CN106908527B

CN106908527B - 一种鉴别荔枝蜜产地的方法

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Publication number: CN106908527B
Application number: CN201710058956.0A
Authority: CN
Inventors: 周金慧; 李熠; 问亚琴; 张文文; 陈兰珍; 张金振; 金玥; 赵文
Original assignee: Institute of Apicultural Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Apicultural Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2017-01-23
Filing date: 2017-01-23
Publication date: 2019-08-20
Anticipated expiration: 2037-01-23
Also published as: CN106908527A

Abstract

本发明涉及一种鉴别荔枝蜜产地的方法，该方法可实现对我国海南、云南、福建、广东和广西五大主产区的荔枝蜜鉴别。该方法以3,4‑二甲氧基肉桂酸、脱落酸、α‑姜黄烯、苹果酸中的至少一种作为鉴别海南、云南荔枝蜜的特征标志物；以β‑环柠檬醛、脱落酸、羟基肉桂酸、苹果酸中的至少一种作为鉴别海南、云南荔枝蜜的特征标志物；以木樨草素、羟基肉桂酸、苹果酸中的至少一种作为鉴别广东、云南荔枝蜜的特征标志物；以脱落酸、羟基肉桂酸、苹果酸中的至少一种作为鉴别广西、云南荔枝蜜的特征标志物；上述各个特征标志物均是通过非靶标技术确定得到的，因此，利用该特征标志物对不同产地的蜂蜜进行鉴别，结果更加精准。

Description

一种鉴别荔枝蜜产地的方法

技术领域

本发明涉及蜂蜜产地鉴别技术领域，尤其涉及一种鉴别荔枝蜜产地的方法。

背景技术

我国是世界养蜂大国，蜂群总数已达到910万群，蜂蜜年产量超过45万吨，是蜂蜜生产、消费和出口大国。现代科学研究证明，蜂蜜含有百余种内源性成分，葡萄糖和果糖是其主要成分，占总成分超过70％，其次是水分、蔗糖、矿物质、维生素、蛋白质、氨基酸等。近几年，由于其具有抗菌、抗炎、抗突变、抗肿瘤、抗氧化等活性，消费者对蜂蜜的兴趣与日俱增。蜂蜜成分与其植物源和地理源密切相关，因为蜂蜜成分容易受到生产地区土壤和气候特性的影响。相比于杂花蜜，单一植物源和地理源的蜂蜜能够提供一种独特的风味和质量属性而具有更高的价值。在销售环节中，蜂蜜的质量和价格取决于其植物源和地理源，消费者也非常关注具有特定产地或蜜源真实标签的蜂蜜。因此，对不同产地、不同蜜源植物的蜂蜜进行鉴别对消费者具有重要意义。

已有的鉴别不同植物源和产地的蜂蜜技术包括孢粉学、指纹识别、化学统计分析和标记物识别。孢粉学主要通过显微镜观察花粉的大小、形状和颜色，但是这种方法非常难掌握并且容易得出不同的花粉具有相同的花粉特征这种错误的结果，这主要是由于该方法极易受检验人员主观因素影响而导致分析偏差。基于能够反映不同化学成分特征轮廓的色谱和指纹识别技术已经被认为是一种可靠的蜂蜜样品质量控制技术。但是获得可靠的指纹图谱比较困难，因为在不同的实验室和不同批次样品之间，实验条件难以完全重现，大量低含量化合物的基线、响应值和保留时间就会导致偏差。并且尽管指纹识别技术全面展示了样品信息，并没有对从数据中获得的信息进行深入挖掘。化学统计计量学在分析庞大的数据特别是复杂数据的大样本集，分析植物源和地理源，并建立可靠模型方面体现出巨大优势。但是，这种方法需要大量的样本建立一个可靠的模型，而确定样品真实性又依赖于所开发的模型，实际应用十分困难。

特征标记物可以简单方便地对蜂蜜进行溯源分类。现有的蜂蜜鉴别方法均基于在初步假设某一类化合物的基础上，将某一个目标代谢物在作为潜在的标志物。如基于多种仪器技术将酮类化合物、酚类化合物；碳水化合物、矿物质和微量元素、挥发性化合物、有机酸、氨基酸等内源性化合物，以及脱落酸、橙皮素、邻氨基苯甲酸甲酯和3-氨基苯乙酮等特殊化合物作为标记物，来确定蜂蜜的植物源和地理源。但是，蜂蜜是一种由蜜蜂生产的天然的并且组分极其复杂的产品，根据植物源和地理源不同而具有多种大量的内源性化合物。因此，根据原先主观假设的一类化合物寻找出某一种可靠的标志物鉴别其植物源和地理源是十分困难也不科学的。

然而采用非靶向比较代谢组学探索特定的标记物可以解决这个问题。非靶向代谢组学通过分析数据集中的全部信息尽可能多的获得一个复杂样品中的代谢产物。利用与库匹配的多元统计技术，非靶向代谢组学已经广泛应用通过来自分析不同条件下的不同样品的大量数据来确定标志物方面。核磁共振技术和高分辨质谱技术在非靶向代谢领域作为主要的技术手段，通过评估代谢水平的变化来反映基质本身的变化和环境影响。核磁共振的主要优势在于无损样品既可获得大量数据。最近，液相色谱或气相色谱于质谱联用在非靶向分析确定代谢物中得到广泛应用，因为该技术能够在前端的分离系统中将各种化学组分在复杂的混合物中分离出来，并在后端的质谱系统中获得准确的质量信息。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术存在的缺陷和不足，提供一种鉴别荔枝蜜产地的方法。该方法可实现对我国荔枝蜜5大主产区(海南、云南、福建、广东和广西)荔枝蜜的鉴别。

为了实现上述目的，本发明的技术方案之一是，一种鉴别荔枝蜜产地的方法，以3,4-二甲氧基肉酸酸、脱落酸、α-姜黄烯、苹果酸中的一种或多种作为鉴别海南荔枝蜜和云南荔枝蜜的特征标志物；

以β-环柠檬醛、脱落酸、羟基肉桂酸、苹果酸中的一种或多种作为鉴别海南荔枝蜜和云南荔枝蜜的特征标志物；

以木樨草素、羟基肉桂酸、苹果酸中的一种或多种作为鉴别广东荔枝蜜和云南荔枝蜜的特征标志物；

以脱落酸、羟基肉桂酸、苹果酸中的一种或多种作为鉴别广西荔枝蜜和云南荔枝蜜的特征标志物。

优选地，所述方法采用高效液相色谱-四级杆/静电场轨道肼高分辨率质谱对待测样品进行分析。

进一步优选地，鉴别方法具体为：

(1)鉴别海南荔枝蜜和云南荔枝蜜时，当正模式质谱图中含有3,4-二甲氧基肉桂酸的所有碎片离子峰，和/或，负模式质谱图中含有脱落酸的所有碎片离子峰时，判定所述待测样品是海南荔枝蜜；当所述正模式质谱图中不含有或只含有部分3,4-二甲氧基肉桂酸的碎片离子峰，和/或，所述负模式质谱图中不含有或只含有部分脱落酸的碎片离子峰时，判定所述待测样品不是海南荔枝蜜；

当正模式质谱图中含有α-姜黄烯的所有碎片离子峰，和/或，负模式质谱图中含有苹果酸的所有碎片离子峰时，判定所述待测样品为云南荔枝蜜；当所述正模式质谱图中不含有或只含有部分α-姜黄烯的碎片离子峰，和/或，所述负模式质谱图中不含有或只含有部分苹果酸的碎片离子峰时，判定所述待测样品不是云南荔枝蜜；

(2)鉴别福建荔枝蜜和云南荔枝蜜时，当正模式质谱图中含有β-环柠檬醛的所有碎片离子峰，和/或，负模式质谱图中含有脱落酸的所有碎片离子峰时，判定所述待测样品是福建荔枝蜜；当所述正模式质谱图中不含有或只含有部分β-环柠檬醛的碎片离子峰，和/或，当所述负模式质谱图中不含有或只含有部分脱落酸的碎片离子峰时，判定所述待测样品不是福建荔枝蜜；

当正模式质谱图中含有羟基肉桂酸的所有碎片离子峰，和/或，负模式质谱图中含有苹果酸的所有碎片离子峰时，判定所述待测样品为云南荔枝蜜；当所述正模式质谱图中不含有或只含有部分羟基肉桂酸的碎片离子峰，和/或，所述负模式质谱图中不含有或只含有部分苹果酸的碎片离子峰时，判定所述待测样品不是云南荔枝蜜；

(3)鉴别广东荔枝蜜和云南荔枝蜜时，当正模式质谱图中含有木樨草素的所有碎片离子峰时，判定所述待测样品为广东荔枝蜜；当所述正模式质谱图中不含有或只含有部分木樨草素的碎片离子峰时，判定所述待测样品不是广东荔枝蜜；

当正模式质谱图中含有羟基肉桂酸的所有碎片离子峰，和/或，负模式质谱图中含有苹果酸的所有碎片离子峰时，判定所述待测样品是云南荔枝蜜；当所述正模式质谱图中不含有或只含有部分羟基肉桂酸的碎片离子峰，和/或，所述负模式质谱图中不含有或只含有部分苹果酸的碎片离子峰时，判定所述待测样品不是云南荔枝蜜；

(4)鉴别广西荔枝蜜和云南荔枝蜜时，当负模式质谱图中含有脱落酸的所有碎片离子峰时，判定所述待测样品是广西荔枝蜜；当所述负模式质谱图中不含有或只含有部分脱落酸的碎片离子峰时，判定所述待测样品不是广西荔枝蜜；

当正模式质谱图中含有羟基肉桂酸的所有碎片离子峰，和/或，负模式质谱图中含有苹果酸的所有碎片离子峰时，判定所述待测样品为云南荔枝蜜；当所述正模式质谱图中不含有或只含有部分羟基肉桂酸的碎片离子峰，和/或，负模式质谱图中不含有或只含有部分苹果酸的碎片离子峰时，判定所述待测样品不是云南荔枝蜜。

其中，所述“正模式质谱图”指的是质谱的离子化模式为ESI﹢时对应的质谱图；所述“负模式质谱图”指的是质谱的离子化模式为ESI﹣时对应的质谱图。

其中，3,4-二甲氧基肉桂酸的碎片离子峰为：163.07536±1ppm，135.08044±1ppm，121.06479±1ppm，95.04914±1ppm，91.05423±1ppm，208.07356±1ppm；

脱落酸的碎片离子峰为：247.13287±1ppm，209.08084±1ppm，205.12231±1ppm，181.08592±1ppm，163.07536±1ppm，153.09101±1ppm，135.08044±1ppm，121.06479±1ppm，107.08553±1ppm，79.05423±1ppm；

α-姜黄烯的碎片离子峰为：91.05423±1ppm，119.08553±1ppm，147.11683±1ppm；

苹果酸的碎片离子峰为：71.01385±1ppm，72.99312±1ppm，89.02442±1ppm，115.00368±1ppm；

β-环柠檬醛的碎片离子峰为：71.04914±1ppm，81.06988±1ppm，93.06988±1ppm，107.08553±1ppm，135.11683±1ppm；

羟基肉桂酸的碎片离子峰为：147.04466±1ppm，123.04406±1ppm，119.04914±1ppm，95.04914±1ppm，91.05423±1ppm；

木樨草素的碎片离子峰为：241.04954±1ppm，213.05462±1ppm，153.01824±1ppm，121.02841±1ppm。

优选地，为了确保鉴别结果的精准度，所述待测样品采用如下方法处理后再进行分析：取待测样品，向其中加入纯水，涡旋混均，离心除去颗粒性杂质，取上清液，即得。进一步优选采用如下处理方法：按照1:5(g：mL)的固液比向待测样品中加入纯水，涡旋3-8min后，于8000-12000rpm转速下离心8-12min，取上清液，即得。

本发明利用环境友好的纯水溶解蜂蜜，对环境无任何污染作用；此外无任何复杂的样品前处理过程，保证了化合物信息的完整性，减少由于前处理过程而导致的化合物信息丢失，进而导致潜在的特征标志物信息丢失。

优选地，所述高效液相色谱采用C18色谱柱，以0.05-0.15％的甲酸水溶液为流动A相，以0.05-0.15％的甲酸乙腈溶液为流动B相，按照体积比为(5～95):(95～5)的A和B的混合液为流动相进行梯度洗脱。

本发明的流动相水相中加入甲酸，甲酸的存在为待测物提供酸性环境，可提高离子化效率。

进一步优选地，所述梯度洗脱的条件为：0–2.0min,5％B；2.0–7.0min,5％–30％B；7.0–13.0min,30％–95％B；13.0–18.0min,95％B；18.0–18.1min,95％-5％B；18.1-20.0min,5％B。

优选地，所述四级杆/静电场轨道肼高分辨率质谱的条件选自如下条件①～⑩中的至少一个：

①HESI-II正模式和负模式的喷雾电压分别为3500v和3200v；

②鞘流气，辅助气和吹扫器压力分别为35arb,10arb和0arb；

③S-lens RF为50v；

④雾化器温度为350℃；

⑤离子传输管温度为320℃；

⑥全扫描质量轴范围为80-1200Da；

⑦一级质谱和二极质谱在m/z＝200处的分辨率分别为70000FWHM和17500FWHM；

⑧自动增益控制为106个电荷；

⑨最大进针时间为50毫秒；

⑩所有提取的质量数窗口设置为4.0ppm。

上述条件①～⑩中的各个参数为本发明较佳的参数设定，本领域技术人员可以理解，上述条件①～⑩中的各个参数均可在±10％范围内浮动，不会影响最终的测定结果。例如，具体应用时，HESI-II正模式的喷雾电压可在3150v～3850v范围内选取。

进一步优选地，所述四级杆/静电场轨道肼高分辨率质谱的条件包括上述①～⑩的全部。

本发明所使用的超高效液相色谱-四级杆/静电场轨道肼高分辨率质谱是以超高液相色谱作为分离系统，静电场轨道肼质谱作为检测系统，经简单处理后的样品在液相色谱和质谱部分经过分离和离子化，经由检测器得到质谱图。该质谱的一级质谱和二极质谱在m/z＝200处的分辨率分别为70000和17500，远远高于其他高分辨质谱，所以结合了超高液相色谱对复杂样品的高分离能力和高分辨质谱的高选择性，高灵敏度及能够提供相对分子量和结构信息的优点。

四级杆/静电场轨道肼高分辨率质谱仪在对特征标志物及其碎片结构解析过程中所有离子的偏差均小于1.0ppm，这是所有质谱都难以达到的高准确度，所以对化合物的结构信息解析的也更准确。

以往蜜蜂产地的鉴定方法都集中于某一类物质(如黄酮类、酚酸类、有机酸类等)的分析，即通过购买标准物质，然后对样品中该物质进行定量分析，依据该物质在不同产地蜂蜜样品中的含量是否存在差异确定该标准物质能否作为特征标志物，这被称为靶标技术。靶标技术寻找特征标志物的范围十分的有限，不能探寻出真正的特征物质。本发明所述的用于鉴别荔枝蜜产地的特征标志物是采用非靶标技术确定得到的，即从蜂蜜样品的全谱图中搜寻特征标志物，特征标志物的确定更加客观精准，筛选得到的特征标志物更具有说服力，从而利用该特征标志物对不同产地的蜂蜜进行鉴别，鉴别结果也更加精准。

本发明的技术方案之二是：一种筛选用于鉴别荔枝蜜产地的特征标志物的方法，包括如下步骤：

(1)取来自两个已知不同产地的相同蜜源蜂蜜样品，相同产地的若干蜂蜜样品为一组；以纯水为溶剂，分别对每组中的蜂蜜样品进行溶解，得多个标准样品，备用；

其中，所述两个已知不同产地选自海南、云南、福建、广东和广西中的任意两种；

(2)取步骤(1)制备得到的所有标准样品，分别进行高效液相色谱-四级杆/静电场轨道肼高分辨率质谱分析，得到每个标准样品对应的质谱数据；对所有的质谱数据进行背景扣除、色谱峰提取和峰对齐，得到每个标准样品的总离子流色谱图，用于后续分析；

(3)采用t-test手段对每个标准样品的总离子流色谱图的质核比数据进行检测，取检测结果中P-Value＜0.05的组分进行分析，得潜在特征标志物；

(4)绘制每组样品的火山图进一步从步骤(3)中所述潜在特征标志物中筛选特征标志物；

(5)绘制每组样品的变量重要性投影图，取最大VIP值对应的物质即为可用于鉴别蜂蜜产地的特征标志物，绘图时，VIP值的设定以确保变量重要性投影图中显示的物质包括步骤(4)筛选得到的潜在特征标志物为准。

优选地，为了使得蜂蜜样品更具代表性，步骤(1)中，所述蜂蜜样品是通过如下方法得到的：从每个已知产地的不同地区采集相同蜜源植物的蜂蜜样品20-60个，每3-6个采集到的蜂蜜样品混合均匀成为一个样品，即得。

进一步优选地，本发明每组中的蜂蜜样品数量为3-8个，最优选为5个。

优选地，步骤(1)中，所述标准样品通过如下方法得到：向蜂蜜样品中加入纯水，涡旋混均，离心除去颗粒性杂质，取上清液，即得。进一步优选地，采用如下处理方法：按照1:5(g：mL)的固液比向待测样品中加入纯水，涡旋3-8min后，于8000-12000rpm转速下离心8-12min，取上清液，即得。

优选地，步骤(2)中，所述高效液相色谱采用C18色谱柱，以0.05-0.15％的甲酸水溶液为流动A相，以0.05-0.15％的甲酸乙腈溶液为流动B相，按照体积比为(5～95):(95～5)的A和B的混合液为流动相进行梯度洗脱。

进一步优选地，所述梯度洗脱为：0-2.0min,5％B；2.0-7.0min,5％-30％B；7.0-13.0min,30％-95％B；13.0-18.0min,95％B；18.0-18.1min,95％-5％B；18.1-20.0min,5％B。

优选地，步骤(2)中，所述四级杆/静电场轨道肼高分辨率质谱的条件选自如下条件①～⑩中的至少一个：

①HESI-II正模式和负模式的喷雾电压分别为3500v和3200v；

②鞘流气，辅助气和吹扫器压力分别为35arb,10arb和0arb；

③S-lens RF为50v；

④雾化器温度为350℃；

⑤离子传输管温度为320℃；

⑥全扫描质量轴范围为80–1200Da；

⑧自动增益控制为106个电荷；

⑨最大进针时间为50毫秒；

⑩所有提取的质量数窗口设置为4.0ppm。

优选地，步骤(4)中，所述火山图以(log₂ ^FC)为横坐标，(-log₁₀ ^P-value)为纵坐标，并取FC>10且P-value<0.01的数值作图。

本发明首先利用t-test初步筛选出特征标志物，然后在这些特征标志物范围内利用火山图和VIP值分析差异显著的特征标志物，以多重手段保证特征标志物的真实性。尤其是，在采用变量重要性投影图分析时，设定的VIP值要求最终显示的化合物中应包含火山图分析中筛选得到的特征标志物，这样更具有统计学意义，结果更加精准。

优选地，所述方法还包括采用主成分分析方法对每组标准样品的总离子流色谱图的质核比数据进行分析以初步判断是否存在特征标志物的步骤；采用主成分分析法有助于快速判断不同产地的相同蜜源蜂蜜是否存在特征标志物，使得特征标志物的筛选更加快捷。

若每组的数据聚集在各自的95％置信限椭圆图内，且两组数据能够完全分离，则初步判断两个产地的蜂蜜存在区分二者的特征标志物；

若每组的数据不能聚集在各自的95％置信限椭圆图内，和/或，两组数据不能够完全分离，则初步判断两个产地的蜂蜜不存在区分二者的特征标志物或很难筛选可以区分二者的特征标志物。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，即得本发明各较佳实例。

本发明涉及到的原料和试剂均可市购获得。

本发明取得了如下积极效果：

(1)该方法的优点是简单，快速，准确，稳定，并且是首次以基于轨道肼质谱技术的非靶标代谢组学技术应用于蜂蜜的品种鉴别；

(2)本发明所述的方法对于加强蜂蜜种类鉴别的研究，探索蜂蜜溯源信息，提高我国蜂蜜质量，保证消费者健康等具有重要的意义。

附图说明

图1是5种不同产地荔枝蜜的BPI图(ESI⁺模式)；

图2是5种不同产地荔枝蜜的BPI图(ESI-模式)；

图3是5种不同产地荔枝蜜PCA分布比较图；

图4是云南省和海南省荔枝蜜特征标志物筛选图；A:正模式下特征标志物火山图；B:正模式下VIP>1.3的特征标志物图谱；C:负模式下特征标志物火山图；D:负模式下VIP>1.3的特征标志物图谱(VIP图中:A,云南省荔枝蜜；E,海南省荔枝蜜)；

图5是云南省和福建省荔枝蜜特征标志物筛选图；A:正模式下特征标志物火山图；B:正模式下VIP>1.5的特征标志物图谱；C:负模式下特征标志物火山图；D:负模式下VIP>1.5的特征标志物图谱(VIP图中:A,云南省荔枝蜜；E,福建省荔枝蜜)；

图6是云南省和广东省荔枝蜜特征标志物筛选图；A:正模式下特征标志物火山图；B:正模式下VIP>1.5的特征标志物图谱；C:负模式下特征标志物火山图；D:负模式下VIP>1.5的特征标志物图谱(VIP图中:A,云南省荔枝蜜；E,广东省荔枝蜜)；

图7云南省和广西壮族自治区荔枝蜜特征标志物筛选A:正模式下特征标志物火山图；B:正模式下VIP>1.5的特征标志物图谱；C:负模式下特征标志物火山图；D:负模式下VIP>1.5的特征标志物图谱(VIP图中:A,云南省荔枝蜜；E,广西壮族自治区荔枝蜜)；

图8是特征标志物3,4-二甲氧基肉桂酸的结构鉴定；

图9是特征标志物脱落酸的结构鉴定；

图10是特征标志物苹果酸的结构鉴定；

图11是特征标志物羟基肉桂酸的结构鉴定；

图12是特征标志物β-环柠檬醛的结构鉴定；

图13是特征标志物木犀草素的结构鉴定。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中涉及的操作如无特殊说明，均为本领域常规技术操作。

以下实施例中涉及到的蜂蜜样品采集方法为：从我国荔枝蜂蜜主产区云南、海南、福建、广东和广西共采集150个蜂蜜样品。其中云南省28个样品、海南省29个样品、福建省29个样品、广东省33个样品、广西壮族自治区31个样品。样品贮藏在20℃通风良好避光的样品贮藏室内。为了提高蜂蜜样品的代表性，相同产地相同蜜源植物的3-6个蜂蜜样品均匀混合成一个样品，最终使每个产地具有相同植物源的蜂蜜样品为5个。

以下实施例1-4中涉及到的“制备标准样品”(步骤(1)内容)和“分析”(步骤(2)内容)为优选的方案，本领域技术人员可以理解，在该基础上进行参数的适当调整，均可实现本发明，且均可实现相同的技术效果。例如，可采用如下两种方式中的任意一种替换实施例1-4中的相应操作：

方式一：

(1)制备标准样品：称取蜂蜜每份2.0±0.1g置于10mL具塞离心管中，加入8mL纯水，涡旋7min混匀，8000rpm离心8分钟沉淀颗粒性杂志，取上清液，备用；

(2)分析：取步骤(1)制备得到的标准样品，分别进行高效液相色谱-四级杆/静电场轨道肼高分辨率质谱分析，具体分析条件为：

高效液相色谱：

流动相：0.05％的甲酸水(A)和0.05％的甲酸乙腈溶液(B)；洗脱条件：0–2.0min,5％B；2.0–7.0min,5％–30％B；7.0–13.0min,30％–95％B；13.0–18.0min,95％B；18.0–18.1min,95％-5％B；18.1-20.0min,5％B.；

色谱柱：Thermo Scientific Hypersil GOLD C-18column(2.1mm×100mm,1.9μm)色谱柱。

柱温为30℃；流速为0.2mL/min；进样量为3.0μL；

质谱条件：

HESI-II喷雾电压分别为3500v(正模式)和3200v(负模式)；鞘流气,辅助气和吹扫器压力分别为35arb,10arb,和0arb；S-lens RF为50v；雾化器温度350℃；离子传输管温度320℃.全扫描质量轴范围为80–1200Da。一级质谱和二极质谱在m/z＝200处的分辨率分别为70000FWHM和17500FWHM。自动增益控制为106个电荷，最大进针时间为50毫秒。所有提取的质量数窗口设置为4.0ppm。

方式二：

(1)制备标准样品：称取蜂蜜每份3.0±0.1g置于10mL具塞离心管中，

加入10mL纯水，涡旋8min混匀，9000rpm离心7分钟沉淀颗粒性杂志，取上清液，备用；

高效液相色谱：

流动相：0.2％的甲酸水(A)和0.2％的甲酸乙腈溶液(B)；

洗脱条件：0–2.0min,5％B；2.0–7.0min,5％–30％B；7.0–13.0min,30％–95％B；13.0–18.0min,95％B；18.0–18.1min,95％-5％B；18.1-20.0min,5％B.；

色谱柱：Thermo Scientific Hypersil GOLD C-18column(2.1mm×100mm,1.9μm)色谱柱；

柱温为35℃；流速为0.4mL/min；进样量为6.0μL；

质谱条件：

实施例1

一种筛选用于鉴别荔枝蜜产地的特征标志物的方法，该实施例可筛选出用于鉴别海南荔枝蜜和云南荔枝蜜的特征标志物，具体方法包括如下步骤：

(1)制备标准样品：海南的5个样品为一组，云南的5个样品为一组，分别称取每个样品1.0±0.1g置于10mL具塞离心管中，加入5mL纯水，涡旋5min混匀，10000rpm离心10分钟沉淀颗粒性杂质，取上清液，备用；

高效液相色谱：

流动相：0.1％的甲酸水(A)和0.1％的甲酸乙腈溶液(B)；

色谱柱：Thermo Scientific Hypersil GOLD C-18column(2.1mm×100mm,1.9μm)色谱柱

柱温为40℃；流速为0.3mL/min；进样量为5.0μL。

质谱条件：

(3)数据分析：

3.1：采用超高效液相色谱-四级杆/静电场轨道肼高分辨率质谱仪器自带SIEVE软件对两个产地蜂蜜样品的数据进行背景扣除、色谱峰提取和峰对齐，得到总离子流色谱图图谱，具体请参考图1和图2。导出的数据用于后续的数据处理。

3.2：采用主成分分析(PCA)法对各个蜂蜜样品的总离子流色谱数据进行分析，结果显示(具体请参考图3)：海南荔枝蜜的数据聚集在95％置信限椭圆内(左侧图)，云南荔枝蜜的数据聚集在95％置信限椭圆内(右侧图)，并且两组数据能够完全分离，说明云南、海南荔枝蜜可以得到完全的分离，也说明云南和海南荔枝蜜具有明显的代谢物变化，初步判定可能存在区分云南和海南荔枝蜜的特征标志物。

3.3：海南荔枝蜜与云南荔枝蜜相比：第一步：对t-test中P-Value＜0.05具有显著差异组分进行分析，共获得了3个潜在的特征标志物，其中1个(3,4-二甲氧基肉桂酸)为正模式下获得，2个(芦丁和脱落酸)为负模式下获得；第二步：以(log₂ ^FC)为横坐标，(-log₁₀ ^P ^-value)为纵坐标，并取FC>10且P-value<0.01的数值绘制每组样品中各个代谢产物的火山图进一步筛查代谢物；第三步：通过设定变量重要性投影图中VIP>1.65对代谢物进行排序。结果显示(请参考图4)：正、负模式下，3,4-二甲氧基肉桂酸和脱落酸的VIP值最大，即它们可分别作为正、负模式下海南荔枝蜜区别于云南荔枝蜜的特征标志物。其中，3,4-二甲氧基肉桂酸和脱落酸的结构鉴定请参考图8和图9。

云南荔枝蜜与海南荔枝蜜相比：第一步：对t-test中P-Value＜0.05具有显著差异组分进行分析，共获得了3个潜在的特征标志物，其中2个(α-姜黄烯和N-苄氧羰基-DL-亮氨酸)为正模式下获得，1个(苹果酸)为负模式下获得。第二步：以(log₂ ^FC)为横坐标，(-log₁₀ ^P ^-value)为纵坐标，并取FC>10且P-value<0.01的数值绘制每组样品中各个代谢产物的火山图进一步筛查代谢物；第三步：通过设定变量重要性投影图中VIP>1.65对代谢物进行排序(请参考图4)。结果显示：α-姜黄烯和苹果酸可分别作为正模式和负模式下云南荔枝蜜区别海南荔枝蜜的特征标志物。苹果酸的结构鉴定请参考图10。

实施例2

一种筛选用于鉴别荔枝蜜产地的特征标志物的方法，该实施例可筛选出用于鉴别福建荔枝蜜和云南荔枝蜜的特征标志物，具体方法同实施例1，具体分析结果为：

(1)主成分分析(PCA)结果显示：福建、云南荔枝蜜可以完全分离(图3)，说明云南和福建荔枝蜜具有明显的代谢物变化。

(2)福建荔枝蜜与云南荔枝蜜相比：第一步：对t-test中P-Value＜0.05具有显著差异组分进行分析，共获得了9个潜在的特征标志物，其中5个(环柠檬醛,3,4-二甲氧基肉桂酸,对甲基肉桂酸,短叶松素和肉桂醇)为正模式下获得，4个(肉桂酸,脱落酸,异野樱素和L-天冬氨酸)为负模式下获得；第二步：以(log₂ ^FC)为横坐标，(-log₁₀ ^P-value)为纵坐标，并取FC>10且P-value<0.01的数值绘制每组样品中各个代谢产物的火山图进一步筛查代谢物；第三步：通过设定变量重要性投影图中VIP>1.65对代谢物进行排序。结果显示(请参考图5)：β-环柠檬醛和脱落酸可分别作为正模式和负模式下福建荔枝蜜区别于云南荔枝蜜的特征标志物。其中，β-环柠檬醛的鉴定结果请参考图12。

云南荔枝蜜与福建荔枝蜜相比：第一步：对t-test中P-Value＜0.05具有显著差异组分进行分析，共获得了3个潜在的特征标志物，其中1个(羟基肉桂酸)为正模式下获得，2个(柠檬酸和苹果酸)为负模式下获得。第二步：以(log₂ ^FC)为横坐标，(-log₁₀ ^P-value)为纵坐标，并取FC>10且P-value<0.01的数值绘制每组样品中各个代谢产物的火山图进一步筛查代谢物；第三步：通过设定变量重要性投影图中VIP>1.65对代谢物进行排序，结果显示(请参考图5)：羟基肉桂酸和苹果酸可分别作为正、负模式下云南荔枝蜜区别福建荔枝蜜的特征标志物。其中，苹果酸和羟基肉桂酸的结构鉴定请参考图10和图11。

实施例3

(1)主成分分析(PCA)结果显示：福建、云南荔枝蜜可以完全分离(图3)，说明云南和广东荔枝蜜具有明显的代谢物变化。

(2)广东荔枝蜜与云南荔枝蜜相比：第一步：对t-test中P-Value＜0.05具有显著差异组分进行分析，共获得了4个在正模式下的潜在特征标志物(木樨草素，肉桂醇，环柠檬醛和对甲基肉桂酸)，负模式下未发现潜在特征标志物；第二步：以(log₂ ^FC)为横坐标，(-log₁₀ ^P-value)为纵坐标，并取FC>10且P-value<0.01的数值绘制每组样品中各个代谢产物的火山图进一步筛查代谢物；第三步：通过设定变量重要性投影图中VIP>1.65对代谢物进行排序。结果显示(具体请参考图6)：木樨草素可分别作为正模式下广东荔枝蜜区别于云南荔枝蜜的特征标志物；其中，木樨草素的结构鉴别请参考图13。

云南荔枝蜜与广东荔枝蜜相比：第一步：对t-test中P-Value＜0.05具有显著差异组分进行分析，共获得了5个潜在的特征标志物，其中3个(羟基肉桂酸，D-丙氨酸和脯氨酸)为正模式下获得，2个(柠檬酸和苹果酸)为负模式下获得。第二步：以(log₂ ^FC)为横坐标，(-log₁₀ ^P-value)为纵坐标，并取FC>10且P-value<0.01的数值绘制每组样品中各个代谢产物的火山图进一步筛查代谢物；第三步：通过设定变量重要性投影图中VIP>1.65对代谢物进行排序，结果显示(具体参考图6)：羟基肉桂酸和苹果酸可分别作为正模式和负模式下云南荔枝蜜区别广东荔枝蜜的特征标志物。

实施例4

(1)主成分分析(PCA)结果显示：广西、云南荔枝蜜可以完全分离(图3)，说明广西和广东荔枝蜜具有明显的代谢物变化。

(2)广西荔枝蜜与云南荔枝蜜相比：第一步：对t-test中P-Value＜0.05具有显著差异组分进行分析，共获得了5个潜在的特征标志物，其中3个(3,4-二甲氧基肉桂酸,环柠檬醛Boc-D-络氨酸)为正模式下获得，2个(肉桂酸和脱落酸)为负模式下获得；第二步：以(log₂ ^FC)为横坐标，(-log₁₀ ^P-value)为纵坐标，并取FC>10且P-value<0.01的数值绘制每组样品中各个代谢产物的火山图进一步筛查代谢物(具体参考图7)；第三步：通过设定变量重要性投影图中VIP>1.65(具体请参考图7)对代谢物进行排序。结果显示：脱落酸可作为负模式下广西荔枝蜜区别于云南荔枝蜜的特征标志物。

云南荔枝蜜与广西荔枝蜜相比：第一步：对t-test中P-Value＜0.05具有显著差异组分进行分析，共获得了4个潜在的特征标志物，其中2个(D-丙氨酸和羟基肉桂酸)为正模式下获得，2个(柠檬酸和苹果酸)为负模式下获得。第二步：以(log₂ ^FC)为横坐标，(-log₁₀ ^P ^-value)为纵坐标，并取FC>10且P-value<0.01的数值绘制每组样品中各个代谢产物的火山图进一步筛查代谢物；第三步：通过设定变量重要性投影图中VIP>1.65对代谢物进行排序，结果显示(具体参考图7)：羟基肉桂酸和苹果酸可分别作为正模式和负模式下云南荔枝蜜区别广西荔枝蜜的特征标志物。

实施例5

一种鉴别荔枝蜜产地的方法，包括如下步骤：

(1)制备待测样品：从市场购买产地标注为福建的洋槐蜜，采用如下方法进行处理：称取蜂蜜样品1.0±0.1g置于10mL具塞离心管中，加入5mL纯水，涡旋5min混匀，10000rpm离心10分钟沉淀颗粒杂质，取上清液，即得所述待测样品；

(2)检测：采用高效液相色谱-四级杆/静电场轨道肼高分辨率质谱对待测样品进行分析，具体分析条件为：

高效液相色谱：

流动相：0.1％的甲酸水和0.1％的甲酸乙腈溶液；

洗脱条件：0-2.0min,5％B；2.0-7.0min,5％–30％B；7.0-13.0min,30％-95％B；13.0-18.0min,95％B；18.0-18.1min,95％-5％B；18.1-20.0min,5％B；

柱温为40℃；流速为0.3mL/min；进样量为5.0μL；

质谱条件：

HESI-II喷雾电压分别为3500v(正模式)和3200v(负模式)；鞘流气,辅助气和吹扫器压力分别为35arb,10arb,和0arb；S-lens RF为50v；雾化器温度350℃；离子传输管温度320℃.全扫描质量轴范围为80–1200Da。一级质谱和二极质谱在m/z＝200处的分辨率分别为70000FWHM和17500FWHM。自动增益控制为106个电荷，最大进针时间为50毫秒。所有提取的质量数窗口设置为4.0ppm得到高分辨质谱图；

(3)数据分析：

采用超高效液相色谱-四级杆/静电场轨道肼高分辨率质谱仪器自带SIEVE软件提取特征标志物的质谱信息；

(4)产地鉴别：该待测样品的正模式质谱信息中包括β-环柠檬醛的所有碎片离子峰，负模式质谱信息中包括脱落酸的所有碎片离子峰，判断该产品确为福建荔枝蜜。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种鉴别荔枝蜜产地的方法，其特征在于：

以3,4-二甲氧基肉桂酸、脱落酸、α-姜黄烯、苹果酸中的一种或多种作为鉴别海南荔枝蜜和云南荔枝蜜的特征标志物；

以β-环柠檬醛、脱落酸、羟基肉桂酸、苹果酸中的一种或多种作为鉴别福建荔枝蜜和云南荔枝蜜的特征标志物；

以脱落酸、羟基肉桂酸、苹果酸中的一种或多种作为鉴别广西荔枝蜜和云南荔枝蜜的特征标志物；

所述方法采用高效液相色谱-四级杆/静电场轨道肼高分辨率质谱对待测样品进行分析；(1)鉴别海南荔枝蜜和云南荔枝蜜时，当正模式质谱图中含有3,4-二甲氧基肉桂酸的所有碎片离子峰，和/或，负模式质谱图中含有脱落酸的所有碎片离子峰时，判定所述待测样品是海南荔枝蜜；当所述正模式质谱图中不含有或只含有部分3,4-二甲氧基肉桂酸的碎片离子峰，和/或，所述负模式质谱图中不含有或只含有部分脱落酸的碎片离子峰时，判定所述待测样品不是海南荔枝蜜；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：3,4-二甲氧基肉桂酸的碎片离子峰为：163.07536±1ppm，135.08044±1ppm，121.06479±1ppm，95.04914±1ppm，91.05423±1ppm，208.07356±1ppm；

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述待测样品采用如下方法处理后进行分析：取待测样品，向其中加入纯水，涡旋混均，离心除去颗粒性杂质，取上清液，即得。

4.根据权利要求3所述方法，其特征在于：按照1g:5mL的固液比加入纯水，涡旋3-8min后，于8000-12000rpm转速下离心8-12min，取上清液，即得。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述高效液相色谱采用C18色谱柱，以0.05-0.15％的甲酸水溶液为流动A相，以0.05-0.15％的甲酸乙腈溶液为流动B相，按照体积比为5～95:95～5的A和B的混合液为流动相进行梯度洗脱。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述梯度洗脱为：0-2.0min,5％B；2.0-7.0min,5％-30％B；7.0-13.0min,30％-95％B；13.0-18.0min,95％B；18.0-18.1min,95％-5％B；18.1-20.0min,5％B。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述四级杆/静电场轨道肼高分辨率质谱的条件选自如下条件①～⑩中的至少一个：

①HESI-II正模式和负模式的喷雾电压分别为3500v和3200v；

②鞘流气，辅助气和吹扫器压力分别为35arb,10arb和0arb；

③S-lens RF为50v；

④雾化器温度为350℃；

⑤离子传输管温度为320℃；

⑥全扫描质量轴范围为80-1200Da；

⑧自动增益控制为106个电荷；

⑨最大进针时间为50毫秒；

⑩所有提取的质量数窗口设置为4.0ppm，

其中，条件①～⑩中的各个参数数值可在±10％范围内浮动。

8.一种筛选用于鉴别荔枝蜜产地的特征标志物的方法，其特征在于，包括如下步骤：

其中，所述两个已知不同产地选自云南、海南、福建、广东、广西中的任意两个；

(5)绘制每组样品的变量重要性投影图，取最大VIP值对应的物质即为可用于鉴别蜂蜜产地的特征标志物；绘图时，VIP值的设定以确保变量重要性投影图中显示的物质包括步骤(4)筛选得到的潜在特征标志物为准。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述蜂蜜样品是通过如下方法得到的：从每个已知产地的不同地区采集相同蜜源植物的蜂蜜样品20-60个，每3-6个蜂蜜样品混合均匀成为一个样品，即得。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述高效液相色谱采用C18色谱柱，以0.05-0.15％的甲酸水溶液为流动A相，以0.05-0.15％的甲酸乙腈溶液为流动B相，按照体积比为5～95:95～5的A和B的混合液为流动相进行梯度洗脱。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于：所述梯度洗脱为：0-2.0min,5％B；2.0-7.0min,5％-30％B；7.0-13.0min,30％-95％B；13.0-18.0min,95％B；18.0-18.1min,95％-5％B；18.1-20.0min,5％B。

12.根据权利要求10所述的方法，其特征在于：所述四级杆/静电场轨道肼高分辨率质谱的条件选自如下条件①～⑩中的至少一个：

①HESI-II正模式和负模式的喷雾电压分别为3500v和3200v；

②鞘流气，辅助气和吹扫器压力分别为35arb,10arb和0arb；

③S-lens RF为50v；

④雾化器温度为350℃；

⑤离子传输管温度为320℃；

⑥全扫描质量轴范围为80-1200Da；

⑧自动增益控制为106个电荷；

⑨最大进针时间为50毫秒；

⑩所有提取的质量数窗口设置为4.0ppm，

其中，条件①～⑩中的各个参数数值可在±10％范围内浮动。

13.根据权利要求11所述的方法，其特征在于：所述四级杆/静电场轨道肼高分辨率质谱的条件选自如下条件①～⑩中的至少一个：

①HESI-II正模式和负模式的喷雾电压分别为3500v和3200v；

②鞘流气，辅助气和吹扫器压力分别为35arb,10arb和0arb；

③S-lens RF为50v；

④雾化器温度为350℃；

⑤离子传输管温度为320℃；

⑥全扫描质量轴范围为80-1200Da；

⑧自动增益控制为106个电荷；

⑨最大进针时间为50毫秒；

⑩所有提取的质量数窗口设置为4.0ppm，

其中，条件①～⑩中的各个参数数值可在±10％范围内浮动。