CN108362782B - 一种基于超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱鉴定五常大米真伪的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于超高效液相质谱串联四级杆飞行时间质谱鉴定五常大米真伪的方法,所述方法先对大米进行预处理以提出其中的代谢物,再应用超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱对大米中的代谢物进行检测,获得不同产地来源大米样品的代谢指纹图谱数据,对所述代谢指纹图谱数据进行分析处理从而得到五常大米的标志性化合物,检测待测五常大米样品中是否含有所述标志性化合物即可对待测样品的真伪进行鉴定。本发明提供的方法从代谢组学的角度出发,在一个宽泛的质量范围内(m/z 50~1200),实现了对不同产地大米中复杂的差异代谢物的非目标筛查,为实际生产以及大米销售过程中五常大米的真伪鉴定提供了有力手段。
Description
技术领域
本发明属于食品安全检测技术领域,具体涉及应用超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱建立鉴定五常大米真伪的方法。
背景技术
大米是我国的主要粮食作物之一,富含蛋白质、碳水化合物、矿物质、脂肪等多种营养素,能为人体提供全面营养,我国60%以上的居民以大米为主食。我国大米种植区域广泛,由于产地生态和大米的遗传学的差异,不同区域所产大米的品质不尽相同,其中,五常大米是我国质检总局认定的地理标志产品(GB/T 19266-2008),具有香气浓郁、颜色清白、绵软略粘、芳香爽口等特点,深受消费者的青睐。因此,在市场上,五常大米的价格高于其他品种的大米,一些不法商人为了追求利益,用其他产地的米冒充五常大米,或者,在五常大米中掺入其他产地的大米,再按正品五常大米的价格出售,从中获利,而这些“假米”,不仅让消费者花费了更多的金钱,而且由于“假米”来源不明,也会影响消费者的健康,而且,由于外观、气味以及香味的相似性,尽管不同来源大米的质量和组成不同,但是通过外观和常规分析并不能区分产地。因此,大米溯源研究对维护消费者的利益,保障消费者的健康具有重要意义。
有研究人员应用GC-MS进行大米的产地溯源研究,但是,在该研究中测定的大米中提取化合物的质量范围是m/z 40~300,测定的是挥发性成分,而本方法可在更宽泛的质量范围(m/z 50~1200)内找到差异代谢物的信息。
据研究报道,应用三重四级杆质谱结合直接进样的方式可以对大米进行溯源,此研究中m/z的扫描范围是50~1500m/z,不同样品经扫描后,得到的色谱峰数量是279.1~544.3个。与三重四级杆质谱相比,飞行时间质谱在灵敏度、准确度和精确分子质量的测定等方面,优于三重四级杆质谱。高通量质谱能够涵盖研究对象更多的化合物信息,在代谢组学研究方面优势明显。因此,本方法采用飞行时间质谱对样品进行分析,检测到的色谱峰数量超过3000个。
冯雪等应用液质对方正稻米进行了基于代谢指纹的产地溯源技术研究,该论文采用的数据处理方法为PCA法,PCA为无监督模式的分析方法,当组内差异较小时,该方法可以明显区分组间差异,但是,当样品组内差异较大,且组间差异不明显时,该方法则难以区分和发现组间差异。
综上所述,虽然应用质谱技术,从代谢物的角度进行大米产地鉴定研究已取得了一定的进展,但是在代谢物信息的提取、数据的分析处理等方面还有一定的提升空间。
发明内容
本发明的目的在于提供一种应用超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱鉴定五常大米真伪的方法。本发明采用溶剂提取法,提取大米代谢物,并建立超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱测定大米代谢指纹图谱的方法,对样品中质量范围在m/z 50~1200之间的代谢物进行了高通量分析,同时结合化学计量学的方法,对采集得到的数据进行PCA和OPLS-DA分析,得到五常大米的特征性化合物,实现对五常大米的真伪鉴定。
具体而言,本发明提供的方法包括如下步骤:
(1)样品预处理:取五常大米样品,磨成粉后过筛,先采用体积比98~100:1的水/甲酸溶液进行振荡提取,离心取上清液后再加入体积比95~100:2~5:1的乙醇/水/甲酸溶液进行振荡提取,离心后取上清液,得样品溶液;
(2)用超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱对所述样品溶液进行检测,获得五常大米的代谢指纹图谱数据;其中:
超高效液相色谱的色谱柱为反相硅胶柱,流动相以含有0.05~0.15%甲酸的水溶液为水相、乙腈为有机相进行线性梯度洗脱;
四级杆飞行时间质谱在ESI+模式下采集m/z 50~1200的信号,并同时收集化合物的母离子和碎片离子的信息,作为代谢指纹图谱数据;
(3)取非五常大米样品,按照与步骤(1)、(2)相同的方法进行预处理和检测,获得非五常大米的代谢指纹图谱数据;
(4)数据分析:对上述步骤获得的五常大米以及非五常大米代谢指纹图谱数据进行主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA),确定五常大米中含有而非五常大米中不含有的化合物,作为标志性化合物;
(5)取待测样品,按照与步骤(1)、(2)相同的方法进行预处理和检测,获得待测样品的代谢指纹图谱数据;
如待测样品的代谢指纹图谱数据中包括全部所述标志性化合物的数据,且这些化合物在待测样品代谢指纹图谱中的响应值与五常大米代谢指纹图谱中相应化合物的响应值相比无显著性差异,则判断所述待测样品为五常大米(即为真的五常大米);
如待测样品的代谢指纹图谱数据中未包括全部标志性化合物的数据,或包含的标志性化合物在待测样品代谢指纹图谱中的响应值与五常大米代谢指纹图谱中相应化合物的响应值相比存在显著性差异,则判断所述待测样品不是五常大米(即为假的五常大米)。
本发明所述方法的流程可参考图1所示。
为了提高所述标志化合物选择的准确性,本发明所述非五常大米样品的种类大于20种。作为本发明的优选方案,所述非五常大米包括:塞外香富硒香米、太粮靓虾王香软米、方家铺子响水大米、袁隆平珍贡米、太粮马坝龙油粘米、南北通道农家乡米、金龙鱼苏北米、华润五丰盘锦大米、陕西安康富硒糙米、香满园优选珍珠香米、华润五丰苏北大米、御道府生态大米、东北石板大米、七河源长粒粳米、七河源原香米、福临门秋田小町、七河源小町米、十月稻田小町米、江西上饶万年贡米、天地粮人有机大米、亲情沂蒙人有机大米。
本发明所述样品预处理步骤的目的是提取出大米样品的代谢产物,本发明通过大量实践发现,先采用体积比98~100∶1的水/甲酸溶液进行振荡提取,再采用体积比95~100∶2~5∶1的乙醇/水/甲酸溶液进行振荡提取,可以将大米中具有代表性的代谢产物充分提取出来,从而确保鉴定的准确性。为了使操作更简便的同时确保后续检测的准确性,本发明优选每0.1g样品加入2~3mL水/甲酸溶液振荡提取2次,收集上清液;再加入乙醇/水/甲酸溶液2~3mL振荡提取两次,收集上清液。
作为本发明的优选方案,所述预处理过程包括:磨成粉后过50目筛,每0.1g样品加入2~3mL体积比99∶1的水/甲酸溶液振荡提取2次,每次振荡提取10~20min,以转速10000rpm离心5~15min后收集上清液;再加入体积比98∶2∶1的乙醇/水/甲酸溶液2~3mL振荡提取两次,每次振荡提取10~20min,以转速10000rpm离心5~15min后收集上清液,过0.2μm滤膜,得样品溶液。
洗脱时采用特定的梯度洗脱方式,可以确保大米代谢产物被充分分离,以便于后续化合物信息的获取。具体而言,所述线性梯度洗脱时流动相的流速优选为0.45~0.6mL·min-1,洗脱过程具体为:
0~0.25min:水相的体积百分比为98%,余量为有机相;
0.25~12.25min:水相的体积百分比为98%至1%,余量为有机相;
12.25~13.0min:水相的体积百分比为1%,余量为有机相。
13.00~13.01min:水相的体积百分比为1%至98%,余量为有机相。
13.01~17.0min:水相的体积百分比为98%,余量为有机相。
所述高效液相色谱的条件还包括柱温38~40℃,进样体积为1.5~3.5μL。
本发明采用的四级杆飞行时间串联质谱可选用Waters公司的Xevo G2-S QTOF。
检测过程中质谱条件包括:离子源温度为110~120℃,锥孔电压为35~45V。脱溶剂气可选择氮气,脱溶剂气温度为540~550℃,脱溶剂气流速为850~1000L/h,碰撞气体可选择氩气。质谱过程中高碰撞能量优选从15eV到40eV。本发明采用的扫描时间优选为0.05~0.15s。
数据采集时可采用Waters公司的Masslynx 4.1软件进行实时采集,所选择的采集方式为MSE,此方式能够在同时得化合物的母离子和碎片离子的信息。
为了提高数据分析的准确性,本发明所述数据分析步骤中采用主成分分析和正交偏最小二乘判别分析结合的分析方法。例如,可应用Waters公司的Progenesis QI和EZinfo软件对原始数据进行主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘判别(OPLS-DA)分析。
在实际操作中,通过主成分分析和正交偏最小二乘判别分析得到S-Plot图,从图中选择出VIP值大于1的点,该点代表的化合物即为标志性化合物。
本发明提供的方法从代谢组学的角度出发,在一个宽泛的质量范围内(m/z 50~1200),实现了对不同产地大米中复杂的差异代谢物的非目标筛查,为实际生产以及大米销售过程中五常大米的真伪鉴定提供了有力手段。
附图说明
图1为本发明所述方法的流程图;
图2为经超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱测定的大米提取物的总离子流图;
图3为对五常大米和非五常大米做主成分分析得到的主成分分析得分图;其中,1代表五常大米,2代表非五常大米;
图4为通过OPLS-DA分析得到的S-Plot图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。
实施例
按照如下方法进行五常大米真伪检测:
(1)样品预处理:取五常大米样品,磨成粉后过50目筛,每0.1g样品加入3ml水/甲酸(99/1,v/v),室温下振荡15min,移去上清液,以转速10000rpm离心10min,再用2mL水/甲酸(99/1,v/v)提取一次,以转速10000rpm离心10min,收集上清液,再用乙醇/水/甲酸(98/2/1,v/v/v)溶液重复提取两次,收集上清液,过0.2μm滤膜,得样品溶液;
(2)用超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱对所述样品溶液进行检测,获得五常大米的代谢指纹图谱数据;其中:
超高效液相色谱的色谱柱为ACQUITYHSS T3(1.7μm,100mm×2.1mm,Waters);流动相以含有0.1%甲酸的水溶液为水相、乙腈为有机相进行线性梯度洗脱,柱温40℃,进样体积为2μL,流动相的流速为0.45mL·min-1,洗脱过程具体为:0~0.25min水相的体积百分比为98%,0.25~12.25min水相的体积百分比为98%至1%,12.25~13.0min水相的体积百分比为1%,13.00~13.01min水相的体积百分比为1%至98%,13.01~17.0min水相的体积百分比为98%;
四级杆飞行时间质谱选用Waters公司的Xevo G2-S QTOF,在ESI+模式下采集m/z50~1200的信号,并同时收集化合物的母离子和碎片离子的信息,作为代谢指纹图谱数据;其中,离子源温度为120℃,锥孔电压为40V,脱溶剂气为氮气,脱溶剂气温度为550℃,脱溶剂气流速为1000L/h,碰撞气体为氩气,质谱过程中高碰撞能量优选从15eV到40eV,数据采集时采用Waters公司的Masslynx 4.1软件进行实时采集,所选择的采集方式为MSE;
(3)取非五常大米样品,按照与步骤(1)、(2)相同的方法进行预处理和检测,获得非五常大米的代谢指纹图谱数据;
(4)数据分析:应用Waters公司的Progenesis QI和EZinfo软件,对步骤(2)获得的五常大米代谢指纹图谱数据以及步骤(3)获得的非五常大米代谢指纹图谱数据进行主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘判别(OPLS-DA)分析,确定五常大米中含有而非五常大米中不含有的化合物,作为标志性化合物;
(5)取待测样品,按照与步骤(1)、(2)相同的方法进行预处理和检测,获得待测样品的代谢指纹图谱数据。
上述鉴定过程中,获得图2(经超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱测定的大米提取物的总离子流图)以及图3(对五常大米和非五常大米做主成分分析得到的主成分分析得分图)。根据以上结果可知,本发明提供的方法采集得到的数据都在置信区间之内,数据可用。
为了明确区分出五常大米和非五常大米,采用OPLS-DA这种有监督模式的分析方法对数据进行进一步的分析处理。图4是通过OPLS-DA分析得到的S-Plot图,图中选择出VIP值大于1的点进行鉴定研究,所述VIP值大于1的点代表的化合物即为标志性化合物。化合物的鉴定结果如表1所示(由于涉及化合物较多,此处仅列出部分代表性化合物)。
表1:标志性化合物的鉴定结果
各序号代表的化合物英文名如表2所示。
表2:标志性化合物英文名
进一步对待测样品的代谢指纹图谱数据进行分析,如待测样品的代谢指纹图谱数据中包括全部所述标志性化合物的数据,且这些化合物在待测样品代谢指纹图谱中的响应值与五常大米代谢指纹图谱中相应化合物的响应值相比无显著性差异,则判断所述待测样品为五常大米;
如待测样品的代谢指纹图谱数据中未包括全部标志性化合物的数据,或包含的标志性化合物在待测样品代谢指纹图谱中的响应值与五常大米代谢指纹图谱中相应化合物的响应值相比存在显著性差异,则判断所述待测样品不是五常大米。
本实施例可成功将五常大米与其他常见大米(包括塞外香富硒香米、太粮靓虾王香软米、方家铺子响水大米、袁隆平珍贡米、太粮马坝龙油粘米、南北通道农家乡米、金龙鱼苏北米、华润五丰盘锦大米、陕西安康富硒糙米、香满园优选珍珠香米、华润五丰苏北大米、御道府生态大米、东北石板大米、七河源长粒粳米、七河源原香米、福临门秋田小町、七河源小町米、十月稻田小町米、江西上饶万年贡米、天地粮人有机大米、亲情沂蒙人有机大米)区分开。
虽然,上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验,对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之作一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种基于超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱鉴定五常大米真伪的方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)样品预处理:取五常大米样品,磨成粉后过筛,先采用体积比98~100:1的水/甲酸溶液进行振荡提取,离心取上清液后再加入体积比95~100:2~5:1的乙醇/水/甲酸溶液进行振荡提取,离心后取上清液,得样品溶液;
(2)用超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱对所述样品溶液进行检测,获得五常大米的代谢指纹图谱数据;其中:
超高效液相色谱的色谱柱为ACQUITY UPLCHSS T3 其规格为:1.7 μm,100 mm×2.1
mm,Waters,流动相以含有0.05~0.15%甲酸的水溶液为水相、乙腈为有机相进行线性梯度洗
脱;
洗脱过程具体为:0~0.25min水相的体积百分比为98%,0.25~12.25min水相的体积百分比为98%至1%,12.25~13.0min水相的体积百分比为1%;13.01~17.0 min:水相的体积百分比为98%,余量为有机相;
四级杆飞行时间质谱在ESI+模式下采集m/z 50~1200的信号,并同时收集化合物的母离子和碎片离子的信息,作为代谢指纹图谱数据;
(3)取非五常大米样品,按照与步骤(1)、(2)相同的方法进行预处理和检测,获得非五常大米的代谢指纹图谱数据;
(4)对步骤(2)获得的五常大米代谢指纹图谱数据以及步骤(3)获得的非五常大米代谢指纹图谱数据进行分析,确定五常大米中含有而非五常大米中不含有的化合物,作为标志性化合物;
(5)取待测样品,按照与步骤(1)、(2)相同的方法进行预处理和检测,获得待测样品的代谢指纹图谱数据;
如待测样品的代谢指纹图谱数据中包括全部所述标志性化合物的数据,且这些化合物在待测样品代谢指纹图谱中的响应值与五常大米代谢指纹图谱中相应化合物的响应值相比无显著性差异,则判断所述待测样品为五常大米;
如待测样品的代谢指纹图谱数据中未包括全部标志性化合物的数据,或包含的标志性化合物在待测样品代谢指纹图谱中的响应值与五常大米代谢指纹图谱中相应化合物的响应值相比存在显著性差异,则判断所述待测样品不是五常大米;
所述标志性化合物为:
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述非五常大米样品的种类大于20种。
3.根据权利要求2所述的方法,所述非五常大米包括:塞外香富硒香米、太粮靓虾王香软米、方家铺子响水大米、袁隆平珍贡米、太粮马坝龙油粘米、南北通道农家乡米、金龙鱼苏北米、华润五丰盘锦大米、陕西安康富硒糙米、香满园优选珍珠香米、华润五丰苏北大米、御道府生态大米、东北石板大米、七河源长粒粳米、七河源原香米、福临门秋田小町、七河源小町米、十月稻田小町米、江西上饶万年贡米、天地粮人有机大米、亲情沂蒙人有机大米。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述样品预处理步骤中:每0.1g样品加入2~3 mL水/甲酸溶液振荡提取2次,收集上清液;再加入乙醇/水/甲酸溶液2~3 mL振荡提取2次,收集上清液。
5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,所述样品预处理具体包括:磨成粉后过50目筛,每0.1 g样品加入2~3 mL体积比99:1的水/甲酸溶液振荡提取2次,每次振荡提取10~20 min,以转速10000 rpm离心5~15 min后收集上清液;再加入体积比98:2:1的乙醇/水/甲酸溶液2~3 mL振荡提取2次,每次振荡提取10~20min,以转速10000 rpm离心5~15 min后收集上清液,过0.2 μm滤膜,得样品溶液。
6.根据权利要求1~5任意一项所述的方法,其特征在于,所述线性梯度洗脱时流动相的流速为0.45~0.6 mL·min-1。
7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,所述高效液相色谱的条件包括:柱温38~40℃,进样体积为1.5~3.5 μL。
8.根据权利要求1~7任意一项所述的方法,其特征在于,质谱条件包括:离子源温度为110~120 ℃,锥孔电压为35~45 V;氮气作为脱溶剂气,脱溶剂气温度为540~550 ℃,脱溶剂气流速为 850~1000 L/h,碰撞气体为氩气;
和/或,高碰撞能量从15 eV到40 eV;
和/或,扫描时间为0.05~0.15 s。
9.根据权利要求1~7任意一项所述的方法,其特征在于,数据分析步骤中,采用主成分分析和正交偏最小二乘判别分析的分析方法。
10.根据权利要求9所述的方法,其特征在于,通过主成分分析和正交偏最小二乘判别分析得到S-Plot图,从图中选择出VIP值大于1的点,该点代表的化合物即为标志性化合物。
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