CN109541060A - 一种通过蛋白质检测鉴别蜂蜜掺假的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种通过蛋白质检测鉴别蜂蜜掺假的方法，(1)检测样品中的MRJP1～MRJP5蛋白，计算获得样品中MRJP1～MRJP5蛋白的含量，分别记为m1～m5；同时测定样品的总糖含量，干重含量和总蛋白含量，分别记为M1，M2和M3；(2)将m1～m5中的一种或几种之和除以M1，M2或M3，然后乘以100％，所得比值与设定的阈值进行比较，若所得比值＜设定的阈值，则判定该样品为掺假产品。本发明不依赖于添加到蜂蜜中的外源物质，建立了基于蛋白组学的LC‑MS法针对蜂蜜主要的蛋白成分进行分析鉴别，从而通过对主要蛋白含量的检测然后计算分析，从而判断蜂蜜真伪，为鉴别蜂蜜是否掺假提供了一种新方法。

Description

一种通过蛋白质检测鉴别蜂蜜掺假的方法
技术领域
本发明涉及一种蜂蜜掺假的鉴别方法，特别涉及一种通过蛋白质检测鉴别蜂蜜掺假的方法。
背景技术
蜂蜜作为营养丰富的天然食品和保健品，深受全球消费者喜爱，但它却是一种极易掺假的食品，因此研究蜂蜜真伪检测技术长期深受关注。近年来，国内和国际市场对蜂蜜的需求量不断扩大，然而蜂蜜的产量难以满足市场的需求，且由于蜜源的不同，蜂蜜的种类繁多，成分复杂，使得蜂蜜品质的检测技术存在很大局限。在巨大经济利益的驱使下，很多不法分子在高品质蜂蜜中加入其它低品质的蜂蜜以次充好，或者在蜂蜜中掺入果葡糖浆等甜味物质以假乱真，极大的损害了蜂农、消费者和正规蜂蜜生产企业的利益，严重影响了蜂蜜产品的市场秩序和我国蜂蜜产品的出口贸易。蜂蜜品质检测技术遇到了很大的挑战。这些都给不法分子提供了蜂蜜掺假的可乘之机。
现有蜂蜜真伪检测技术主要是基于对外源性的掺入糖浆等物质进行检测的色谱技术、光谱技术和碳同位素技术等。虽然在一定程度上能够有效鉴别蜂蜜真伪，有利于蜂蜜质量控制，但常常落后于掺假技术，难以彻底杜绝蜂蜜掺假。因此很有必要研发主要针对蜂蜜内源性特有成分，而不是依赖外源添加物质的分析鉴别新技术。近年来，基于基因组学、蛋白组学和代谢组学的生物标志物研究应用在相关领域非常普遍，但尚未见基于相关组学技术应用蜂蜜真伪和花蜜鉴别的研究报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种通过蛋白质检测鉴别蜂蜜掺假的方法，不依赖于添加到蜂蜜中的外源物质，建立了基于蛋白组学的LC-MS法针对蜂蜜主要的蛋白成分进行分析鉴别，从而通过对主要蛋白含量的检测然后计算分析，从而判断蜂蜜真伪。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种通过蛋白质检测鉴别蜂蜜掺假的方法，包括以下步骤：
(1)定量检测样品中的MRJP1～MRJP5蛋白，获得样品中MRJP1～MRJP5蛋白的含量，分别记为m1～m5；同时测定样品的总糖含量、干重含量和总蛋白含量，分别记为M1，M2和M3；
(2)将m1～m5中的一种或几种之和除以M1、M2或M3，然后乘以100％，所得比值与设定的阈值进行比较，若所得比值＜设定的阈值，则判定该样品为掺假产品。反之，若所得比值≧设定的阈值，则判定该样品为真蜂蜜产品。
本发明有别于常规的以外源添加物质进行分析鉴别蜂蜜掺假的方法，从另一个角度蜂蜜内源性特有成分为出发点，开发一种新的鉴别蜂蜜掺假的方法。
作为优选方案，将m1除以M1，然后乘以100％，所得比值与设定的阈值进行比较，若所得比值＜设定的阈值，则判定该样品为掺假产品。
作为优选方案，设定的阈值为0.0167％。经过发明人的探索研究，开发了以MRJP1蛋白含量与总糖含量的比值与特定的阈值进行比较的数据分析模型，从而能够准确有效地鉴别蜂蜜是否掺假。
作为优选方案，将m1+m2+m3之和除以M2，然后乘以100％，所得比值与设定的阈值进行比较，若所得比值＜设定的阈值，则判定该样品为掺假产品。
作为优选方案，设定的阈值为0.0341％。经过发明人的探索研究，开发了以MRJP1、MRJP2、MRJP3三者蛋白含量之后与干重含量的比值与特定的阈值进行比较的数据分析模型，从而能够准确有效地鉴别蜂蜜是否掺假。
作为优选方案，采用液相色谱串联质谱对MRJP1～MRJP5蛋白进行定量检测。
作为优选方案，采用胰蛋白酶对样品进行酶解后，再上液相色谱串联质谱检测。
作为优选方案，液相色谱分离条件如下：使用C18色谱柱，A相为0.1％甲酸水溶液，B相为0.1％甲酸乙腈溶液；洗脱条件为B相0-9min从3％到30％，9-10min从30％到40％，10.1min升到100％保持到10.6min，10.7min回到3％保持到13min；流速为0.3mL/min。
作为优选方案，质谱检测条件如下：毛细管电压：3.0kv，锥孔电压：15V，脱溶剂温度：550℃，脱溶剂气流量：400L/min，锥孔反吹气流量：30L/hr，碰撞室压力：3.0×10-3mbar；低端分辨率1：2.5V，高端分辨率1：15.0V，离子能量1：0.6eV；低端分辨率2：2.0V，高端分辨率2：15.0V，离子能量2：2.0eV；离子源温度：150℃，提取器电压：5.0V，入口透镜电压：10V，出口电压：10V。
本发明的有益效果是：不依赖于添加到蜂蜜中的外源物质，建立了基于蛋白组学的LC-MS法针对蜂蜜主要的蛋白成分进行分析鉴别，从而通过对主要蛋白含量的检测然后计算分析，从而判断蜂蜜真伪，本发明为鉴别蜂蜜是否掺假提供了一种新方法。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。
本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
实施例1：蜂蜜真实性评价模型的建立
本实施例采集了30份巢蜜样品，涵盖多种产地、季节、等不同生产环境；对上述巢蜜的总蛋白含量、总糖含量、干物质重量和五种内源性蛋白(MRJP1～5)的含量进行检测，检测结果用于判定其它来源未知的蜂蜜进行真实性判定。
样品的检测方法如下：
1、总蛋白含量的测定(凯氏定氮法)((参考GB5009.5—2016)
精密称取5g巢蜜于消化管内，加入0.2g硫酸铜、6g硫酸钾和20mL硫酸，加热至410℃孵育至液体呈蓝绿色并澄清透明后，再继续加热0.5h～1h。待冷却后，将消化管放入蒸馏仪中，加入30mL氢氧化钠溶液(40g/L)，通入水蒸气进行蒸馏。用硼酸溶液(20g/L)吸收馏出物。用自动电位滴定仪、盐酸标准滴定液(0.0500mol/L)滴定至pH 5.1。
通过盐酸标准滴定液可以计算得该样品中的含氮量，以6.25作为凯氏定氮系数(氮换算为蛋白质的系数)，最终计算得该样品中总蛋白的含量。
总糖的测定(高效液相色谱法)(参考GB5009.8—2016)
预处理：称取混匀后的试样1g～2g(精确到0.001g)于50mL容量瓶,加水定容至50mL,充分摇匀,用干燥滤纸过滤,弃去初滤液,后续滤液用0.45μm微孔滤膜过滤或离心获取上清液过0.45μm微孔滤膜至样品瓶,供液相色谱分析。
色谱条件：流动相:乙腈+水＝70+30(体积比)；
流动相流速:1.0mL/min；
柱温:40℃；进样量:20μL；
示差折光检测器条件:温度40℃；
蒸发光散射检测器条件:飘移管温度:80℃～90℃；氮气压力:350kPa；撞击器:关。
标准曲线的制作：将糖标准使用液标准依次按上述推荐色谱条件上机测定，记录色谱图峰面积或峰高，以峰面积或峰高为纵坐标,以标准工作液的浓度为横坐标,示差折光检测器采用线性方程；蒸发光散射检测器采用幂函数方程绘制标准曲线。
试样溶液的测定：将试样溶液注入高效液相色谱仪中,记录峰面积或峰高,从标准曲线中查得试样溶液中糖的浓度(测出的各糖浓度之和作为总糖含量)。
干重的测定(阿贝折光计法)(参考SN/T 0852-2012)
将阿贝折光计与超级恒温器连接好，并将超级恒温器的温度调至所需的温度，完成折光计的校正。用玻璃棒沾取混匀的巢蜜样品1～2滴，滴于下面的棱镜上，迅速闭合棱镜，静置数秒钟，以待样品达到40°。对准光源，由目镜观察，转动补偿器螺旋，使明暗分界线清晰；转动标尺指针螺旋，使其明暗分界线恰好通过接物镜上十字线的交点，读取尺上的折光指数，同时核对温度，应恰好为40°。按公式计算结果。
五种主要内源性蛋白质的测定
预处理：称取样品0.4g加1ml水溶解。取40ul溶解液加入600ul碳酸氢铵缓冲液(50mM)中，再加入10ul DTT(100mM)，50℃水浴30min,加入30ul IAA(100mM)，290ul碳酸氢铵缓冲液(50mM)，暗处反应30min,再加入10ul胰蛋白酶(500ug/ml)，37℃水浴酶解2h，8h酶解完成后加入20ul 10％甲酸终止反应，送样。
液相色谱分离：参考条件如下：使用C18蛋白分析柱(1.7μm粒径,2.1mm×100mm，柱温40℃)。A相为0.1％甲酸水溶液，B相为0.1％甲酸乙腈溶液；洗脱条件为B相0-9min从3％到30％，9-10min从30％到40％，10.1min升到100％保持到10.6min，10.7min回到3％保持到13min。总洗脱时间为13min，流速为0.3mL/min。
质谱检测：参考条件如下：毛细管电压：3.0kv，锥孔电压：15V，脱溶剂温度：550℃，脱溶剂气流量：400L/min，锥孔反吹气流量：30L/hr，碰撞室压力：3.0×10-3mbar；低端分辨率1：2.5V，高端分辨率1：15.0V，离子能量1：0.6eV；低端分辨率2：2.0V，高端分辨率2：15.0V，离子能量2：2.0eV；离子源温度：150℃，提取器电压：5.0V，入口透镜电压：10V，出口电压：10V。
质谱多反应监测方法的参数参考条件如下表1所示。
表1质谱多反应监测方法的参数参考条件
注：L*为同位素标记[13C6,15N]-亮氨酸。
(4)标准曲线配制：配制五种主要MRJPS特异肽标准曲线，200、150、100、50、10mmol/L，取上述溶液各10μL，加入10μL内标溶液(含SLPIL*HEWK、IL*GANVK、L*LTFDLK、LFAFDLNTSQL*LK、IL*IGGVSDLLENTR100mmol/L)和980μL的0.1％甲酸溶液。
计算MRJPS含量：通过上述检测步骤和标准曲线，可获得样品酶解液中特异肽的摩尔浓度。在完全酶解的情况下，特异肽和对应蛋白的摩尔浓度相同。所以可以通过特异肽的摩尔浓度乘以对应蛋白质分子量计算得对应蛋白质的质量浓度)。
(5)真实性评判模型的选择：
计算MRJP1～5的任意一种或多种组合与总蛋白、总糖或干重的比值作为潜在的真实性评价模型(共93种组合模型)，以30份样品各组模型比值的平均RSD作为稳定性评价标准，挑选最优模型。结果从小到大如表2所示。
表2
选择表中稳定性最好(即内源性蛋白含量与蜂蜜中某固定成分比值最稳定)的组合模型MRJP1/总糖、MRJP1+2+3/干重作为蜂蜜真实性评价模型。
实施例2：基于MRJP1/总糖模型评判蜂蜜真实性
基于实施例1中的检测，结果见表3。
表3
项目 平均值(g/100g) 标准偏差(g/100g)
MRJP1 0.0141 0.000305
总糖 68.1 1.39
MRJP1/总糖(％) 0.0207％ 0.00135％
为了保证阈值能够覆盖所有的情况，故对采样样本MRJP1/总糖的平均值0.0207％减去3倍标准偏差，所获得的值0.0167％定义为判断蜂蜜掺假的最低阈值。
当某待检样品的MRJP1/总糖值低于0.0167％，则判定该待检品中掺入了糖浆类掺杂物。
为了验证本发明检测方法的正确性和预警能力，本实施采用向巢蜜中人工加入非法添加物的方式对本发明的检测方法进行验证。
真实蜂蜜检测
选择一份巢蜜，采用与实施例1相同的方法进行检测，检测结果见表4。
表4
项目 (g/100g)
MRJP1 0.0139
总糖 66.8
MRJP1/总糖(％) 0.0208％
由表4可见，本实施例选择的巢蜜中并无任何掺假物。
掺入大米糖浆
往巢蜜中掺入30％比例的大米糖浆，制作人工掺假样品。采用与实施例1相同的方法进行检测，检测结果见表5。
表5
项目 (g/100g)
MRJP1 0.00951
总糖 89.32
MRJP1/总糖(％) 0.0106％
。
如表5中所示，掺假巢蜜的MRJP1/总糖比值0.0106％＜阈值0.0167％，判断为掺假蜂蜜，这证明了本方法的准确性和预警能力。
实施例3：基于MRJP1+2+3/干重模型评判蜂蜜真实性
基于例1中的检测，结果见表6。
表6
如实施例2，为了保证阈值能够覆盖所有的情况，故对采样样MRJP1+2+3/干重的平均0.0424％减去3倍标准偏差，所获得的值0.0341％定义为判断蜂蜜掺假的最低阈值。
当某待检样品的MRJP1+2+3/干重值低于0.0341％，则判定该待检品中掺入了糖浆类掺杂物。
(1)真实蜂蜜检测
选择一份巢蜜，采用与实施例1相同的方法进行检测，检测结果见表7。
表7
项目 (g/100g)
MRJP1 0.0138
MRJP2 0.0152
MRJP3 0.00710
MRJP1+2+3 0.0361
干重 86.58
MRJP1+2+3/干重(％) 0.0417％
。
由表7可见，本实施例选择的巢蜜中并无任何掺假物。
(2)掺入大米糖浆
如例2，往巢蜜中掺入30％比例的大米糖浆，制作人工掺假样品。采用与实施例1相同的方法进行检测，检测结果见表8。
表8
如表8中所示，掺假巢蜜的MRJP1+2+3/干重值0.0293％＜阈值0.0341％，判断为掺假蜂蜜，这证明了本方法的准确性和预警能力。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。

Claims (9)

1.一种通过蛋白质检测鉴别蜂蜜掺假的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)定量检测样品中的MRJP1～MRJP5蛋白，获得样品中MRJP1～MRJP5蛋白的含量，分别记为m1～m5；同时测定样品的总糖含量、干重含量和总蛋白含量，分别记为M1，M2和M3；
(2)将m1～m5中的一种或几种之和除以M1、M2或M3，然后乘以100％，所得比值与设定的阈值进行比较，若所得比值＜设定的阈值，则判定该样品为掺假产品。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：将m1除以M1，然后乘以100％，所得比值与设定的阈值进行比较，若所得比值＜设定的阈值，则判定该样品为掺假产品。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：设定的阈值为0.0167％。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：将m1+m2+m3之和除以M2，然后乘以100％，所得比值与设定的阈值进行比较，若所得比值＜设定的阈值，则判定该样品为掺假产品。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：设定的阈值为0.0341％。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：采用液相色谱串联质谱对MRJP1～MRJP5蛋白进行定量检测。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：采用胰蛋白酶对样品进行酶解后，再上液相色谱串联质谱检测。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：液相色谱分离条件如下：使用C18色谱柱，A相为0.1％甲酸水溶液，B相为0.1％甲酸乙腈溶液；洗脱条件为B相0-9min从3％到30％，9-10min从30％到40％，10.1min升到100％保持到10.6min，10.7min回到3％保持到13min；流速为0.3mL/min。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：质谱检测条件如下：毛细管电压：3.0kv，锥孔电压：15V，脱溶剂温度：550℃，脱溶剂气流量：400L/min，锥孔反吹气流量：30L/hr，碰撞室压力：3.0×10-3mbar；低端分辨率1：2.5V，高端分辨率1：15.0V，离子能量1：0.6eV；低端分辨率2：2.0V，高端分辨率2：15.0V，离子能量2：2.0eV；离子源温度：150℃，提取器电压：5.0V，入口透镜电压：10V，出口电压：10V。
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