CN109358120B - 一种槐角制剂的特征图谱检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种槐角制剂的检测方法，包括如下操作步骤：1)对照品溶液的制备：2)供试品溶液的制备：3)检测。本发明能用于质量鉴别的种类更广，适用于槐角不同制剂类的中药检测，为槐角制剂的质量判定提供了新方法。

Description

一种槐角制剂的特征图谱检测方法

技术领域

本发明具体涉及一种槐角制剂的特征图谱检测方法。

背景技术

槐(国槐)，落叶乔木，高15‐25米，胸径可达1米。树冠圆球形或阔卵形，树皮粗糙，有不规则的纵裂，暗灰色，内皮鲜黄色，有嗅味。奇数羽状复叶互生，叶柄基部膨大，叶轴有毛，小叶片7‐17，小叶柄有毛；托叶镰刀状，小叶片卵状披针形或卵状长圆形，先端具细突尖，全缘，基部圆形或宽楔形，上面深绿色，平滑，下面白绿色，伏生白毛，主脉显著，侧脉不明显。顶生大型圆锥花序，花梗及小花梗均有毛；萼钟形；花冠蝶形，黄白色；雄蕊10，离生或基部稍连合，花丝不等长；子房上位，筒状，有细长毛，花柱弯曲。荚果圆柱形，无毛，绿色，肉质不开裂，下垂，果先端有细尖喙状物，种子间明显缢缩呈念珠状，有1‐6个种子。种子棕黑色，肾形。多生于温带，土层深厚、湿润、肥沃、排水良好，一般为中性及微酸性的砂质壤土中，常栽于街道两旁及庭院。在我国分布较广，南北各地普遍栽培，尤以黄土高原及华北平原最为常见。

中药槐角系豆科植物槐(Sophora japonica L.)的干燥成熟果实，系我国重要的传中药之一，始载于《神农本草经》，列为上品。性寒、味苦、归肝、大肠经。传统医学认为槐角具有清热泻火、凉血止血的功效，用于肠热便血、痣肿出血，肝热头疼、眩晕目赤，为《中华人民共和国药典》历版收载品种。近年来国内外医药工作者对其进行多方面的研究。槐角现代炮制方法多样，制剂种类多，但《中国药典》2015年版一部项下槐角质量标准中的鉴别方法只以槐角苷为对照品，通过高液相色谱法鉴别，方法单一，准确度不高，也不能用于槐角制剂类中药检测。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种新的槐角制剂的检测方法。

本发明槐角制剂的检测方法，它包括如下操作步骤：

1)对照品溶液的制备：

取芦丁、槐角苷、染料木素对照品，加甲醇溶解，作为对照品溶液；

2)供试品溶液的制备：

槐角饮片、槐角配方颗粒供试品：取供试品，乙醇提取，过滤，吸取滤液用甲醇稀释，作为供试品溶液；

槐角标准汤液供试品：取槐角饮片加水浸泡，煎煮，滤过，得水煎液，用水定容，作为供试品溶液；

3)检测：

分别吸取对照品溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪进行检测；

色谱条件如下：

检测波长：260nm；

色谱柱：C18色谱柱；

流动相:流动相A为乙腈，流动相B为0.1％磷酸溶液，梯度洗脱，梯度洗脱的程序为：0～20min，87％～76％A；20～30min，76％～50％A；30～50min，50％～50％A。

步骤1)所述芦丁、槐角苷、染料木素对照品加甲醇配置的对照品溶液浓度为50μg/ml。

步骤2)中所述乙醇为70％的乙醇，所述提取为超声提取；步骤2)所述槐角配方颗粒待测样品与乙醇的质量体积比为1g:125mL，所述槐角饮片待测样品与乙醇的质量体积比为1g:12.5mL，所述槐角配方颗粒、槐角饮片供试品滤液与甲醇稀释比例为1:5；

步骤2)中制备槐角标准汤液供试品时，加水煎煮2次，第一次加的水为槐角标准汤液供试品的12倍ml/g，加的水为槐角标准汤液供试品的12倍ml/g。

步骤3)所述C18色谱柱为Agilent 5 TC‐C18(2)250*4.6mm。

步骤3)所述的色谱条件的柱温为25℃。

步骤3)所述的色谱条件的流速为1.00ml·min^‐1。

步骤3)所述的色谱条件的进样量为10μL；步骤3)所述的色谱条件的理论板数按槐角苷峰计算应不低于3000。

步骤3)检测得到的图谱，以与槐角苷对照品峰相应的峰为S峰，在如下5个保留时间具有峰：0.695、0.759、0.976、1.000、1.347。

所述方法是检测槐角制剂的芦丁、槐角苷、染料木素含量的方法。

本发明的一种槐角制剂的特征图谱检测方法，适用于槐角配方颗粒、槐角药材，槐角饮片，槐角标准汤液的正伪品鉴别，结果可靠，且能够检测的槐角制剂种类多，还可以检测槐角制剂中芦丁、槐角苷、染料木素的含量，具有良好的应用前景。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1 10批槐角配方颗粒特征图谱

图2槐角配方颗粒对照图谱，峰2：芦丁，峰4(S)：槐角苷，峰5：染料木素

图3槐角配方颗粒3D色谱图

图4槐角配方颗粒柱温考察色谱图

图5槐角配方颗粒流动相考察色谱图

图6槐角配方颗粒色谱峰指认图

图7槐角配方颗粒色谱柱耐用性考察色谱图柱1.Diamonil C18(2)5μ250*4.6mm，柱2.Kromasil C18 5μ250*4.6mm，柱3.Agilent 5 TC‐C18(2)250*4.6mm

图8饮片1特征图谱峰2.芦丁，峰4(S).槐角苷，峰5.染料木素

图9饮片2特征图谱峰2.芦丁，峰4(S).槐角苷，峰5.染料木素

图10标准煎1特征图谱峰2.芦丁，峰4(S).槐角苷，峰5.染料木素

图11标准煎2特征图谱峰2.芦丁，峰4(S).槐角苷，峰5.染料木素

图12标准煎3特征图谱峰2.芦丁，峰4(S).槐角苷，峰5.染料木素

图13标准煎3特征图谱峰2.芦丁，峰4(S).槐角苷，峰5.染料木素

具体实施方式

实施例1槐角配方颗粒特征图谱

1)、对照品溶液的制备：

分别取芦丁、槐角苷、染料木素对照品，加甲醇制成各含50μg/ml的溶液,作为对照品溶液；

2)、供试品溶液的制备：

分别取10个批次槐角配方颗粒，研细，各取0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％乙醇25ml，称定重量，超声处理(功率300W，频率25kHz)45分钟，取出，放冷，再称定重量，用70％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液2ml，置10ml容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

3)、特征图谱的测定

分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图；

色谱条件如下：

检测波长：260nm；

色谱柱：C18色谱柱；

流动相:乙腈(A)和0.1％磷酸溶液(B)，梯度洗脱(0～20min，87％～76％A；20～30min，76％～50％A；30～50min，50％～50％A)；

采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)对10批样品进行合成，建立了槐角配方颗粒特征图谱的对照图谱，见图1，图2。

槐角配方颗粒特征图谱中呈现5个特征峰，其中3个峰应分别与相应的对照品峰保留时间相同，与槐角苷对照品峰相应的峰为S峰，计算特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±5％之内。规定值为：0.695(峰1)、0.759(峰2)、0.976(峰3)、1.000(峰S)、1.347(峰5)。见表1：

表1 10批槐角配方颗粒相对保留时间

以下通过试验例具体说明本发明的有益效果：

试验例1液相特征图谱法

1、材料、试剂与仪器

1.1实验仪器

安捷伦1200型高效液相色谱仪(G1312B型二元泵，G1315C型DAD检测器)；电子天平：BP‐211D(Sautoris，德国)d＝0.1mg/0.01mg,max＝210g/80g；KQ5200DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；色谱柱：Agilent 5 TC‐C18(2)250*4.6mm。

1.2试剂及试药

乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。槐角苷(中国药品生物制品检定所111695‐200501)，芦丁(中国药品生物制品检定所100080‐200707，含量为92.5％)，染料木素(中国药品生物制品检定所111704‐201302，含量为99.1％)。槐角配方颗粒：四川新绿色药业科技发展股份有限公司提供，批号为1411103。

2、供试品溶液的制备考察

2.1提取溶剂考察：考察了甲醇，70％甲醇、乙醇，70％乙醇、作为提取溶媒，结果表明，用70％乙醇作为提取溶剂所得的色谱峰信息量大，分离度好，故选用70％乙醇作为提取溶剂，同含量测定一致。

2.2提取方法考察：考察了用70％乙醇分别对样品进行回流、超声、静置过夜3中处理方法，结果表明，超声比回流和静置过夜的含量提取都高，且超声操作简便、无污染，故选用超声提取方法作为本实验的提取方法，同含量测定一致。

2.3提取时间考察：比较了用70％乙醇提取15分钟、30分钟、45分钟、60分钟，结果表明：超声提取45分钟即可充分提取，故选用超声提取时间45分钟，同含量测定一致。

2.4最终确定供试品制备方法：取本品颗粒，研细，取0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％乙醇25ml，称定重量，超声处理(功率300W，频率25kHz)45分钟，取出，放冷，再称定重量，用70％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液2ml，置10ml容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

3、色谱条件与系统适用性试验

3.1波长选择：利用DAD检测器对190～400nm进行全波段扫描，得到3D色谱图，在260nm下的色谱峰分数较多且各峰之间的分离度较好，信息量大，故检测波长确定为260nm。见图3。

3.2柱温考察：比较了25℃，30℃，35℃的色谱图，结果显示25℃的色谱峰峰形最为对称，分离度最好，故柱温确定为25℃。见图4。

3.3流动相选择：本实验考察了4种不同流动相的分离效果，分别为：(1)乙腈‐水梯度洗脱；(2)乙腈‐0.05％磷酸梯度洗脱；(3)乙腈‐0.1％磷酸梯度洗脱；(4)乙腈‐0.2％磷酸梯度洗脱。结果表明：流动相3分离条件下色谱峰多，且理论板数、分离度、对称性均更好，故将流动相3作为槐角配方颗粒特征图谱测定方法的流动相。结果如图5。

十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.1％磷酸溶液为流动相A；以乙腈为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为260nm，记录40分钟的色谱图。理论板数按槐角苷峰计算应不低于3000。见表2。

表2流动相梯度洗脱表

4、色谱峰的指认

采用芦丁、槐角苷、染料木素对照品进行定位，结果表明：峰2为芦丁，峰4为槐角苷，峰5为染料木素。见图6。

5、方法学考察

5.1进样精密度试验

取槐角配方颗粒(批号：1411103)供试品溶液，连续进样6次，每次10μl，以峰1、峰2(芦丁)、峰3、峰5(染料木素)作为指标峰，计算同峰S(槐角苷)的相对保留时间及相对峰面积，结果相对保留时间及相对峰面积的RSD均小于2.0％，表明该方法进样精密度良好。见表3、4。

表3进样精密度考察—特征峰相对保留时间比值

表4进样精密度考察—特征峰相对峰面积比值

5.2重复性考察

精密称取槐角配方颗粒(批号：1411103)6份，按照拟定方法进行制备及测定，结果各指标特征峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD均小于2.0％，表明该方法重复性好。见表5、6。

表5重复性考察—特征峰相对保留时间比值

表6重复性考察—特征峰相对峰面积比值

5.3溶液稳定性考察

取同一供试品溶液，分别于0，2、4，8，16，24h测定，检测40min内的色谱图，对其中的特征峰进行分析，其相对应的色谱峰相对保留时间均小于2.0％，特征峰的相对峰面积的RSD均小于2.0％，结果表明供试品溶液在24h内稳定。见表7、8。

表7稳定性考察—特征峰相对保留时间

表8稳定性考察—特征峰相对峰面积比值

5.4色谱柱耐用性

采用不同品牌的C18色谱柱按照拟定的方法对本品进行特征图谱检测，结果部分色谱峰分离度不能达标，且特征峰的相对保留时间超出规定范围，结果表明本方法对不同品牌色谱柱的耐用性较差，因此应固定色谱柱进行测定。最终标准正文中固定Agilent 5TC‐C18(2)250*4.6mm这一品牌色谱柱进行检测。见图7。

试验例2相关性考察

1.实验仪器

Agilent 1200series高效液相色谱仪；色谱柱Agilent 5 TC‐C18(2)250*4.6mm。

2.试剂与试药

乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯；槐角苷(中国药品生物制品检定所111695‐200501)，芦丁(中国药品生物制品检定所100080‐200707，含量为92.5％)，染料木素(中国药品生物制品检定所111704‐201302，含量为99.1％)；槐角配方颗粒：四川新绿色药业科技发展股份有限公司提供，批号为1411103。

3.供试品溶液及对照品溶液的制备

3.1槐角饮片：取本品粗粉2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％乙醇25ml，称定重量，超声处理(功率300W，频率25kHz)45分钟，放冷，再称定重量，用70％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液2ml，置10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

3.2标准水溶液：取槐角饮片100g，第一次加12倍水，浸泡30分钟，煎煮30分钟，滤过，第二次加10倍水，煎煮20分钟，滤过，合并水煎液，用水定容至1000ml，即得。

3.3槐角颗粒溶液：取本品，研细，取0.2g，精密加入70％甲醇25ml，称定重量，超声处理(功率300W，频率25kHz)45分钟，放冷，再称定重量，用70％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液2ml，置10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

3.4对照品溶液的制备：取芦丁、槐角苷、染料木素对照品，加甲醇制成每1ml各含50μg的溶液，即得。

3.5对照品溶液的制备取槐角苷对照品，精密称定，加甲醇制成每1ml含50μg的溶液，即得。

4.特征图谱的测定

分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，按照槐角配方颗粒特征图谱法的色谱条件，记录色谱图；结果见图8～13。

结果表明：颗粒和标准煎剂中的5个特征峰均能在饮片中检出，说明这些成分都来源于饮片，同时颗粒和标准煎剂中都能检出5个特征峰，说明颗粒和标准煎剂的有效成分基本一致。

实验结果说明，槐角配方颗粒、槐角药材，槐角饮片，槐角标准汤液的正伪品鉴别，结果可靠，且能够检测的槐角制剂种类多，还可以检测槐角制剂中芦丁、槐角苷、染料木素的含量。

Claims (9)

1.一种槐角制剂的检测方法，其特征在于：它包括如下操作步骤：

1)对照品溶液的制备：

取芦丁、槐角苷、染料木素对照品，加甲醇溶解，作为对照品溶液；

2)供试品溶液的制备：

槐角饮片、槐角配方颗粒供试品溶液的制备：取供试品，乙醇提取，过滤，吸取滤液用甲醇稀释，作为供试品溶液；

槐角标准汤液供试品溶液的制备：取槐角饮片加水浸泡，煎煮，滤过，得水煎液，用水定容，作为供试品溶液；

3)检测：

分别吸取对照品溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪进行检测；

色谱条件如下：

检测波长：260nm；

色谱柱：C18色谱柱；

柱温为25 ℃；

流动相:流动相A为乙腈，流动相B为0.1％磷酸溶液，梯度洗脱，梯度洗脱的程序为：0～20min，87％～76％A；20～30min，76％～50％A；30～50min，50％～50％A。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤1)所述芦丁、槐角苷、染料木素对照品加甲醇配置的对照品溶液浓度为50μg/ml。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤2)中所述乙醇为70％的乙醇，所述提取为超声提取；步骤2)所述槐角配方颗粒供试品与乙醇的质量体积比为1g:125mL，所述槐角饮片供试品与乙醇的质量体积比为1g:12.5mL，所述槐角配方颗粒、槐角饮片供试品滤液与甲醇稀释比例为1:5。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤2)中制备槐角标准汤液供试品时，加水煎煮2次，第一次加的水为槐角标准汤液供试品的12倍ml/g，加的水为槐角标准汤液供试品的12倍ml/g。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤3)所述C18色谱柱为Agilent 5TC-C18(2)250*4.6mm。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤3)所述的色谱条件的流速为1.00ml·min ^-1。

7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤3)所述的色谱条件的进样量为10μL；步骤3)所述的色谱条件的理论板数按槐角苷峰计算应不低于3000。

8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤3)检测得到的图谱，以与槐角苷对照品峰相应的峰为S峰，在如下5个相对保留时间具有峰：0.695、0.759、0.976、1.000、1.347。

9.根据权利要求1～8任一项所述的检测方法，其特征在于：所述方法是检测槐角制剂的芦丁、槐角苷、染料木素含量的方法。

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