CN113125588A - 一种代谢组学分析技术判别鸭屎香单丛茶时空分类的应用 - Google Patents

一种代谢组学分析技术判别鸭屎香单丛茶时空分类的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于乌龙茶判别的技术领域，具体涉及一种代谢组学分析技术判别鸭屎香单丛茶时空分类的应用。所述代谢组学分析技术中通过Log2 Fold Change、adj.p、VIP值判别鸭屎香单丛茶不同海拔和季节的特征成分；所述判别鸭屎香单丛茶特征成分的筛选条件为∣Log2 Fold Change∣＞1.5，adj.p＜0.05且VIP>1；本发明基于特征标志物的峰面积开展鸭屎香单丛茶时空分类判别，训练集与测试集的样品量比例为2:1，以判别分析模型预测值>0.35且为不同分类值中最大值，即可认为预测鸭屎香分类为对应的时空分类。本发明以不同时空鸭屎香标志物含量为基础建立鸭屎香单丛茶时空分类判别模型。

Description

一种代谢组学分析技术判别鸭屎香单丛茶时空分类的应用
技术领域
本发明属于乌龙茶判别的技术领域，具体涉及一种代谢组学分析技术判别鸭屎香单丛茶时空分类的应用。
背景技术
鸭屎香单丛茶(以下简称“鸭屎香”)是地理标志产品凤凰单丛茶中的一个具特殊韵味的高价值品种，其叶片似大乌叶，香型似黄枝香，滋味和香味均好，备受消费者喜爱。尽管是当地种植面积最广的品种，仍然供不应求，加之不同品种、等级的茶叶价格不同，由于经济效益的驱使，市场上总有部分不法商贩以次充好、以假乱真。
传统的鉴别方法是通过感官评审对茶叶的特征进行评价判别，具有很强的主观性。茶叶的化学组成决定了茶叶的饮用价值和特征，以茶叶化学成分为基础建立鸭屎香单丛茶特征成分的代谢组学分析方法，有利于开展鸭屎香的真假鉴别、地理溯源季优质品种筛选、风味调控等应用。但是茶叶的化学组成非常复杂，化学成分多达千余种。目前，以代谢组学分析方法对不同等级鸭屎香单丛茶中特征成分判别进行判别并应用于时空分类的真伪鉴别还未见报道，无法对相关应用提供技术指导。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的在于提供一种代谢组学分析技术在判别鸭屎香单丛茶时空分类的应用，建立了一种非靶向代谢组学分析方法对不同等级的鸭屎香茶叶进行特征鉴别，准确地找出不同海拔和季节的鸭屎香的特征成分并应用于判别时空分类的方法。
本发明的技术内容如下：
本发明提供了一种代谢组学分析技术判别鸭屎香单丛茶时空分类的应用。
本发明还提供了一种代谢组学分析技术在判别鸭屎香单丛茶不同海拔和季节的特征成分的应用；
所述代谢组学分析技术在判别鸭屎香单丛茶不同海拔和季节的特征成分应用于鸭屎香单丛茶时空分类的判别；
所述代谢组学分析技术中通过Log2 Fold Change、adj.p、VIP值判别鸭屎香单丛茶不同海拔和季节的特征成分；
所述判别鸭屎香单丛茶特征成分的筛选条件为∣Log2 Fold Change∣＞1.5，adj.p＜0.05且VIP>1。
本发明还提供了一种判别鸭屎香单丛茶特征成分的代谢组学分析方法，包括如下步骤：
1)样品制备；
2)非靶向代谢组学分析；
3)特征峰的提取和鉴别；
4)差异性分析以及筛选差异标志物；
5)基于特征标志物开展鸭屎香单丛茶时空分类判别。
步骤1)所述样品的制备包括如下步骤：将鸭屎香及其它与其性质接近的乌龙茶样品，粉碎研磨至50～70目，将茶叶粉末与提取剂混合进行超声处理，离心分离取上清液；
所述提取剂包括甲酸、甲醇和水的混合物，其中，甲酸的质量分数为0.8～1.2％，甲醇和水的体积比为(2～4)：1；
所述提取剂的使用体积为1～1.5mL/100mg茶叶粉末；
所述超声处理为在20～25℃温度下超声10～20min；
所述离心分离为在3～5℃、8000～12000rpm条件下离心8～10min，以使得提取体系更好地分层，分离得到上清液；
所述上清液经过0.1～0.3μm的有机滤膜进行过滤，取等量的过滤上清液作为质量控制样品，以提升整体分析方法的准确性。
步骤2)所述非靶向代谢组学分析包括采用高效液相色谱进行组分分离，应用质谱进行分析；
所述高效液相色谱的条件包括，色谱柱温度为35～45℃，进样流速为0.2～0.4μL/min，进样体积为1.5～2.5μL；流动相包括第一流动相和第二流动相，第一流动相为质量分数为0.08～0.2％的甲酸水溶液，第二流动相为质量分数为0.08～0.2％的甲酸乙腈溶液；
进一步地，采用所述第一流动相和所述第二流动相配比逐渐变化进行梯度洗脱，在0～2min，第二流动相的质量分数保持在5％，在2～7min，第二流动相的质量分数从5％逐渐上升为25％；在7～11min，第二流动相的质量分数从25％逐渐上升为70％；在11min，第二流动相的质量分数从70％逐渐上升为95％；11～12.5min，第二流动相的质量分数保持在95％；在12.5～12.6min，第二流动相的质量分数从95％快速降低为5％；最后，在流动相中第二流动相质量分数为5％平衡3.0～4.0min；通过进一步优化了色谱条件，使得代谢物更好地进行分离，特别是流动相的选择和洗脱梯度的控制，进一步提升代谢物的分离效果；
所述色谱柱包括C18 Accucore柱，所采用的色谱柱能够更好地分离代谢物；特别是流动相的选择和洗脱梯度的控制，进一步提升代谢物的分离效果。
所述质谱条件包括，分辨率为65000～75000FWHM，喷雾电压2.5～3.5KV，鞘气压力35～45psi，辅助气8～12arb，毛细管温度为300～350℃，辅助气温度为310～340℃；更优选地，质谱扫描模式为full MS-dd/MS2，full MS对应的扫描范围100～1000m/z；dd/MS2对应的分辨率为17000～18000FWHM，NCE设定为15～60eV，质量窗口为1.5m/z；
步骤3)所述特征峰的提取和鉴别，将采集得到的不同茶叶原始数据采用CompoundDiscover软件对质谱分析得到的进行峰对齐、峰提取、降噪、归一化处理；
所述Compound Discover软件进行数据处理过程中各参数的设置包括：峰对齐保留时间偏差为1.5～2.5min，化合物检测质量偏差为4～6ppm，最大未知元素组成设定为C90、H190、Br3、C14、K2、N10、O40、P3和S5，最小未知元素组成设定为C和H，最小峰强度设置为800000～1200000，信噪比(S/N)阈值为2.5～3.5，一级质谱图匹配的质量偏差为4.5～5.5ppm；
进一步地，所述一级质谱图匹配采用的数据库选自Nature Chemical Biology、Nature Chemistry、PlantCyc、PubMed、Chembank和Massbank中的至少一种；
对差异代谢物进行鉴别和确证是与二级质谱图进行匹配，并对具有标准品的化合物进行确证；
所述二级质谱图的数据库选自mz vault、mzCloud或Chemspider；
所述二级质谱图的数据库选自mz vault或mzCloud数据库进行匹配的得分大于70分，通过二级质谱图的匹配进一步提升差异代谢物检测的准确度，提升整体分析方法的准确率。
步骤4)所述差异性分析为，将步骤3)得到的所有代谢物的峰面积数据等由Compound Discover3.1导出至Excel，分别预处理后形成数据集，并按比例将数据集随机拆分为训练集和测试集，样品量拆分比例为2：1；将训练集的不同鸭屎香及质量控制(QC)样本的峰面积矩阵导入SIMCA 14.1软件，进行主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)，了解不同海拔和不同季节鸭屎香的代谢物的总体差异分布，通过PCA得分图及OPLS-DA分析分析不同海拔和不同季节鸭屎香成分的差异性；
所述进行PCA和OPLS-DA分析是将差异代谢物的数据由Compound Discover软件导出至Excel进行数据处理后，将不同茶叶及质量控制样本的峰面积矩阵导入SIMCA-P 14.1软件处理；
所述筛选差异标志物是将是将采集得到的不同乌龙茶样品原始数据进行峰对齐、峰提取、降噪和归一化处理，并通过Log2 Fold Change、adj.p、VIP值筛选出鸭屎香与其他乌龙茶的差异代谢物；
每两种鸭屎香的差异代谢物的筛选条件为∣Log2 Fold Change∣＞1.5，adj.p＜0.05且VIP>1，分别得到不同海拔和不同季节等时空分类的特征标志物。
所述步骤5)基于特征标志物开展鸭屎香单丛茶时空分类判别的操作为：将从步骤4)得到的特征标志物峰面积分别从训练集与测试集筛选形成新的训练集与测试集，并同步导入SIMCA-P 14.1软件处理再次进行PCA和OPLS-DA分析，通过OPLS-DA分析建立所述分类变量与标志物峰面积的鸭屎香时空判别模型；
其中，在所述判别模型的“分类列表”中显示的值是预测集原始值和预测值。所显示的值<0.35是不属于此类，在0.35和0.65之间为待定，可能属于此类，>0.65的是属于该类别。当显示值>0.35且为不同分类值中最大值，即可认为预测鸭屎香分类为对应的时空分类。
本发明的有益效果如下：
本发明的一种代谢组学分析技术在判别鸭屎香单丛茶时空分类的应用，利用代谢组学分析技术建立了鸭屎香的全面、无歧视性的非靶向代谢组学分析方法，其能够对茶叶进行代谢成分分析，准确地找出鸭屎香的特征成分，并应用于判别不同时空分类的鸭屎香单丛茶，本发明基于特征标志物的峰面积开展鸭屎香单丛茶时空分类判别，训练集与测试集的样品量比例为2:1，以判别分析模型预测值>0.35且为不同分类值中最大值，即可认为预测鸭屎香分类为对应的时空分类；
本发明以茶叶化学成分为基础，建立不同等级鸭屎香单丛茶特征成分的代谢组学分析方法，结合化学计量学分析，从大数据中筛查有利于开展不同等级鸭屎香的真假鉴别、地理溯源季优质品种筛选、风味调控等应用的鸭屎香特征标志物，并以标志物的信息建立鸭屎香单丛茶时空分类判别分类模型。
附图说明
图1为不同海拔鸭屎香的PCA得分图；
图2为不同海拔鸭屎香的OPLS-DA得分图。
具体实施方式
以下通过具体的实施案例以及附图说明对本发明作进一步详细的描述，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定。
若无特殊说明，本发明的所有原料和试剂均为常规市场的原料、试剂。
实施例1
一种判别鸭屎香单丛茶特征成分的代谢组学分析方法：
1)样品制备
选取茶叶品种均为鸭屎香，记录每个鸭屎香的海拔信息，所有样品采集均设置3个重复。其中，将鸭屎香的海拔分为3类，分别记为低山茶(500米以下)、中山茶(500米-700米)和高山茶(700米以上)。按照不同海拔的种植面积比例，低山共采集了76个样品，中山采集了58个样品，高山采集了25个样品，共159个样品。
将所选茶叶均匀取样100g左右采用研磨仪进行粉碎，过60目筛后于-20℃冰箱中保存待测。称取100mg茶叶粉末样品置于1.5mL离心管中，加入1mL含1％甲酸的甲醇/水(75/25，v/v)溶液；将混合物于20℃条件下超声10min，然后用低温离心机在4℃条件下11000rpm离心10min；取上清液，过0.22μm有机滤膜于2mL进样小瓶中，即得茶叶提取液。分别从各样品溶液中取等量溶液，混匀，置于液相小瓶中作为质量控制(quality control，QC)样品。
2)非靶向代谢组学分析
用Thermo fisher U 3000超高效液相色谱仪，色谱柱为C18Accucore aQ柱(1502.1mm，2.6μm)，柱温40℃，进样流速为0.3μL/min，进样体积为2μL，流动相为0.1％甲酸水溶液(第一流动相A)和0.1％甲酸乙腈溶液(第二流动相B)，梯度洗脱流程为：0～2min，5％B；2～7min，5～25％B；7～11min，25～70％B；11min，70～95％B；11～12.5min，95％B，12.5～12.6min，95～5％B，最后，采用5％B平衡2.5min，共15min。
质谱条件：Thermo Scientific TM Q Exactive Orbitrap质谱仪，采用电喷雾电离(ESI)源，于正、负模式下分别扫描。各参数设置如下：分辨率70000(FWHM)；喷雾电压3.2KV；鞘气压力40psi；辅助气10arb；毛细管温度320℃；辅助气温度325℃；质谱扫描模式full MS-dd/MS2，full scan的扫描范围100～1000m/z；dd/MS2：分辨率17500，NCE 15、20、30、40、60eV，质量窗口为1.5m/z。
3)特征峰的提取和鉴别
使用Compound Discover 3.1软件对步骤色谱和质谱所得检测数据进行预处理，包括峰对齐、峰提取、降噪、归一化处理、化合物鉴别；在Compound Discover 3.1数据处理过程中各参数设置如下：峰对齐保留时间偏差为2min；化合物检测质量偏差为5ppm，最大未知元素组成设定为据C90、H190、Br3、Cl4、N10、O40、P3、S5，最小未知元素组成设定为C、H，最小峰强度设置为1000000，信噪比(S/N)阈值设为3；SearchChemspider中选择NatureChemical Biology、Nature Chemistry、PlantCyc、PubMed数库进行一级质谱图的匹配，质量偏差为5ppm。通过Compound Discover 3.1软件的mzVault、mzCloud等数据库中的二级质谱图进行匹配。
4)差异性分析以及筛选差异标志物
将步骤3)得到的所有代谢物的峰面积经剔除QC样品峰面积CV>20％的特征峰数据由Compound Discover 3.1导出至Excel，分别预处理后形成数据集，并按比例将数据集随机拆分为训练集和测试集，样品量拆分比例为2：1；将训练集的不同鸭屎香及质量控制(QC)样本的峰面积矩阵导入SIMCA 14.1软件，进行主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)，了解不同鸭屎香代谢物的总体差异分布。如图1所示，为不同海拔下鸭屎香的PCA得分图，其中左图为正离子模式，右图为负离子模式，正负离子模式下的QC质控样本在PCA模式下聚集，表明数据质量可靠；如图2为不同海拔下鸭屎香的OPLS-DA得分图，其中左上图为正离子模式，右上图为负离子模式；左下为正离子模式下置换检验图，右下为离子模式下置换检验图(n＝200)，结果显示在OPLS-DA模式下，低山、中山和高山等不同海拔的鸭屎香化学成分差异较为明显，大部分不同海拔样品得到明显区分，且模型Q2<0.05，表明预测能力良好。
通过Compound Discover 3.1软件内置的数据统计功能筛选差异代谢物，筛选条件为：∣Log2 Fold Change∣＞1.5，且adj.p＜0.05，VIP＞1，鉴别到苯乙醛、桉叶油醇、7-羟基香豆素等9个化合物为不同海拔鸭屎香的特征标志物，且高山的丰度均显著高于低山鸭屎香。
如表1所示为基于UHPLC Q-Exactive Orbitrap MS技术判别的9个化合物信息。
表1基于UHPLC Q-Exactive Orbitrap MS技术判别得到的鸭屎香标志物
Figure BDA0002980494840000101
Figure BDA0002980494840000111
5)将从步骤4)得到的9个特征标志物峰面积分别从训练集与测试集中筛选形成新的训练集与测试集，并同步导入SIMCA-P 14.1软件处理再次进行PCA和OPLS-DA分析，通过OPLS-DA分析建立所述分类变量与标志物峰面积的鸭屎香时空判别模型。
其中，在判别分析模型的“分类列表”中显示的值是预测集原始值和预测值。<0.35是不属于此类，在0.35和0.65之间是可能属于此类，>0.65的是属于该类别。当显示值>0.35且为不同分类值中最大值，即可认为预测鸭屎香分类为对应的时空分类。得到不同海拔判别分类模型的判别准确度表格，可见模型的整体准确率89.94％，其中低山的准确率最高，达92.11％。
如表2所示，为9个特征标志物的鸭屎香海拔分类判别模型准确度结果。
表2基于9个特征标志物的鸭屎香海拔分类判别模型准确度
Figure BDA0002980494840000112
实施例2
一种对鸭屎香单丛茶特征成分判别的代谢组学分析方法，可应用于判别鸭屎香单丛茶的不同季节茶叶的特征成分，其与实施例1的具体步骤相同，区别在于样品的海拔信息不同，本实例中茶叶品种均为鸭屎香，其中，将鸭屎香的海拔分为4类，分别记为春茶、夏茶、秋茶和雪片(冬季采摘的茶)。
结果显示，不同季节的鸭屎香具有明显差异。以∣Log2 Fold Change∣＞1，且adj.p＜0.05，VIP>1为阈值，筛选出等D-脯氨酸、桉叶油醇、紫云英苷等17异代谢物，如表3所示。
表3基于UHPLC Q-Exactive Orbitrap MS技术判别的17个化合物信息
Figure BDA0002980494840000121
Figure BDA0002980494840000131
实施例3
一种对鸭屎香单丛茶特征成分判别的代谢组学分析方法，可应用于判别鸭屎香单丛茶的不同海拔和季节茶叶的特征成分，其与实施例1的具体步骤相同，区别在于样品同时记录了鸭屎香的海拔和采摘季节信息，本实例中可运用于鉴别高山春茶、低山春茶或低山雪片等不同等级的鸭屎香。
以∣Log2 Fold Change∣＞1，且adj.p＜0.05，VIP>1为阈值，筛选出的8个差异代谢物，可用于表征鸭屎香的海拔和季节信息。
表4基于UHPLC Q-Exactive Orbitrap MS技术判别的8个化合物信息
Figure BDA0002980494840000141
本发明实施例中所限定的具体软件仅为优选实施例，在其它实施例中也可以采用本发明实施例所限定之外的其它软件进行分析。

Claims (10)

1.一种代谢组学分析技术判别鸭屎香单丛茶时空分类的应用。
2.一种代谢组学分析技术在判别鸭屎香单丛茶不同海拔和季节的特征成分的应用。
3.由权利要求2所述的代谢组学分析技术在判别鸭屎香单丛茶不同海拔和季节的特征成分的应用，其特征在于，所述代谢组学分析技术在判别鸭屎香单丛茶不同海拔和季节的特征成分应用于鸭屎香单丛茶时空分类的判别。
4.由权利要求2所述的代谢组学分析技术在判别鸭屎香单丛茶不同海拔和季节的特征成分的应用，其特征在于，所述代谢组学分析技术中通过Log2 Fold Change、adj.p、VIP值判别鸭屎香单丛茶不同海拔和季节的特征成分；
所述判别鸭屎香单丛茶特征成分的筛选条件为∣Log2 Fold Change∣＞1.5，adj.p＜0.05且VIP>1。
5.一种判别鸭屎香单丛茶时空分类的代谢组学分析方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)样品制备；
2)非靶向代谢组学分析；
3)特征峰的提取和鉴别；
4)差异性分析以及筛选差异标志物；
5)基于特征标志物开展鸭屎香单丛茶时空分类判别。
6.由权利要求5所述的判别鸭屎香单丛茶时空分类的代谢组学分析方法，其特征在于，步骤1)所述样品的制备包括如下步骤：将鸭屎香及其它与其性质接近的乌龙茶样品，粉碎研磨得到茶叶粉末，与提取剂混合进行超声处理，离心分离取上清液；
所述提取剂包括甲酸、甲醇和水的混合物，甲酸的质量分数为0.8～1.2％，甲醇和水的体积比为(2～4)：1；
所述提取剂的使用体积为1～1.5mL/100mg茶叶粉末；
所述超声处理为在20～25℃温度下超声10～20min；
所述离心分离为在3～5℃、8000～12000rpm条件下离心8～10min，以使得提取体系更好地分层，分离得到上清液；
所述上清液经过0.1～0.3μm的有机滤膜进行过滤。
7.由权利要求5所述的判别鸭屎香单丛茶时空分类的代谢组学分析方法，其特征在于，步骤2)所述非靶向代谢组学分析包括采用高效液相色谱进行组分分离，应用质谱进行分析；
所述高效液相色谱的条件包括，色谱柱温度为35～45℃，进样流速为0.2～0.4μL/min，进样体积为1.5～2.5μL；流动相包括第一流动相和第二流动相，第一流动相为质量分数为0.08～0.2％的甲酸水溶液，第二流动相为质量分数为0.08～0.2％的甲酸乙腈溶液；
所述色谱柱包括C18 Accucore柱；
所述质谱条件包括，分辨率为65000～75000FWHM，喷雾电压2.5～3.5KV，鞘气压力35～45psi，辅助气8～12arb，毛细管温度为300～350℃，辅助气温度为310～340℃；更优选地，质谱扫描模式为full MS-dd/MS2，full MS对应的扫描范围100～1000m/z；dd/MS2对应的分辨率为17000～18000FWHM，NCE设定为15～60eV，质量窗口为1.5m/z。
8.由权利要求5所述的判别鸭屎香单丛茶时空分类的代谢组学分析方法，其特征在于，步骤3)所述特征峰的提取和鉴别，将采集得到的不同茶叶原始数据采用CompoundDiscover软件对质谱分析得到的进行峰对齐、峰提取、降噪、归一化处理；
所述Compound Discover软件进行数据处理过程中各参数的设置包括：峰对齐保留时间偏差为1.5～2.5min，化合物检测质量偏差为4～6ppm，最大未知元素组成设定为C90、H190、Br3、C14、K2、N10、O40、P3和S5，最小未知元素组成设定为C和H，最小峰强度设置为800000～1200000，信噪比阈值为2.5～3.5，一级质谱图匹配的质量偏差为4.5～5.5ppm；
所述一级质谱图匹配采用的数据库选自Nature Chemical Biology、NatureChemistry、PlantCyc、PubMed、Chembank和Massbank中的至少一种；
对差异代谢物进行鉴别和确证是与二级质谱图进行匹配，并对具有标准品的化合物进行确证；
所述二级质谱图的数据库选自mz vault、mzCloud或Chemspider；所述二级质谱图的数据库选自mz vault或mzCloud数据库进行匹配的得分大于70分。
9.由权利要求5所述的判别鸭屎香单丛茶时空分类的代谢组学分析方法，其特征在于，步骤4)所述差异性分析为，将步骤3)得到的所有代谢物的峰面积数据等由CompoundDiscover 3.1导出至Excel，分别预处理后形成数据集，并按比例将数据集随机拆分为训练集和测试集，样品量拆分比例为2：1；将训练集的不同鸭屎香及质量控制样本的峰面积矩阵导入SIMCA 14.1软件，进行主成分分析和正交偏最小二乘判别分析，了解不同海拔和不同季节鸭屎香的代谢物的总体差异分布，通过PCA得分图及OPLS-DA分布分析不同海拔和不同季节鸭屎香成分的差异性。
10.由权利要求5所述的判别鸭屎香单丛茶时空分类的代谢组学分析方法，其特征在于，步骤5)基于特征标志物开展鸭屎香单丛茶时空分类判别的操作为：将从步骤4)得到的特征标志物峰面积分别从训练集与测试集筛选形成新的训练集与测试集，并同步导入SIMCA-P 14.1软件处理再次进行PCA和OPLS-DA分析，通过OPLS-DA分析建立所述分类变量与标志物峰面积的鸭屎香时空判别模型；
其中，在所述判别模型的“分类列表”中显示的值是预测集原始值和预测值，当所显示的值<0.35是不属于此类，在0.35和0.65之间为待定，>0.65的是属于该类别，当显示值>0.35且为不同分类值中最大值，即可认为预测鸭屎香分类为对应的时空分类。
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