CN101178389B

CN101178389B - 一种用hplc指纹图谱鉴别黑米或其制品真伪的方法

Info

Publication number: CN101178389B
Application number: CN200710032113XA
Authority: CN
Inventors: 张名位; 张瑞芬; 池建伟; 魏振承; 张雁; 唐小俊
Original assignee: Agricultural Biotechnology Research Institute Guangdong Academy Of Agricultural Sciences
Current assignee: Agricultural Biotechnology Research Institute Guangdong Academy Of Agricultural Sciences
Priority date: 2007-12-05
Filing date: 2007-12-05
Publication date: 2010-12-15
Anticipated expiration: 2027-12-05
Also published as: CN101178389A

Abstract

本发明公开了一种用HPLC指纹图谱鉴别黑米或其制品真伪的方法，其包括以下步骤：(1)黑米标准指纹图谱的建立：精密称取黑米，用乙醇浸提得到黑米浸提物，然后对黑米浸提物进行脱脂处理后，用甲醇溶解脱脂物，过滤得到上样液；取上样液测定黑米HPLC标准指纹图谱；(2)分别测定不同黑米品种的HPLC指纹图谱，并进行比较，得到具有6个共有特征峰的黑米HPLC标准指纹图谱；所述的共有特征峰的保留时间RT值依次为32.2，36.6，44.1，48.9，52.6，65.5分钟；(3)以上述相同的步骤测定待测黑米或其制品的指纹图谱；(4)将待测黑米或其制品的指纹图谱与黑米标准指纹图谱对比，确定待测黑米或其制品的真伪。本发明在鉴定黑米及其制品的真伪中具有稳定、精密度高、重现性好的特点。

Description

一种用HPLC指纹图谱鉴别黑米或其制品真伪的方法

技术领域

本发明涉及一种鉴别黑米或其制品真伪的方法，尤其涉及一种用HPLC指纹图谱鉴别黑米或其制品的真伪方法。

背景技术

随着经济的发展和生活水平的提高，黑米或其制品因天然的色、香、味和良好的营养保健功能越来越受到人们的关注，黑米及其制品不断问世，并受到消费者的普遍欢迎。黑米呈色是因色素在果皮和种皮内沉积所致，其种皮部分为黑色，胚乳部分为白色，因此市面上出现了不少通过色素染色制成的假冒黑米及黑米制品，严重影响了消费者健康和黑色食品产业的健康发展。

目前关于黑米及其制品的鉴伪方法多以目测和紫外—可见光谱分析法，目测法人为因素很多，准确性不高；紫外—可见光谱法是基于黑米色素的主要成分花色苷类化合物在525～540nm之间有特征吸收峰，通过测定黑米浸泡液是否存在上述特征吸收峰可以辨别黑米的真伪。但由于某些其它天然色素或人工合成色素在该区域也存在特征吸收，例如甜菜红和苋菜红的最大吸收峰均在535nm。如果有些不法商贩用上述一类的色素对普通的白糙米进行染色，在525～540nm区域内仍可以检测到特征吸收峰，从而会影响到检测结果的准确性。因此建立可靠的黑米及其制品的真伪鉴别技术势在必行。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用HPLC指纹图谱鉴别黑米或其制品真伪的方法，该方法具有稳定、精密度高、重现性好的特点。

本发明的目的通过以下技术措施来实现：

其包括以下步骤：

(1)精密称取黑米，用乙醇浸提得到黑米浸提物，然后对黑米浸提物进行脱脂处理后，用甲醇溶解脱脂物，过滤得到上样液；取上样液测定黑米HPLC标准指纹图谱；

(2)分别测定不同黑米品种的HPLC指纹图谱，并进行比较，得到具有6个共有特征峰的黑米HPLC标准指纹图谱，所述的共有特征峰的保留时间RT值依次为32.2，36.6，44.1，48.9，52.6，65.5分钟；

(3)以上述相同的步骤测定待测的黑米或其制品的指纹图谱；

(4)将待测黑米或其制品的指纹图谱与黑米标准指纹图谱对比，确定待测黑米或其制品的真伪。

本发明所述的步骤(1)的具体过程是：

1)精密称取黑米，按料液重量体积比1∶4～1∶6(m/v)用50～70％的乙醇在常温下浸提黑米20～24小时后，过滤，将浸提液减压真空0.08-0.1MPa浓缩，得到浆状黑米浸提物；

2)将上述浸提物用双蒸水溶解至与步骤1)中所述的浸提液相同的体积，并加入等体积的石油醚萃取2～3次，得到黑米脱脂液；

3)将脱脂液减压真空浓缩，得到浆状脱脂物，再用50～60％的甲醇溶解脱脂物，并使黑米脱脂物与甲醇溶液的质量体积比为1∶2～1∶3，过0.3～0.5微米滤膜得上样液，在4℃条件下保存备用；

4)取上样液测定黑米HPLC标准指纹图谱。

所述的步骤1)～3)制备上样液的过程是一个纯化的过程，目的是脱去米皮中含有的较多的脂肪酸以及其它一些脂溶性成分，一方面减少指纹图谱中的杂峰的量另一方面可以减少杂质，提高色谱柱的使用寿命。

步骤3)中减压真空浓缩的真空度为0.08-0.1MPa。

本发明所述测定黑米HPLC标准指纹图谱的色谱条件：色谱柱为C₁₈，5μm，250×4.6mm；流动相为甲醇、0.5％甲酸和乙腈；洗脱方式为梯度洗脱，在线脱气；检测波长为254nm。

本发明测定国内外60个不同黑米品种的HPLC指纹图谱并进行比较，得到具有6个共有特征峰的黑米HPLC标准指纹图谱。

本发明与现有方法相比，具有以下的优点：

(1)本发明是根据60个国内外不同品种的黑米中主要的非营养素生物活性成分是水溶性成分，建立黑米及其制品的水溶性提取物HPLC指纹图谱，从而确定其标准指纹图谱的共有特征峰有6个，其保留时间RT值依次为32.2，36.6，44.1，48.9，52.6，65.5分钟；将测定黑米待检样品的色谱图与标准色谱图比较，即可鉴定待测黑米及其制品的真伪，具有稳定、精密度高、重现性好的特点。

(2)将黑米整个HPLC指纹图谱作为一个整体看待，注重各个共有特征峰的有无和相互关系，注重图谱的整体面貌特征，为准确鉴别黑米及其制品的真伪提供了对照标准，将为黑色食品市场的健康稳定发展做出贡献。

附图说明

图1是本发明实施例一的黑米标准指纹图谱。图中箭头所指从左到右分别是1至6号6个共有特征峰。

图2是本发明实施例一中市售黑米的HPLC指纹图谱。图中箭头所指从左到右分别是1至6号6个共有特征峰。

具体实施方式

下面结合实施实例对本发明做进一步说明。

实施例一：

1仪器、试材及药品

1.1仪器

Agilent 1200LC高效液相色谱仪，Agilent VWD紫外可变波长检测器，AgilentChemstation工作站。

1.2试材及药品：黑米样品自超市购买，乙腈、甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯。

2、黑米标准指纹图谱的建立

(1)黑米标准指纹图谱的建立：

1)精密称重黑米8.00g，用60％的乙醇40ml在常温下浸提黑米24小时后，用普通滤纸过滤，将浸提液减压真空0.09MPa浓缩，得到浆状黑米浸提物；

2)将上述浸提物用双蒸水溶解至总体积为40ml，加入40ml石油醚萃取3次，得到黑米脱脂液；

3)将脱脂液减压真空0.09MPa浓缩，得到浆状脱脂物，再用50％的甲醇溶解至20ml，过0.45微米滤膜得上样液，在4℃条件下保存备用；

4)色谱条件：色谱柱为Dikma Diamonsil

C₁₈，5μm，250×4.6mm；流动相为甲醇、0.5％甲酸和乙腈；准取吸取10μl上样液进样，记录100分钟色谱图。洗脱方式为梯度洗脱，在线脱气；检测波长为254nm。梯度洗脱方案如下表。

时间	流速	甲醇	0.5％甲酸	乙腈	曲线类型
						0510234353637395100	0.60.60.60.60.20.40.40.60.60.6	236121618182050100	969488766358585300	2361221242427500	666666666

5)按同样的方法测定60个不同黑米品种的HPLC指纹图谱并进行比较，得到具有共有特征峰的黑米HPLC标准指纹图谱，所述的共有特征峰总共有6个，其保留时间RT值依次为32.2，36.6，44.1，48.9，52.6，65.5分钟。

3、以上述相同的方法测定市售黑米或其制品的指纹图谱。

4、市售黑米真伪的辨别：取市售黑米样品的HPLC指纹图谱与黑米标准指纹图谱进行对比，确定6个共有峰均存在，其RT分别为：32.6，36.0，44.8，48.0，53.2，65.1分钟。因此可以判断此黑米样品为真的黑米。

实施例二：

与实施例一不同的是：

黑米标准指纹图谱的建立：

1)精密称重黑米10.00g，用65％的乙醇50ml在常温下浸提黑米20小时后，用普通滤纸过滤，将浸提液减压真空0.08MPa浓缩，得到浆状黑米浸提物；

2)将上述浸提物用双蒸水溶解至总体积为50ml，加入50ml石油醚萃取2次，得到黑米脱脂液；

3)将脱脂液减压真空0.08MPa浓缩，得到浆状脱脂物，再用60％的甲醇溶解至30ml，过0.5微米滤膜得上样液，在4℃条件下保存备用；

4)色谱条件：色谱柱为Hypersil ODS，5μm，250×4.6mm；流动相为甲醇、0.5％甲酸和乙腈；准取吸取10μl上样液进样，记录100分钟色谱图。

实施例三：

与实施例一不同的是：

黑米标准指纹图谱的建立：

1)精密称重黑米5.00g，用70％的乙醇30ml在常温下浸提黑米22小时后，用普通滤纸过滤，将浸提液减压真空0.1MPa浓缩，得到浆状黑米浸提物；

2)将上述浸提物用双蒸水溶解至总体积为30ml，加入30ml石油醚萃取2次，得到黑米脱脂液；

3)将脱脂液减压真空0.1MPa浓缩，得到浆状脱脂物，再用50％的甲醇溶解至12ml，过0.3微米滤膜得上样液，在4℃条件下保存备用；

4)色谱条件：色谱柱为Aglient C₁₈，5μm，250×4.6mm；流动相为甲醇、0.5％甲酸和乙腈；准取吸取10μl上样液进样，记录100分钟色谱图。

实施例四：

与实施例一不同的是：

黑米标准指纹图谱的建立：

1)精密称重黑米10.00g，用55％的乙醇45ml在常温下浸提黑米23小时后，用普通滤纸过滤，将浸提液减压真空0.09MPa浓缩，得到浆状黑米浸提物；

2)将上述浸提物用双蒸水溶解至总体积为45ml，加入45ml石油醚萃取3次，得到黑米脱脂液；

3)将脱脂液减压真空0.09MPa浓缩，得到浆状脱脂物，再用55％的甲醇溶解至20ml，过0.4微米滤膜得上样液，在4℃条件下保存备用；

4)色谱条件：色谱柱为Dikma Diamonsil

C₁₈，5μm，250×4.6mm；流动相为甲醇、0.5％甲酸和乙腈；准取吸取10μl上样液进样，记录100分钟色谱图。

实施例五：

与实施例一不同的是：

黑米标准指纹图谱的建立：

1)精密称重黑米10.00g，用60％的乙醇40ml在常温下浸提黑米24小时后，用普通滤纸过滤，将浸提液减压真空0.095MPa浓缩，得到浆状黑米浸提物；

3)将脱脂液减压真空0.095MPa浓缩，得到浆状脱脂物，再用50％的甲醇溶解至20ml，过0.45微米滤膜得上样液，在4℃条件下保存备用；

4)色谱条件：色谱柱为Hypersil ODS C₁₈，5μm，250×4.6mm；流动相为甲醇、0.5％甲酸和乙腈；准取吸取10μl上样液进样，记录100分钟色谱图。

Claims

1.一种用HPLC指纹图谱鉴别黑米或其制品真伪的方法，其特征在于：其包括以下步骤：

(3)以上述相同的步骤测定待测的黑米或其制品的指纹图谱；

(4)将待测黑米或其制品的指纹图谱与黑米标准指纹图谱对比，确定待测黑米或其制品的真伪；

所述的步骤(1)的具体过程是：

1)精密称取黑米，按料液重量体积比1∶4～1∶6用50％～70％的乙醇在常温下浸提黑米20～24小时后，过滤，将浸提液减压真空0.08-0.1MPa浓缩，得到浆状黑米浸提物；

测定黑米HPLC标准指纹图谱的色谱条件为：色谱柱为C₁₈，5μm，250×4.6mm；流动相为甲醇、0.5％甲酸和乙腈；洗脱方式为梯度洗脱，在线脱气；检测波长为254nm。

2.根据权利要求1所述的用HPLC指纹图谱鉴别黑米或其制品真伪的方法，其特征在于：测定国内外60个不同黑米品种的HPLC指纹图谱并进行比较，得到具有6个共有特征峰的黑米HPLC标准指纹图谱。