CN106855552B - 一种利用非靶标代谢组学技术鉴别蜂蜜品种的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种筛选用于鉴别蜂蜜品种的特征标志物的方法，该方法通过一个简单的样品前处理过程，随后通过超高效液相色谱‑四级杆/静电场轨道肼高分辨率质谱方法获得大量的高分辨质谱数据，利用背景扣除、色谱峰提取、归一化、数据转换和数据缩放移除实验数据中的偏差和变异的干扰，然后通过主成分分析、t‑检验、火山图和变量重要性投影图发现并确证可以区分蜂蜜品种的真实特征标志物。利用该特征标志物对蜂蜜品质进行鉴别，鉴别结果客观精准，该方法不仅用于蜂蜜品种的溯源鉴别，还可用于其他农产品的品种溯源和产地溯源鉴别。
Description
技术领域
本发明涉及蜂蜜品种鉴别技术领域，尤其涉及一种筛选用于鉴别蜂蜜品种的特征标志物的方法，还涉及利用该特征标志物进行蜂蜜品种鉴别的方法。尤其涉及一种筛选用于鉴别洋槐蜜和荔枝蜜的特征标志物的方法，以及鉴别洋槐蜜和荔枝蜜的方法。
背景技术
我国是世界养蜂大国，蜂群总数已达到910万群，蜂蜜年产量超过45万吨，是蜂蜜生产、消费和出口大国。现代科学研究证明，蜂蜜含有近200余种内源性成分，葡萄糖和果糖是其主要成分，其次是水分、蔗糖、矿物质、维生素、蛋白质和氨基酸等。近几年，消费者对蜂蜜的兴趣与日俱增，这主要是因为蜂蜜有益健康，比如抗菌、抗炎、抗突变、抗肿瘤、抗氧化活性。蜂蜜成分与其植物源和地理源密切相关，因为蜂蜜成分容易受到生产地区土壤和气候特性的影响。相比于杂花蜜，单一植物源和地理源的蜂蜜能够提供一种独特的口味和质量属性而具有更高的价值。在销售环节中，消费者也非常关注具有特定产地或蜜源真实标签的蜂蜜，因此蜂蜜的质量和价格取决于其植物源和地理源。所以，对不同产地、不同蜜源植物的蜂蜜进行鉴别对消费者具有重要意义。
已有的鉴别不同植物源和产地的蜂蜜技术包括孢粉学、指纹识别、化学统计分析和标记物识别。孢粉学主要通过显微镜观察花粉的大小、形状和颜色，但是这种方法非常难掌握并且容易得出不同的花粉具有相同的花粉特征这种错误的结果，这主要是由于该方法极易受检验人员主观因素影响而导致分析偏差。基于能够反映不同化学成分特征轮廓的色谱和指纹识别技术已经被认为是一种可靠的蜂蜜样品质量控制技术。但是获得可靠的指纹图谱比较困难，因为在不同的实验室和不同批次样品之间，实验条件难以完全重现，大量低含量化合物的基线、响应值和保留时间就会导致偏差。并且尽管指纹识别技术全面展示了样品信息，并没有对从数据中获得的信息进行深入挖掘。化学统计计量学在分析庞大的数据特别是复杂数据的大样本集，分析植物源和地理源，并建立可靠模型方面体现出巨大优势。但是，这种方法需要大量的样本建立一个可靠的模型，而确定样品真实性又依赖于所开发的模型，实际应用十分困难。
特征标记物可以简单方便地对蜂蜜进行溯源分类。现有的蜂蜜鉴别方法均基于在初步假设某一类化合物的基础上，将某一个目标代谢物在作为潜在的标志物。如基于多种仪器技术将酮类化合物、酚类化合物；碳水化合物、矿物质和微量元素、挥发性化合物、有机酸、氨基酸等内源性化合物，以及脱落酸、橙皮素、邻氨基苯甲酸甲酯和3-氨基苯乙酮等特殊化合物作为标记物，来确定蜂蜜的植物源和地理源。但是，蜂蜜是一种由蜜蜂生产的天然的并且组分极其复杂的产品，根据植物源和地理源不同而具有多种大量的内源性化合物。因此，根据原先主观假设的一类化合物寻找出某一种可靠的标志物鉴别其植物源和地理源是十分困难也不科学的。
然而采用非靶向比较代谢组学探索特定的标记物可以解决这个问题。非靶向代谢组学通过分析数据集中的全部信息尽可能多的获得一个复杂样品中的代谢产物。利用与库匹配的多元统计技术，非靶向代谢组学已经广泛应用通过来自分析不同条件下的不同样品的大量数据来确定标志物方面。核磁共振技术和高分辨质谱技术在非靶向代谢领域作为主要的技术手段，通过评估代谢水平的变化来反映基质本身的变化和环境影响。核磁共振的主要优势在于无损样品既可获得大量数据。最近，液相色谱或气相色谱于质谱联用在非靶向分析确定代谢物中得到广泛应用，因为该技术能够在前端的分离系统中将各种化学组分在复杂的混合物中分离出来，并在后端的质谱系统中获得准确的质量信息。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术存在的缺陷和不足，提供一种用于鉴别蜂蜜品种的方法。
为了实现上述目的，本发明的技术方案之一是：一种筛选用于鉴别蜂蜜品种的特征标志物的方法，包括如下步骤：
(1)取两种已知不同品种的蜂蜜样品，同一品种的若干蜂蜜样品为一组；以纯水为溶剂，分别对每组中的蜂蜜样品进行溶解，得多个标准样品，备用；
(2)取步骤(1)制备得到的所有标准样品，分别进行高效液相色谱-四级杆/静电场轨道肼高分辨率质谱分析，得到每个标准样品对应的质谱数据；对所有的质谱数据进行背景扣除、色谱峰提取和峰对齐，得到每个标准样品的总离子流色谱图，用于后续分析；
(3)采用t-test手段对每个标准样品的总离子流色谱图的质核比数据进行检测，取检测结果中P-Value＜0.05的组分进行分析，得潜在特征标志物；
(4)绘制每组样品的火山图进一步从步骤(3)中所述潜在特征标志物中筛选特征标志物；
(5)绘制每组样品的变量重要性投影图，取最大VIP值对应的物质即为可用于鉴别蜂蜜产地的特征标志物；绘图时，VIP值的设定以确保变量重要性投影图中显示的物质包括步骤(4)筛选得到的潜在特征标志物为准。
优选地，为了使得蜂蜜样品更具代表性，步骤(1)中，每组中的蜂蜜样品是通过如下方法得到的：从每个已知品种蜂蜜的主产区采集样品，每个主产区的样品数为20-40个，每个主产区的3-6个样品随机混合均匀即成为一个蜂蜜样品，取各个主产区所得的所述蜂蜜样品即成一组。
进一步优选地，本发明每组中的蜂蜜样品数量为3-8个，最优选为5个。
优选地，步骤(1)中，所述标准样品通过如下方法得到：按照1：5(g：mL)的固液比，分别向蜂蜜样品中加入纯水，涡旋混均，离心除去颗粒性杂质，取上清液，即得。
进一步优选地，所述离心条件为：采用8000-12000rpm转速离心8-12min。
本发明利用环境友好的纯水溶解蜂蜜，对环境无任何污染作用；此外无任何复杂的样品前处理过程，保证了化合物信息的完整性，减少由于前处理过程而导致的化合物信息丢失，进而导致潜在的特征标志物信息丢失。
优选地，步骤(2)中，所述高效液相色谱采用C18色谱柱，以0.05-0.15％的甲酸水溶液为流动A相，以0.05-0.15％的甲酸乙腈溶液为流动B相，按照体积比为(5～95):(95～5)的A和B的混合液为流动相进行梯度洗脱。本发明的流动相水相中加入甲酸，甲酸的存在为待测物提供酸性环境，可提高离子化效率。
进一步优选地，所述梯度洗脱为：0–2.0min,5％B；2.0–7.0min,5％–30％B；7.0–13.0min,30％–95％B；13.0–18.0min,95％B；18.0–18.1min,95％-5％B；18.1-20.0min,5％B。
优选地，所述四级杆/静电场轨道肼高分辨率质谱的条件选自如下条件①～⑩中的至少一个：
①HESI-II正模式和负模式的喷雾电压分别为3500v和3200v；
②鞘流气，辅助气和吹扫器压力分别为35arb,10arb和0arb；
③S-lens RF为50v；
④雾化器温度为350℃；
⑤离子传输管温度为320℃；
⑥全扫描质量轴范围为80–1200Da；
⑦一级质谱和二极质谱在m/z＝200处的分辨率分别为70000FWHM和17500FWHM；
⑧自动增益控制为106个电荷；
⑨最大进针时间为50毫秒；
⑩所有提取的质量数窗口设置为4.0ppm。
上述条件①～⑩中的各个参数为本发明较佳的参数设定，本领域技术人员可以理解，上述条件①～⑩中的各个参数均可在±10％范围内浮动，不会影响最终的测定结果。例如，具体应用时，HESI-II正模式的喷雾电压可在3150v～3850v范围内选取。
进一步优选地，所述四级杆/静电场轨道肼高分辨率质谱的条件包括上述①～⑩的全部。
本发明所使用的超高效液相色谱-四级杆/静电场轨道肼高分辨率质谱是以超高液相色谱作为分离系统，静电场轨道肼质谱作为检测系统，经简单处理后的样品在液相色谱和质谱部分经过分离和离子化，经由检测器得到质谱图。该质谱的一级质谱和二极质谱在m/z＝200处的分辨率分别为70000和17500，远远高于其他高分辨质谱，所以结合了超高液相色谱对复杂样品的高分离能力和高分辨质谱的高选择性，高灵敏度及能够提供相对分子量和结构信息的优点。
四级杆/静电场轨道肼高分辨率质谱仪在对特征标志物及其碎片结构解析过程中所有离子的偏差均小于1.0ppm，这是所有质谱都难以达到的高准确度，所以对化合物的结构信息解析的也更准确。
优选地，步骤(4)中，所述火山图以(log2 FC)为横坐标，(-log10 P-value)为纵坐标，并取FC>10且P-value<0.01的数值作图。
本发明首先利用t-test初步筛选出特征标志物，然后在这些特征标志物范围内利用火山图和VIP值分析差异显著的特征标志物，以多重手段保证特征标志物的真实性。尤其是，在采用变量重要性投影图分析时，设定的VIP值要求最终显示的化合物中应包含火山图分析中筛选得到的特征标志物，这样更具有统计学意义，结果更加精准。
优选地，所述方法还包括采用主成分分析方法对每组标准样品的总离子流色谱图的质核比数据进行分析以初步判断是否存在特征标志物的步骤；
若每组的数据聚集在各自的95％置信限椭圆图内，且两组数据能够完全分离，则初步判断两个产地的蜂蜜存在区分二者的特征标志物；
若每组的数据不能聚集在各自的95％置信限椭圆图内，和/或，两组数据不能够完全分离，则初步判断两个产地的蜂蜜不存在区分二者的特征标志物或很难筛选可以区分二者的特征标志物。
采用主成分分析法有助于快速判断不同品种的蜂蜜是否存在特征标志物，使得特征标志物的筛选更加快捷。
采用上述技术方案一的方法可实现不同品种蜂蜜的特征标志物的确定。其中，所述蜂蜜品种选自荔枝蜜、洋槐蜜、枣花蜜、槐花蜜等中的任意两种。特别地，本发明的方法适宜于筛选用于鉴别荔枝蜜和洋槐蜜的特征标志物。
本发明的技术方案之二是：上述任意一种筛选用于鉴别蜂蜜产地的特征标志物的方法在鉴别蜂蜜品种中的应用。
本发明所述的特征标志物的筛选方法是从大量的数据中筛查和识别标志物，特征标志物的确定更加客观精准，因此，采用该方法确定得到的特征标志物进行蜂蜜品种的鉴别也更加的准确。
本发明的技术方案之三是：一种鉴别蜂蜜品种的方法，该方法以香叶醛、脱落醛、刺桐碱中的至少一种作为鉴别荔枝蜜和洋槐蜜的特征标志物。
优选地，所述鉴别方法包括如下步骤：
(1)取未知品种的蜂蜜样品，向其中加入纯水，经涡旋、离心处理后，取上清液，得待测样品；
(2)采用高效液相色谱-四级杆/静电场轨道肼高分辨率质谱分析所述待测样品，得到质谱图；
(3)当所述质谱分析采用正模式，且所述质谱图中含有香叶醛的所有碎片离子峰时，判定所述待测样品为荔枝蜜；当所述质谱图中不含有或只含有部分香叶醛的碎片离子峰时，判定所述待测样品不是荔枝蜜；
当所述质谱分析采用负模式，且所述质谱图中含有脱落醛的所有碎片离子峰时，判定所述待测样品为荔枝蜜；当所述质谱图中不含有或只含有部分香叶醛的碎片离子峰时，判定所述待测样品不是荔枝蜜；
当所述质谱分析采用正模式，且所述质谱图中含有刺桐碱的所有碎片离子峰时，判定所述待测样品为洋槐蜜；当所述质谱图中不含有或只含有部分刺桐碱的碎片离子峰时，判定所述待测样品不是洋槐蜜；
其中，所述香叶醛的碎片离子峰为：136.11682±1ppm，107.08544±1ppm，93.06981±1ppm，71.004915±1ppm；
所述脱落醛的碎片离子峰为：229.12340±1ppm，125.0608±1ppm，149.0608±1ppm，164.06428±1ppm；
所述刺桐碱的碎片离子峰为：188.0706±1ppm，170.06004±1ppm，146.06004±1ppm，118.06513±1ppm，91.05423±1ppm，60.08078±1ppm。
优选地，所述待测样品采用如下方法制备：取未知品种的蜂蜜样品，按照1：5(g：mL)的固液比，分别向蜂蜜样品中加入纯水，涡旋混均，离心除去颗粒性杂质，取上清液，即得。
在一种具体的实施方式中，所述待测样品的制备方法为：称取未知品种的蜂蜜样品1.0±0.1g置于10mL具塞离心管中，加入5mL纯水，涡旋5min混匀，10000rpm离心10min沉淀颗粒杂质，取上清液，即得。
优选地，所述高效液相色谱采用C18色谱柱，以0.05-0.15％的甲酸水溶液为流动A相，以0.05-0.15％的甲酸乙腈溶液为流动B相，按照体积比为(5～95):(95～5)的A和B的混合液为流动相进行梯度洗脱。
进一步优选地，所述梯度洗脱为：0-2.0min,5％B；2.0-7.0min,5％-30％B；7.0-13.0min,30％-95％B；13.0-18.0min,95％B；18.0-18.1min,95％-5％B；18.1-20.0min,5％B。
其中，柱温、流速和进样量可采用本领域常规技术手段，例如柱温可设定为35-45℃，流速可设定为0.2-0.4mL/min，进样量可设定为4-6μL。
在一种具体的实施方式中，所述高效液相色谱的条件为：
流动相：0.1％的甲酸水和0.1％的甲酸乙腈溶液；
洗脱条件：0-2.0min,5％B；2.0-7.0min,5％-30％B；7.0-13.0min,30％-95％B；13.0-18.0min,95％B；18.0-18.1min,95％-5％B；18.1-20.0min,5％B；
色谱柱：Thermo Scientific Hypersil GOLD C-18column(2.1mm×100mm,1.9μm)色谱柱；
柱温为40℃；流速为0.3mL/min；进样量为5.0μL。
优选地，所述四级杆/静电场轨道肼高分辨率质谱的条件选自如下条件①～⑩中的至少一个：
①HESI-II正模式和负模式的喷雾电压分别为3500v和3200v；
②鞘流气，辅助气和吹扫器压力分别为35arb,10arb和0arb；
③S-lens RF为50v；
④雾化器温度为350℃；
⑤离子传输管温度为320℃；
⑥全扫描质量轴范围为80–1200Da；
⑦一级质谱和二极质谱在m/z＝200处的分辨率分别为70000FWHM和17500FWHM；
⑧自动增益控制为106个电荷；
⑨最大进针时间为50毫秒；
⑩所有提取的质量数窗口设置为4.0ppm。
上述条件①～⑩中的各个参数为本发明较佳的参数设定，本领域技术人员可以理解，上述条件①～⑩中的各个参数均可在±10％范围内浮动，不会影响最终的测定结果。例如，具体应用时，HESI-II正模式的喷雾电压可在3150v～3850v范围内选取。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，即得本发明各较佳实例。
本发明涉及到的原料和试剂均可市购获得。
本发明取得了如下积极效果：
(1)该特征标志物的筛选方法的优点是简单，快速，准确，稳定，并且是首次以基于轨道肼质谱技术的非靶标代谢组学技术应用于蜂蜜的品种鉴别；
(2)本发明所述的方法对于加强蜂蜜品种鉴别的研究，探索蜂蜜溯源信息，提高我国蜂蜜质量，保证消费者的健康等具有重要的意义。
附图说明
图1是利用SIEVE软件对荔枝蜜和洋槐蜜两组蜂蜜样品的数据进行背景扣除、色谱峰提取和峰对齐的图；
图2是荔枝蜜和洋槐蜜的TIC和PCA图(A：荔枝蜜的TIC图；B：洋槐蜜的TIC图；C：正模式下荔枝蜜和洋槐蜜的PCA图；D：负模式下荔枝蜜和洋槐蜜的PCA图)；
图3是荔枝蜜和洋槐蜜的火山图和VIP图(A：正模式下荔枝蜜和洋槐蜜的火山图；B：负模式下荔枝蜜和洋槐蜜的火山图；C：正模式荔枝蜜和洋槐蜜VIP>1.65图谱；D：负模式下荔枝蜜和洋槐蜜VIP>1.65图谱；其中VIP图谱中A代表洋槐蜜；L代表荔枝蜜)
图4是特征标志物香叶醛的结构鉴定图；
图5是特征标志物脱落醛的结构鉴定图；
图6是特征标志物刺桐碱的结构鉴定图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中涉及的操作如无特殊说明，均为本领域常规技术操作。
实施例1
一种筛选用于鉴别蜂蜜品种的特征标志物的方法，所述品种为荔枝蜜和洋槐蜜，所述方法包括如下步骤：
(1)从我国荔枝蜂蜜主产区云南、海南、福建、广东和广西以及杨槐蜂蜜主产区辽宁和陕西共采集210个蜂蜜样品。其中，云南省28个样品、海南省29个样品、福建省29个样品、广东省33个样品、广西壮族自治区31个样品、辽宁省27个样品、陕西省33个样品。样品贮藏在20℃通风良好避光的样品贮藏室内。为了提高蜂蜜样品的代表性，每个主产区的3-6个样品均匀混合成一个蜂蜜样品，最终使每个主产区的蜂蜜样品为5个，每个品种各个主产区的蜂蜜样品为一组，共两组；
(2)称取每个蜂蜜样品每份1.0±0.1g置于10mL具塞离心管中，加入5mL纯水，涡旋5min混匀，10000rpm离心10分钟沉淀颗粒杂质，取上清液，即为标准样品，备用；
(3)取步骤(2)制备得到的所有标准样品，分别进行高效液相色谱-四级杆/静电场轨道肼高分辨率质谱分析，具体分析条件为：
高效液相色谱：
流动相：0.1％的甲酸水和0.1％的甲酸乙腈溶液；
洗脱条件：0-2.0min,5％B；2.0-7.0min,5％–30％B；7.0-13.0min,30％-95％B；13.0-18.0min,95％B；18.0-18.1min,95％-5％B；18.1-20.0min,5％B；
色谱柱：Thermo Scientific Hypersil GOLD C-18column(2.1mm×100mm,1.9μm)色谱柱；
柱温为40℃；流速为0.3mL/min；进样量为5.0μL；
质谱条件：
HESI-II喷雾电压分别为3500v(正模式)和3200v(负模式)；鞘流气,辅助气和吹扫器压力分别为35arb,10arb,和0arb；S-lens RF为50v；雾化器温度350℃；离子传输管温度320℃.全扫描质量轴范围为80–1200Da。一级质谱和二极质谱在m/z＝200处的分辨率分别为70000FWHM和17500FWHM。自动增益控制为106个电荷，最大进针时间为50毫秒。所有提取的质量数窗口设置为4.0ppm。
(3)采用超高效液相色谱-四级杆/静电场轨道肼高分辨率质谱仪器自带SIEVE软件对荔枝蜜和洋槐蜜两组蜂蜜样品的数据进行背景扣除、色谱峰提取和峰对齐(参考图1)，得到总离子流色谱图(参考图2中的A图和B图)。根据总离子流色谱图(TIC)图谱可知，荔枝蜜和洋槐蜜主要差异的色谱峰集中于2-12分钟范围内，因此这一部分数据用于后续的数据处理。
(4)利用主成分分析(PCA)对各个蜂蜜样品的总离子流色谱图数据进行分析，结果显示(参考图2中的C图和D图)：荔枝蜜和洋槐蜜可以得到完全的分离，也证实了荔枝蜜和洋槐蜜引起了蜂蜜中明显的代谢物变化。
(5)荔枝蜜和洋槐蜜相比，第一步：对t-test中P-Value＜0.05具有显著差异组分进行分析，共获得了30个潜在的特征标志物，其中23个为正模式下获得，7个为负模式下获得；第二步：以(log2 FC)为横坐标，(-log10 P-value)为纵坐标，并取FC>10且P-value<0.01的数值绘制每组样品中各个代谢产物的火山图进一步筛查代谢物；第三步：通过设定变量重要性投影图中VIP>1.65对代谢物进行排序(参考图3)，结果显示：正、负模式下VIP值最大的分别为香叶醛和脱落醛，即，香叶醛和脱落醛可分别作为正模式和负模式下荔枝蜜区别洋槐蜜的特征标志物。香叶醛的结构鉴定参考图4，脱落醛的结构简单参考图5。
(6)洋槐蜜和荔枝蜜相比，第一步：对t-test中P-Value＜0.05具有显著差异组分进行分析，共获得了6个潜在的特征标志物，均为正模式下获得；第二步：以(log2 FC)为横坐标，(-log10 P-value)为纵坐标，并取FC>10且P-value<0.01的数值绘制每组样品中各个代谢产物的火山图进一步筛查代谢物；第三步：通过设定变量重要性投影图中VIP>1.65对代谢物进行排序，结果显示：正模式下VIP值最大的为刺桐碱，即刺桐碱可作为正模式下洋槐蜜区别荔枝蜜的特征标志物。(刺桐碱的结构鉴定参考图6)
实施例2
一种筛选用于鉴别蜂蜜品种的特征标志物的方法，所述品种为荔枝蜜和洋槐蜜，具体方法同实施例1，区别仅在于标准样品的制备不同，分析条件不同，该实施例的条件如下所示：
(1)称取蜂蜜每份2.0±0.1g置于10mL具塞离心管中，加入8mL纯水，涡旋5min混匀，8000rpm离心8分钟沉淀颗粒性杂质，取上清液，即得；
(2)高效液相色谱
流动相：0.2％的甲酸水和0.2％的甲酸乙腈溶液；
洗脱条件：0–2.0min,5％B；2.0–7.0min,5％–30％B；7.0–13.0min,30％–95％B；13.0–18.0min,95％B；18.0–18.1min,95％-5％B；18.1-20.0min,5％B；
色谱柱：Thermo Scientific Hypersil GOLD C-18column(2.1mm×100mm,1.9μm)色谱柱；
柱温为30℃；流速为0.3mL/min；进样量为3.0μL；
质谱条件：
HESI-II喷雾电压分别为3500v(正模式)和3200v(负模式)；鞘流气,辅助气和吹扫器压力分别为35arb,10arb,和0arb；S-lens RF为50v；雾化器温度350℃；离子传输管温度320℃.全扫描质量轴范围为80–1200Da。一级质谱和二极质谱在m/z＝200处的分辨率分别为70000和17500。自动增益控制为106个电荷，最大进针时间为50毫秒。所有提取的质量数窗口设置为4.0ppm。
该实施例结果显示：香叶醛和脱落醛可分别作为正模式和负模式下荔枝蜜区别洋槐蜜的特征标志物，刺桐碱可分别作为正模式下洋槐蜜区别荔枝蜜的特征标志物。
实施例3
一种筛选用于鉴别蜂蜜品种的特征标志物的方法，所述品种为荔枝蜜和洋槐蜜，具体方法同实施例1，区别仅在于标准样品的制备不同，分析条件不同，该实施例的条件如下所示：
(1)称取蜂蜜每份3.0±0.1g置于10mL具塞离心管中，加入10mL纯水，涡旋10min混匀，10000rpm离心7分钟沉淀颗粒性杂质，取上清液，即得；
(2)高效液相色谱
流动相：0.05％的甲酸水和0.05％的甲酸乙腈溶液；
洗脱条件：0–2.0min,5％B；2.0–7.0min,5％–30％B；7.0–13.0min,30％–95％B；13.0–18.0min,95％B；18.0–18.1min,95％-5％B；18.1-20.0min,5％B；
色谱柱：Thermo Scientific Hypersil GOLD C-18column(2.1mm×100mm,1.9μm)色谱柱；
柱温为30℃；流速为0.2mL/min；进样量为2.0μL；
质谱条件：
HESI-II喷雾电压分别为3500v(正模式)和3200v(负模式)；鞘流气,辅助气和吹扫器压力分别为35arb,10arb,和0arb；S-lens RF为50v；雾化器温度350℃；离子传输管温度320℃.全扫描质量轴范围为80–1000Da。一级质谱和二极质谱在m/z＝200处的分辨率分别为70000和17500。自动增益控制为106个电荷，最大进针时间为50毫秒。所有提取的质量数窗口设置为4.0ppm。
该实施例结果显示：香叶醛和脱落醛可分别作为正模式和负模式下荔枝蜜区别洋槐蜜的特征标志物。刺桐碱可作为正模式下洋槐蜜区别荔枝蜜的特征标志物。
实施例4
一种鉴别蜂蜜品种的方法，包括如下步骤：
(1)从市场购买荔枝蜜，称取该产品1.0±0.1g置于10mL具塞离心管中，加入5mL纯水，涡旋5min混匀，10000rpm离心10分钟沉淀颗粒杂质，取上清液，得待测样品；
(2)取步骤(1)制备得到的样品，进行高效液相色谱-四级杆/静电场轨道肼高分辨率质谱分析，分析条件为：
高效液相色谱：
流动相：0.1％的甲酸水和0.1％的甲酸乙腈溶液；
洗脱条件：0-2.0min,5％B；2.0-7.0min,5％–30％B；7.0-13.0min,30％-95％B；13.0-18.0min,95％B；18.0-18.1min,95％-5％B；18.1-20.0min,5％B；
色谱柱：Thermo Scientific Hypersil GOLD C-18column(2.1mm×100mm,1.9μm)色谱柱；
柱温为40℃；流速为0.3mL/min；进样量为5.0μL；
质谱条件：
HESI-II喷雾电压分别为3500v(正模式)和3200v(负模式)；鞘流气,辅助气和吹扫器压力分别为35arb,10arb,和0arb；S-lens RF为50v；雾化器温度350℃；离子传输管温度320℃.全扫描质量轴范围为80–1200Da。一级质谱和二极质谱在m/z＝200处的分辨率分别为70000FWHM和17500FWHM。自动增益控制为106个电荷，最大进针时间为50毫秒。所有提取的质量数窗口设置为4.0ppm，得到高分辨质谱图；
(3)采用超高效液相色谱-四级杆/静电场轨道肼高分辨率质谱仪器自带SIEVE软件提取特征标志物的质谱信息；
(4)结果显示，该待测样品的质谱图中含有特征标志物香叶醛和脱落醛的所有碎片离子，判断该产品确为荔枝蜜。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (4)
1.一种蜂蜜品种的鉴别方法，其特征在于：以香叶醛、脱落醛、刺桐碱中的至少一种作为鉴别荔枝蜜和洋槐蜜的特征标志物。
2.根据权利要求1所述的鉴别方法，其特征在于，所述鉴别方法包括如下步骤：
(1)取未知品种的蜂蜜样品，向其中加入纯水，经涡旋、离心处理后，取上清液，得待测样品；
(2)采用高效液相色谱-四级杆/静电场轨道肼高分辨率质谱分析所述待测样品，得到质谱图；
(3)当所述质谱分析采用正模式，且所述质谱图中含有香叶醛的所有碎片离子峰时，判定所述待测样品为荔枝蜜；当所述质谱图中不含有或只含有部分香叶醛的碎片离子峰时，判定所述待测样品不是荔枝蜜；
当所述质谱分析采用负模式，且所述质谱图中含有脱落醛的所有碎片离子峰时，判定所述待测样品为荔枝蜜；当所述质谱图中不含有或只含有部分香叶醛的碎片离子峰时，判定所述待测样品不是荔枝蜜；
当所述质谱分析采用正模式，且所述质谱图中含有刺桐碱的所有碎片离子峰时，判定所述待测样品为洋槐蜜；当所述质谱图中不含有或只含有部分刺桐碱的碎片离子峰时，判定所述待测样品不是洋槐蜜；
其中，所述香叶醛的碎片离子峰为：136.11682±1ppm，107.08544±1ppm，93.06981±1ppm，71.004915±1ppm；
所述脱落醛的碎片离子峰为：229.12340±1ppm，125.0608±1ppm，149.0608±1ppm，164.06428±1ppm；
所述刺桐碱的碎片离子峰为：188.0706±1ppm，170.06004±1ppm，146.06004±1ppm，118.06513±1ppm，91.05423±1ppm，60.08078±1ppm。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述高效液相色谱-四级杆/静电场轨道肼高分辨率质谱的条件选自如下条件①～⑩中的至少一个：
①HESI-II正模式和负模式的喷雾电压分别为3500v和3200v；
②鞘流气，辅助气和吹扫器压力分别为35arb,10arb和0arb；
③S-lens RF为50v；
④雾化器温度为350℃；
⑤离子传输管温度为320℃；
⑥全扫描质量轴范围为80–1200Da；
⑦一级质谱和二极质谱在m/z＝200处的分辨率分别为70000FWHM和17500FWHM；
⑧自动增益控制为106个电荷；
⑨最大进针时间为50毫秒；
⑩所有提取的质量数窗口设置为4.0ppm。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述条件①～⑩中的各个参数数值可在±10％范围内浮动。
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