CN110297045B

CN110297045B - 一种前胡配方颗粒的特征图谱检测方法

Info

Publication number: CN110297045B
Application number: CN201910458181.5A
Authority: CN
Inventors: 周厚成; 胡昌江; 陈玉梅; 宋媛; 叶志萍; 辜新月
Original assignee: Sichuan Neo Green Pharmaceutical Technology Development Co ltd
Current assignee: Sichuan Neo Green Pharmaceutical Technology Development Co ltd
Priority date: 2019-05-29
Filing date: 2019-05-29
Publication date: 2021-07-27
Anticipated expiration: 2039-05-29
Also published as: CN110297045A

Abstract

本发明提供了一种前胡配方颗粒的特征图谱检测方法，它包括如下操作步骤：1）对照品溶液的制备；2）供试品溶液的制备；3）分别吸取对照品溶液和供试品溶液注入液相色谱仪，本发明的前胡配方颗粒的特征图谱检测方法，可以同时检测白花前胡甲素及白花前胡乙素，能用于配方颗粒的质量检测，反应出配方颗粒多成分的整体面貌，结果可靠，为前胡颗粒的质量控制提供了新方法，具有良好的应用前景。

Description

一种前胡配方颗粒的特征图谱检测方法

技术领域

本发明具体涉及一种前胡配方颗粒的特征图谱检测方法。

背景技术

前胡为伞形科植物白花前胡Peucedanumpraeruptorum Dunn的干燥根。冬季至次春茎叶枯萎或未抽花茎时采挖，是常用中药之一。《中国药典》2015年版第一部收载了该品种。前胡具有降气化痰、散风清热的功效，主要用于痰热喘满，咳痰黄稠，风热咳嗽痰多。现时广泛用于风热感冒、胸肋不畅、喘满及咳嗽等症。

中药配方颗粒是以传统单味中药饮片为原料，采用现代工艺技术和质量控制技术进行提取、浓缩、干燥、制粒技术制成颗粒剂型。它能克服汤剂煎煮费时、携带不便、不宜储存等缺点，同时质量可控，目前已被消费者大量使用。

胡轶娟. 白花前胡HPLC 指纹图谱研究[J]. 中国中医药科技.2012,19(5):437-439，对前胡药材进行了指纹图谱研究，但其HPLC检测方法只得到了6个共有峰，且特征色谱图中大量峰在短时间分离出，导致基线不平整，致使前胡中有效成分的分析不准确，影响质量判定。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种前胡配方颗粒的特征图谱检测方法，它包括如下操作步骤：

1）对照品溶液的制备：取白花前胡甲素、白花前胡乙素对照品，分别加甲醇溶解，作为对照品溶液；

2）供试品溶液的制备：取供试品，加甲醇提取，过滤，取续滤液，得供试品溶液；

3）分别吸取对照品溶液和供试品溶液注入液相色谱仪，色谱条件如下：

色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：以甲醇为流动相A，以水为流动相B梯度洗脱；梯度洗脱程序如下：

。

进一步地，步骤1）所述对照品白花前胡甲素、白花前胡乙素浓度分别为每1ml含40-60μg、5-20μg，优选每1ml含50μg、10μg。

进一步地，步骤2）所述供试品与甲醇的质量体积比为0.2-1.2g：25mL，优选0.5g：25mL。

进一步地，步骤2）所述提取为超声提取，时间30min。

进一步地，步骤3）所述的分别注入液相色谱仪的对照品溶液和供试品溶液量为10～20μl，优选10μl。

进一步地，步骤3）所述色谱条件的波长为321nm，柱温为30℃，流动相流速为1.00ml/min，理论板数按白花前胡甲素计算应不低于3000。

进一步地，步骤3）所述十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱为Agilent ZORBAX-SB-C185μm 250×4.6mm、Kromasil C18 5μm 4.6×250mm或Phenomenex Luna 5um C18(2)100A4.6×250mm。

更进一步地，所述方法得到的特征图谱中应呈现8个特征峰，其中2个峰应分别与相应的对照品峰保留时间相同，与白花前胡甲素对照品相应的峰为S峰，与白花前胡乙素对照品相应的峰为峰8，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±8％之内。规定值为：峰1：0.358、峰2：0.481、峰3：0.520、峰4：0.810、峰5：0.976、峰6，S：1.000、峰7：1.034、峰8：1.119。

本发明的前胡配方颗粒的特征图谱检测方法，可以同时检测白花前胡甲素及白花前胡乙素，能用于配方颗粒的质量检测，反应出配方颗粒多成分的整体面貌，结果可靠，为前胡颗粒的质量控制提供了新方法，具有良好的应用前景。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1 白花前胡甲素紫外吸收光谱图

图2 白花前胡乙素紫外吸收光谱图

图3 前胡配方颗粒不同波长色谱图

图4 前胡配方颗粒3D图

图5 柱温考察色谱图

图6 流速考察

图7 不同溶剂提取色谱图

图8 不同提取方式色谱图

图9 不同提取时间色谱图

图 10前胡对照药材特征图谱

图11 色谱峰指认

图12 不同仪器考察

图13 不同色谱柱考察

图14 3批前胡配方颗粒特征图谱验证图

图15 前胡配方颗粒对照特征图谱（峰6(S)：白花前胡甲素；峰8：白花前胡乙素）

图16 不同色谱条件得到的前胡颗粒特征图谱比较（A:参考文献方法；B:本发明方法）

具体实施方式

1、材料、试剂与仪器

1.1实验仪器

高效液相色谱仪：岛津20AT型高效液相色谱仪、安捷伦1260型高效液相色谱仪、Waters 2695-2996型高效液相色谱仪；

电子天平：ME204E/02、MS205DU、XP26(梅特勒-托利多仪器有限公司)；

超纯水机：细胞型1810A（上海摩勒科学仪器有限公司）；

超声波清洗器：KQ5200DB型（600W，40KHz；昆山市超声仪器有限公司）；

色谱柱： Agilent ZORBAX-SB-C18 5μm 250×4.6mm、phenomenex Luna 5μm C18(2)100A 250×4.60mm、Kromasil 100-5-C18 5μm 250×4.6mm。

1.2试剂及试药

白花前胡甲素（中国食品药品检定研究院，批号：111711-200602，含量以100%计），白花前胡乙素（中国食品药品检定研究院，批号：111904-201203，含量以98.0%计），

甲醇（SIGMA公司，色谱纯）；水为超纯水，其它试剂均为分析纯。

前胡配方颗粒SY1807001、SY1807002、SY1807003。

实施例1 前胡配方颗粒特征图谱

1）对照品溶液的制备：

取白花前胡甲素、白花前胡乙素对照品，加甲醇分别制成每1ml各含50μg、10μg的溶液，即得；

2）供试品溶液的制备：

取前胡配方颗粒0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，称定重量，超声30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

3）特征图谱的测定

分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，得到色谱图；

色谱条件如下：

色谱柱：Agilent ZORBAX-SB-C18 5μm 250×4.6mm；以甲醇为流动相A，以水溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；柱温为30℃；流速为每分钟1.0ml；检测波长：321nm。

Figure 835380DEST_PATH_BDA0002077238020000041

4）分析特征图谱

前胡配方颗粒特征图谱中呈现8个特征峰，其中2个峰应分别与相应的对照品峰保留时间相同，与白花前胡甲素对照品相应的峰为S峰，与白花前胡乙素对照品相应的峰为峰2，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±8％之内。其规定值为：峰1：0.358、峰2：0.481、峰3：0.520、峰4：0.810、峰5：0.976、峰6，S：1.000、峰7：1.034、峰8：1.119。

以下通过试验例具体说明本发明的有益效果：

试验例1 色谱条件筛选

1、色谱条件与系统适用性试验

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm）以甲醇为流动相A，以水溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；柱温为30℃；流速为每分钟1.0ml；检测波长：321nm。理论板数按白花前胡甲素峰计算应不低于3000。

Figure 460790DEST_PATH_BDA0002077238020000051

。

2、波长选择

在以上拟定的实验条件基础上，利用二极管阵列检测器分别对白花前胡甲素、白花前胡乙素供试品溶液进行全波段扫描，并分别提取供试品溶液在290nm、310nm、321nm、350nm波长下的色谱图。见图1-4。

结果表明，结果表明，在检测波长为321nm时色谱峰信息量较大，色谱图基线更平稳，故检测波长确定为321nm。

3、柱温考察

在以上拟定的实验条件基础上，分别对柱温为25℃、30℃、35℃时进行考察。见图5、表1。

表1 柱温考察—特征峰相对保留时间比值

Figure 698742DEST_PATH_BDA0002077238020000052

结果表明，柱温在25-35℃时，色谱图峰形均较为对称，分离度均好，且峰相对保留时间均小于3%，方法耐用性较好。故确定柱温为30℃进行后续考察。

4、流速考察

在以上拟定的实验条件基础上，分别对流速为0.8ml/min、1ml/min、1.2 ml/min时进行了考察。见图6，表2。

表2 流速考察—特征峰相对保留时间

结果表明，流速分别为0.8ml/min、1.0ml/min、1.2ml/min时，各特征峰的相对保留时间RSD为0.16～7.56%，在流速为1.0ml/min时，色谱图峰形较好，分离度适中。故流速确定为1.0ml/min。

5 对照品溶液的制备

取白花前胡甲素、白花前胡乙素对照品适量，加甲醇分别制成每1ml各含50μg、10μg的溶液，即得。

6供试品溶液的制备

6.1提取溶剂考察：考察了乙醇、甲醇、50%甲醇、水作为提取溶媒，结果表明，用甲醇作为提取溶剂所得的色谱峰信息量大，分离度好，故选用甲醇作为提取溶剂。见图7。

6.2提取方式考察：比较了回流提取与超声提取，色谱峰信息大致相同，最终选择操作简便的超声进行提取。见图8。

6.3提取时间考察：比较了超声提取20分钟、30分钟、40分钟，为了保正充分提取，最终选择超声提取30分钟。见图9。

6.4最终确定供试品制备方法：取本品颗粒约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，称定重量，超声30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

试验例2 方法学考察

1色谱峰指认

供试品溶液的制备：按以上拟定的实验条件，制备前胡配方颗粒供试品溶液。

对照品溶液的制备：取白花前胡甲素、白花前胡乙素对照品适量，加甲醇分别制成每1ml各含50μg、10μg的溶液，即得。

对照药材溶液的制备：取前胡对照药材约2.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水50ml，煎煮30分钟，放冷，滤过，取续滤液，蒸干，加甲醇25ml，超声30min，滤过，即得。

阴性对照溶液的制备：按以上拟定的实验条件，制备缺前胡配方颗粒阴性对照溶液。

对前胡配方颗粒特征图谱峰进行定位。见图10-图11。

2精密度试验

取前胡配方颗粒（批号：1702011）供试品溶液，按拟定实验方法连续进样6次，每次10μl，计算各特征峰的相对保留时间及相对峰面积。见表3-4。

表3 精密度考察-保留时间

表4 精密度考察-峰面积

结果表明，该仪器精密度良好。

3重复性考察

精密称取前胡配方颗粒（批号：1702011）6份，按拟定实验方法进行制备及测定。见表5、表6。

表5重复性考察-相对保留时间比值

表6重复性考察-相对峰面积比值

结果表明，该方法重复性好。

4中间精密度考察

4.1不同仪器考察

在以上拟定的实验条件基础上，分别精密称取前胡配方颗粒（批号：1702011）两份，制备供试品溶液，分别在Waters 2695-2996型、岛津LC-20AT、安捷伦1260型高效液相色谱仪上进行测定。见图12、表7-8。

表7 仪器耐用性考察-相对保留时间比值

Figure 731599DEST_PATH_BDA0002077238020000101

表8 仪器耐用性考察-相对峰面积比值

Figure 332345DEST_PATH_BDA0002077238020000102

结果表明，用上述3种仪器对供试品进行检测时，中间精密度良好。

4.2不同人员和时间考察

在以上拟定的实验条件基础上，由不同人员（A、B）在不同时间（T1 、T2）分别精密称取前胡配方颗粒（批号：1702011）各两份，制备供试品，进行测定。见表9-10。

表9人员和时间考察-相对保留时间比值

Figure 326845DEST_PATH_BDA0002077238020000111

表10 人员和时间考察-相对峰面积比值

Figure 405660DEST_PATH_BDA0002077238020000121

结果表明，由不同的人员在不同的时间对同一个样品进行测定，方法稳定性较好。

5耐用性考察

5.1色谱柱耐用性考察

在以上拟定的实验条件基础上，分别对色谱柱为Agilent ZORBAX-SB-C18 5μm250×4.6mm（安捷伦）、Kromasil C18 5μm 4.6×250mm、Phenomenex Luna 5um C18(2)100A4.6×250mm。进行考察。见图13，表11-12。

表11 色谱柱耐用性考察-相对保留时间比值

Figure 488324DEST_PATH_BDA0002077238020000131

表12 色谱柱耐用性考察-相对峰面积比值

Figure 932074DEST_PATH_BDA0002077238020000132

结果表明，用上述3种色谱柱对样品进行检测，特征峰相对保留时间的RSD在0.48%～6.17%，特征峰相对峰面积的RSD在1.67%～6.08%。

5.2稳定性

在以上拟定的实验条件基础上，取同一供试品溶液，分别于0h，4h，8h，12h，16h，24h时测定。见表13-14。

表13 稳定性考察-保留时间

Figure 679451DEST_PATH_BDA0002077238020000141

表14稳定性考察-峰面积

结果表明，其相对应的特征峰保留时间的RSD在0.08 %～0.11%，样品溶液在24小时内较稳定。

综上所述，各特征峰相对保留时间的RSD在以上各项考察中均符合要求，该方法良好。将上述8个特征峰纳入后续考察。

6. 特征峰的确定及对照图谱的建立

6.1 3批前胡配方颗粒验证结果

采用拟定的方法对本品3批样品进行特征图谱的测定，计算相对保留时间、相对峰面积。见图14，表15-16。

表15 3批前胡配方颗粒相对保留时间

表16 3批前胡配方颗粒相对峰面积

根据相对保留时间稳定及各批次样品均能检出且峰相对较高的原则，共选择了8个重复性较好的峰作为特征峰。结果表明，当峰6作为S峰时，3批次前胡配方颗粒8个特征峰相对保留时间RSD均小于1%。

6.2相对保留时间规定值限度的制定

方法学各考察项目及验证结果汇总见表17-18：

表17 方法学各项目结果RSD%汇总标准—相对保留时间

方法学	峰1	峰2	峰3	峰4	峰5	峰6（S）	峰7	峰8
									柱温	2.39	1.77	1.15	0.37	0.06	0	0.10	0.27
流速	7.56	4.46	3.65	1.36	0.16	0	0.19	0.76
									精密度	0.04	0.03	0.03	0.01	0.01	0.01	0.01	0.02
重复性	0	0	0	0	0.04	0	0	0
									稳定性	0.11	0.07	0.08	0.11	0.09	0.09	0.08	0.08
中间精密度	0.11	0.11	0.08	0	0.06	0	0	0
									色谱柱耐用性	6.17	0.48	2.06	3.81	0.21	0	0.76	2.49
不同仪器	11.42	8.58	6.51	1.4	0.1	0	0.19	0.58
									3批验证	0	0	0	0	0	0	0	0

表18 方法学各项目结果RSD%汇总标准—相对峰面积

方法学	峰1	峰2	峰3	峰4	峰5	峰6（S）	峰7	峰8
									精密度	10.09	0.38	1.24	0.76	0.69	0.65	0.73	1.21
重复性	4.54	3.00	8.42	2.43	1.81	0	2.36	1.69
									稳定性	9.49	1.18	2.60	1.31	0.61	0.46	1.12	0.78
中间精密度	1.78	4.81	3.87	1.68	1.81	0	1.26	1.76
									色谱柱耐用性	4.68	2.97	26.55	5.62	6.08	0	1.67	5.01
不同仪器	8.51	17.70	16.34	5.85	11.04	0	5.23	6.51
									3批验证	7.17	4.62	6	2.12	2.07	0	2.04	2.11

由上表可知流速对峰1的影响最大，仪器和色谱柱耐用性对峰1影响较大，为了增加方法的重现性和适用性，故将各峰的相对保留时间规定值暂定为8%。

最终规定：供试品特征图谱中应呈现8个特征峰，其中与白花前胡甲素对照品相应的峰为S峰。计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±8％之内。规定值为：0.358（峰1）、0.481（峰2）、0.520（峰3）、0.810（峰4）、0.976（峰5）、1.000峰6（S）、1.034（峰7）、1.119（峰8）。

采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）对3批前胡配方颗粒进行合成，建立了前胡配方颗粒特征图谱的对照图谱。见图15。

实施例3 对比试验

供试品溶液：取前胡配方颗粒0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，称定重量，超声30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

本发明色谱条件：色谱柱：Agilent ZORBAX-SB-C18 5μm 250×4.6mm；以甲醇为流动相A，以水溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；柱温为30℃；流速为每分钟1.0ml；检测波长：321nm。

时间（分钟）	流动相A（%）	流动相B（%）
			0～20	15→45	85→55
20～65	45→95	55→5
			65～70	95	5

对比色谱条件：参考现有报道的色谱条件:色谱柱：YMC ODS-A C18(250×4.6mm，5 μm)；流动相：A相（甲醇）：B相（水），按下表中的规定进行梯度洗脱；柱温为30℃；流速为 1.0ml/min；检测波长：350nm;

时间（分钟）	流动相A（%）	流动相B（%）
			0～30	30→40	70→60
30～40	40→65	60→35
			40～60	65→75	35→25
60～70	75→100	25→0
			70～80	100→100	25→0

分别吸取供试品溶液10μl注入液相色谱仪，用上述色谱条件分析，得色谱图16，比较图16A、图16B可见：本发明方法得到的色谱图中基线更平整、色谱峰的分离度更高，能够用于识别的特征峰更多，更能反映出配方颗粒多成分的整体面貌。

综上，本发明的前胡配方颗粒的特征图谱检测方法，可以同时检测白花前胡甲素及白花前胡乙素，并能指认出8个特征峰，能全面反应出配方颗粒的整体面貌，结果可靠，为前胡颗粒的质量控制提供了新方法。

Claims

1.一种前胡配方颗粒的特征图谱检测方法，其特征在于：它包括如下操作步骤：

时间，min 流动相A，% 流动相B，% 0 ~ 20 15→45 85→55 20～65 45→95 55→5 65～70 95 5

步骤2）所述供试品与甲醇的质量体积比为0.2-1.2g:25mL。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤1）所述对照品白花前胡甲素、白花前胡乙素浓度分别为每1ml含 40-60μg、5-20μg。

3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于：步骤1）所述对照品白花前胡甲素、白花前胡乙素浓度分别为每1ml含50μg、10μg。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤2）所述供试品与甲醇的质量体积比为0.5g:25mL。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤2）所述提取为超声提取，时间30min。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤3）所述的分别注入液相色谱仪的对照品溶液和供试品溶液量为10～20μl。

7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于：步骤3）所述的分别注入液相色谱仪的对照品溶液和供试品溶液量为10μl。

8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤3）所述色谱条件的波长为321nm，柱温为30℃，流动相流速为1.00ml/min，理论板数按白花前胡甲素计算应不低于3000。

9.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤3）所述十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱为Agilent ZORBAX-SB-C18 5μm 250×4.6mm、Kromasil C18 5μm 4.6×250mm或Phenomenex Luna 5um C18(2)100A 4.6×250mm。

10.根据权利要求1-7任一项所述的检测方法，其特征在于：所述方法得到的特征图谱中应呈现8个特征峰，其中2个峰应分别与相应的对照品峰保留时间相同，与白花前胡甲素对照品相应的峰为S峰，与白花前胡乙素对照品相应的峰为峰8，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±8％之内；规定值为：峰1：0.358、峰2：0.481、峰3：0.520、峰4：0.810、峰5：0.976、峰6，S：1.000、峰7：1.034、峰8：1.119。