入10 mL 去离子水，涡旋至蜂蜜充分溶解。于12000 rpm，4℃条件下离心10 min。收集上清液于新的2 mL离心管中。
②移取蛋白质溶液200 μL并加入4 μL的100 μg/mL内标肽段（IVNNDFNFNDVNFR*），并与800 μL 40 mM NH4HCO3混合。向上述混合溶液中加入100 μL 30 mM DTT溶液，在室温反应60 min，然后再加入500 μL 100 mM IAA溶液在室温下暗反应60 min。
③每个样品中加入30 μL胰蛋白酶溶液，于37℃过夜酶切。当酶切反应完成时，加入1 μL FA以使胰蛋白酶失活。然后将酶切产物进行除盐，除盐后的样品进入质谱分析。
（4）蜂蜜样本的质谱分析
使用1290 Infinity液相色谱-6495三重四级杆质谱对蜂蜜样本进行检测。
（5）蜂蜜样本的数据处理
根据特征肽段/IS肽段峰面积比带入公式求得特征肽段浓度，再根据式（2）得到意蜂MRJP2蛋白的含量。
对从市场中购买的蜂蜜样本的MRJP2的肽段进行检测，结果整理为表结果见表1，从表1中可以看出，根据本发明筛选的MRJP2 特征肽段IVNDDFNFDDVNFR在质谱中检测的浓度，可以明显看出蜂蜜中MRJP2 的含量差异，对于掺假蜂蜜的样品中含量表现为异常或者含量为0。
通过UHPLC-Q Exactive plus提取的意蜂MRJP2的特征肽段及其同位素内标肽段的离子流图见图1。
通过UHPLC-Q Exactive plus检测的意蜂MRJP2的特征肽段及其同位素内标肽段的质谱图见图2。
通过UHPLC-Q Exactive plus检测的意蜂MRJP2的特征肽段及其同位素内标肽段的二级碎片质谱图见图3。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
表1 特征肽段IVNDDFNFDDVNFR在不同蜂蜜样品中的浓度
序列表
<110> 中国农业科学院蜜蜂研究所
<120> 液相色谱串联质谱定量意蜂蜜MRJP2的方法
<130> KHP191115400.2
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 14
<212> PRT
<213> 意大利蜂(Apis mellifera Ligustica Spinola)
<400> 1
Ile Val Asn Asp Asp Phe Asn Phe Asp Asp Val Asn Phe Arg
1 5 10
<210> 2
<211> 16
<212> PRT
<213> 意大利蜂(Apis mellifera Ligustica Spinola)
<400> 2
Gly Asp Ala Leu Ile Val Tyr Gln Asn Ala Asp Asp Ser Phe His Arg
1 5 10 15
<210> 3
<211> 452
<212> PRT
<213> 意大利蜂(Apis mellifera Ligustica Spinola)
<400> 3
Met Thr Arg Trp Leu Phe Met Val Ala Cys Leu Gly Ile Ala Cys Gln
1 5 10 15
Gly Ala Ile Val Arg Glu Asn Ser Pro Arg Asn Leu Glu Lys Ser Leu
20 25 30
Asn Val Ile His Glu Trp Lys Tyr Phe Asp Tyr Asp Phe Gly Ser Glu
35 40 45
Glu Arg Arg Gln Ala Ala Ile Gln Ser Gly Glu Tyr Asp His Thr Lys
50 55 60
Asn Tyr Pro Phe Asp Val Asp Gln Trp Arg Asp Lys Thr Phe Val Thr
65 70 75 80
Ile Leu Arg Tyr Asp Gly Val Pro Ser Thr Leu Asn Val Ile Ser Gly
85 90 95
Lys Thr Gly Lys Gly Gly Arg Leu Leu Lys Pro Tyr Pro Asp Trp Ser
100 105 110
Phe Ala Glu Phe Lys Asp Cys Ser Lys Ile Val Ser Ala Phe Lys Ile
115 120 125
Ala Ile Asp Lys Phe Asp Arg Leu Trp Val Leu Asp Ser Gly Leu Val
130 135 140
Asn Arg Thr Val Pro Val Cys Ala Pro Lys Leu His Val Phe Asp Leu
145 150 155 160
Lys Thr Ser Asn His Leu Lys Gln Ile Glu Ile Pro His Asp Ile Ala
165 170 175
Val Asn Ala Thr Thr Gly Lys Gly Gly Leu Val Ser Leu Ala Val Gln
180 185 190
Ala Ile Asp Leu Ala Asn Thr Leu Val Tyr Met Ala Asp His Lys Gly
195 200 205
Asp Ala Leu Ile Val Tyr Gln Asn Ala Asp Asp Ser Phe His Arg Leu
210 215 220
Thr Ser Asn Thr Phe Asp Tyr Asp Pro Arg Tyr Ala Lys Met Thr Ile
225 230 235 240
Asp Gly Glu Ser Phe Thr Leu Lys Asn Gly Ile Cys Gly Met Ala Leu
245 250 255
Ser Pro Val Thr Asn Asn Leu Tyr Tyr Ser Pro Leu Ala Ser His Gly
260 265 270
Leu Tyr Tyr Val Asn Thr Ala Pro Phe Met Lys Ser Gln Phe Gly Glu
275 280 285
Asn Asn Val Gln Tyr Gln Gly Ser Glu Asp Ile Leu Asn Thr Gln Ser
290 295 300
Leu Ala Lys Ala Val Ser Lys Asn Gly Val Leu Phe Val Gly Leu Val
305 310 315 320
Gly Asn Ser Ala Val Gly Cys Trp Asn Glu His Gln Ser Leu Gln Arg
325 330 335
Gln Asn Leu Glu Met Val Ala Gln Asn Asp Arg Thr Leu Gln Met Ile
340 345 350
Ala Gly Met Lys Ile Lys Glu Glu Leu Pro His Phe Val Gly Ser Asn
355 360 365
Lys Pro Val Lys Asp Glu Tyr Met Leu Val Leu Ser Asn Arg Met Gln
370 375 380
Lys Ile Val Asn Asp Asp Phe Asn Phe Asp Asp Val Asn Phe Arg Ile
385 390 395 400
Leu Gly Ala Asn Val Lys Glu Leu Ile Arg Asn Thr His Cys Val Asn
405 410 415
Asn Asn Gln Asn Asp Asn Ile Gln Asn Thr Asn Asn Gln Asn Asp Asn
420 425 430
Asn Gln Lys Asn Asn Lys Lys Asn Ala Asn Asn Gln Lys Asn Asn Asn
435 440 445
Gln Asn Asp Asn
450
序列表
<110> 中国农业科学院蜜蜂研究所
<120> 液相色谱串联质谱定量意蜂蜜MRJP2的方法
<130> KHP191115400.2
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 14
<212> PRT
<213> 意大利蜂(Apis mellifera Ligustica Spinola)
<400> 1
Ile Val Asn Asp Asp Phe Asn Phe Asp Asp Val Asn Phe Arg
1 5 10
<210> 2
<211> 16
<212> PRT
<213> 意大利蜂(Apis mellifera Ligustica Spinola)
<400> 2
Gly Asp Ala Leu Ile Val Tyr Gln Asn Ala Asp Asp Ser Phe His Arg
1 5 10 15
<210> 3
<211> 452
<212> PRT
<213> 意大利蜂(Apis mellifera Ligustica Spinola)
<400> 3
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1 5 10 15
Gly Ala Ile Val Arg Glu Asn Ser Pro Arg Asn Leu Glu Lys Ser Leu
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130 135 140
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435 440 445
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450

Claims (8)

1.液相色谱串联质谱定量意蜂蜜MRJP2的方法，其特征在于，所述方法包括质谱法检测意蜂蜜中MRJP2的特征肽段，含有以下特征肽段：
特征肽段1：IVNDDFNFDDVNFR；
特征肽段2：GDALIVYQNADDSFHR。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括对蜂蜜样品进行前处理的步骤，前处理使用的试剂包括：
(1)提取缓冲液：0.01 M PBS，pH7.4；
(2)胰蛋白酶液20 ng/μL，溶剂为40mM碳酸氢氨溶液；
(3)特征肽段1、2的标准品。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、配制含有固定浓度的稳定同位素内标肽段的不同浓度的特征肽段标准品溶液，进入质谱检测并绘制标准曲线；
B、待测蜂蜜样品的前处理：提取蜂蜜中的蛋白质，用胰蛋白酶液对样品蛋白进行酶切，对酶解产物除盐；
C、向待测样本中添加稳定同位素内标肽段使其浓度与步骤A中的浓度相同，采用相同方法进行液相色谱串联质谱检测；
D、对照标准曲线，获得待测样本中特征肽段的浓度，从而实现对MRJP2的定量检测。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤A和C中采用三重四级杆或Q Exactiveplus液质联用仪进行液相色谱串联质谱检测。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述特征肽段在质谱中所产生的检测信号的母离子具有865.39446的质荷比；子离子包含质荷比为1026.46125、1517.62597的子离子。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述稳定同位素内标肽段为：IVNDDFNFDDVNFR*，其中，R*表示精氨酸中的碳置换为13C6，氮置换为15N；
所述稳定同位素内标肽段在质谱中所产生的检测信号的母离子具有870.39862的质荷比；子离子包含质荷比为1036.47473、1527.63977的子离子。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤A得到的标准曲线为Y=0.007651X+0.01499，R2=0.9987，其中，Y为特征肽段/稳定同位素内标肽段的峰面积比，X为特征肽段的浓度。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，MRJP2的线性检测范围为10-1000 ng/mL，最低检出限为10 ng/mL。
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