CN108663440A

CN108663440A - 裸花紫珠药材uplc指纹图谱构建方法及标准指纹图谱

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Publication number: CN108663440A
Application number: CN201710210983.5A
Authority: CN
Inventors: 宋潇; 黄胜; 谷陟欣; 邓芸; 叶惠煊; 周良
Original assignee: HAINAN JIUZHITANG PHARMACY CO Ltd; Jiuzhitang Co Ltd
Current assignee: HAINAN JIUZHITANG PHARMACY CO Ltd; Jiuzhitang Co Ltd
Priority date: 2017-03-31
Filing date: 2017-03-31
Publication date: 2018-10-16
Anticipated expiration: 2037-03-31
Also published as: CN108663440B

Abstract

本发明提供一种裸花紫珠药材的UPLC指纹图谱的构建方法以及通过该方法获得的裸花紫珠药材的标准指纹图谱。本发明的裸花紫珠药材的UPLC指纹图谱的构建方法包括制备供试样品溶液的步骤和超高效液相色谱分析步骤。本发明的方法简单、色谱分析条件容易实现、精密度高，而且分析结果的稳定性和重现性较好，与现有技术的其它测试分析方法相比，缩短了在线分析时间，节省了材料成本和时间成本。

Description

裸花紫珠药材UPLC指纹图谱构建方法及标准指纹图谱

技术领域

本发明涉及药物分析技术领域，尤其是涉及裸花紫珠药材的超高效液相色谱(UPLC)指纹图谱的构建方法及其标准指纹图谱。

背景技术

裸花紫珠(Callicarpa nudiflora Hook.etAm.)是马鞭草科(Varbenaceae)紫珠属(Callicarpa L.) 的干燥叶和带叶的嫩枝，是一种常用的海南传统民族药材，因主要生长在海南黎族地区，也被称为黎药。裸花紫珠性味苦、微辛、平。归脾、胃，肝经。具有散瘀止血、解毒消肿的功效，主治衄血、咳血、吐血、便血、跌打瘀肿、外伤出血、水火烫伤、疮毒溃烂等。

现今市场上裸花紫珠基源应用混乱，同物异名、同名异物现象也较为严重，所以作为中药材使用的裸花紫珠存在质量控制不稳定、并且难以进行定性和定量分析等问题。中药指纹图谱是指中药样本经光谱或色谱等现代分析技术得到的中药各组分群体的特征图谱，目前已成为国内外公认的鉴别中药品种和评价中药质量的最有效手段之一。目前最新的指纹图谱测试方法之一是超高效液相色谱(UPLC)，这是最近几年出现的一种新型液相色谱技术，采用1.7 μm的小粒径色谱柱填料，不仅使柱效得以提高，而且在较宽的流速范围内柱效保持恒定，从而有利于通过提高流动相的流速而缩短分析时间，提高分析通量。相对于常规HPLC而言， UPLC有更好的分离效率、峰容量以及灵敏度。但是，在裸花紫珠药材分析技术领域，还仍未有用UPLC对裸花紫珠药材进行质量控制分析以及报道其指纹图谱。

因此，本发明提供一种首次利用UPLC技术，对裸花紫珠药材指纹图谱进行研究，为裸花紫珠药材质量控制提供了新的技术方法。

发明内容

本发明提供一种裸花紫珠药材的超高效液相色谱指纹图谱的构建方法，以及由此方法得到的裸花紫珠药材标准指纹图谱及其在裸花紫珠药材优化筛选、品质的鉴别和控制中的应用。根据本发明的构建方法解决了裸花紫珠药材的成分分析中不能有效地反映和控制裸花紫珠药材的整体质量的问题，弥补了现有质量控制技术的不足。

根据本发明的一个方面，提供一种裸花紫珠药材的超高效液相色谱指纹图谱的构建方法，包括：

(1)制备裸花紫珠药材的多个供试样品溶液及毛蕊花糖苷对照样品溶液；

(2)将步骤(1)所制备的供试样品溶液及对照样品溶液分别进行超高效液相色谱分析，得到超高效液相色谱图；

(3)以对照样品溶液的超高效液相色谱图作为对照，从步骤(2)所得到的供试样品溶液的超高效液相色谱图中选择共有特征峰构建裸花紫珠的标准指纹图谱，

所述步骤(2)中超高效液相色谱分析的条件为：

采用C18反相色谱柱，用流动相A为甲醇，流动相B为体积百分比为0.05～0.2％磷酸或甲酸水溶液，梯度洗脱，PDA检测器，紫外检测波长为320～360nm；梯度洗脱的程序为：

时间(分钟)	流动相A(％)	流动相B(％)
			0	14～20	86～80
4～5	20	80
			7	23～25	77～75
13	23～25	77～75
			15	30	70
20	40	60
			25	45	55
30	65	35
			35	80	20

本发明中所述步骤(1)制备裸花紫珠药材的供试样品溶液、毛蕊花糖苷对照品溶液、木犀草苷对照品溶液、咖啡酸对照品溶液、连翘酯苷B对照品溶液及异毛蕊花糖苷对照品溶液的方法包括用体积百分比为30～70％的甲醇水溶液处理；优选地，所述甲醇水溶液为体积百分比为70％的甲醇水溶液。其中，制备裸花紫珠药材的供试样品溶液的方法包括：精密称取裸花紫珠药材粉末，甲醇水溶液超声震荡提取，过滤备用；制备毛蕊花糖苷对照品溶液的方法包括：精密称取毛蕊花糖苷对照品，甲醇水溶液溶解后，定容过滤备用；制备木犀草苷对照品溶液的方法包括：精密称取木犀草苷对照品，甲醇水溶液溶解后，定容过滤备用；制备咖啡酸对照品溶液的方法包括：精密称取咖啡酸对照品，甲醇水溶液溶解后，定容过滤备用；制备连翘酯苷B对照品溶液的方法包括：精密称取连翘酯苷B对照品，甲醇水溶液溶解后，定容过滤备用；制备异毛蕊花糖苷对照品溶液的方法包括：精密称取异毛蕊花糖苷对照品，甲醇水溶液溶解后，定容过滤备用。

本发明中所使用的反相填料色谱柱为优选为Waters Acquity UPLC ShieldPR18，其中色谱柱尺寸为100mm×2.1mm，填料颗粒度为1.7μm。

本发明中步骤(2)中超高效液相色谱分析的条件中梯度洗脱的程序优选为：

时间(分钟)	流动相A(％)	流动相B(％)
			0	16	84
4	20	80
			7	23	77
13	23	77
			15	30	70
20	40	60
			25	45	55
30	65	35
			35	80	20

本发明中步骤(2)中超高效液相色谱分析的条件优选为：所述流动相A为甲醇，流动相B 为体积百分比为0.1％甲酸溶液，梯度洗脱的程序为：

本发明中步骤(2)中超高效液相色谱分析的条件优选为：流动相的流速为0.3～0.7mL/min，柱温在30～45℃；进一步优选地，流速为0.4～0.5mL/min，柱温为40℃。

本发明中步骤(2)中超高效液相色谱分析的条件优选为：所述流动相A为甲醇，流动相B 为体积百分比为0.1％甲酸水溶液，流速为0.4mL/min，波长为350nm，柱温为40℃。

以对照样品溶液的超高效液相色谱图作为对照，从步骤(2)所得到的供试样品溶液的超高效液相色谱图中选择共有特征峰构建裸花紫珠的标准指纹图谱，包含16个共有特征峰，以8 号峰毛蕊花糖苷为参照峰，其相对保留时间分别为：峰1：1.865(±5％)、峰2：2.125(±5％)、峰3：3.329(±5％)、峰4：4.635(±5％)、峰5：5.681(±5％)、峰6：5.969(±5％)、峰7：8.986(±5 ％)、峰8：9.413(±5％)、峰9：10.091(±5％)、峰10：12.766(±5％)、峰11：15.179(±5％)、峰12：19.303(±5％)、峰13：20.304(±5％)、峰14：24.032(±5％)、峰15：29.460(±5％)和峰16：30.032(±5％)。所述16个共有特征峰中，峰3为咖啡酸；峰7为连翘酯苷B；峰8为毛蕊花糖苷；峰10为木犀草苷；峰11为异毛蕊花糖苷。

本发明的另一个方面，提供一种裸花紫珠药材标准指纹图谱，其通过本发明的上述裸花紫珠药材的超高效液相色谱指纹图谱的构建方法获得的。优选地，本发明的裸花紫珠药材的标准指纹图谱为超高效液相色谱UPLC的指纹图谱，并且包含16个共有特征峰，以8号峰毛蕊花糖苷为参照峰，其相对保留时间分别为：峰1：1.865(±5％)、峰2：2.125(±5％)、峰3： 3.329(±5％)、峰4：4.635(±5％)、峰5：5.681(±5％)、峰6：5.969(±5％)、峰7：8.986(±5 ％)、峰8：9.413(±5％)、峰9：10.091(±5％)、峰10：12.766(±5％)、峰11：15.179(±5％)、峰12：19.303(±5％)、峰13：20.304(±5％)、峰14：24.032(±5％)、峰15：29.460(±5％)和峰16：30.032(±5％)。其中，上述16个共有特征峰中，峰3为咖啡酸；峰7为连翘酯苷B；峰8 为毛蕊花糖苷；峰10为木犀草苷；峰11为异毛蕊花糖苷。

本发明的再一个方面，提供上述裸花紫珠药材的标准指纹图谱在裸花紫珠药材以及含裸花紫珠药材的制剂的检测中的应用。

本发明的再一个方面，提供一种检测裸花紫珠药材的方法，其中，所述方法包括将待测裸花紫珠药材的指纹图谱与本发明上述裸花紫珠药材的标准指纹图谱相比较。

本发明的有益效果：

(1)本发明首次利用UPLC技术，对裸花紫珠药材进行指纹图谱研究，为裸花紫珠药材质量控制提供了新的分析方法；

(2)将裸花紫珠药材作为整体对待，通过比较其共有峰，可以找出不同药材之间的细微差异，适用于裸花紫珠药材真伪、产地和品质的鉴别和控制；

(3)本发明供试样品制作简单，色谱条件容易实现，精密度高，而且其稳定性和重现性较好，本发明采用的检测波长出峰较多，反映的信息完全；

(4)与传统HPLC方法相比较，在不影响整体效果的前提下，大大缩短了在线分析时间，节省了材料成本和时间成本。

附图说明

图1是本发明实施例1获得的裸花紫珠药材的标准UPLC指纹图谱。

图2是本发明实施例1构建的10批次裸花紫珠药材的UPLC指纹图谱(S1-S10)。

图3是毛蕊花糖苷、咖啡酸、连翘酯苷、木犀草苷和异毛蕊花糖苷对照品的UPLC指纹图谱。

图4是裸花紫珠药材的UPLC指纹图谱(S5)与尖尾枫UPLC指纹图谱(S1)大叶紫珠UPLC指纹图谱(S2)、珍珠枫UPLC指纹图谱(S3)、杜虹花UPLC指纹图谱(S4)的对比图。

具体实施方式

实施例1

1.仪器和药品

使用Waters ACQUITY UPLC H-Class超高效液相色谱仪。裸花紫珠药材共10批，裸花紫珠、大叶紫珠、尖尾枫、珍珠枫、杜虹花药材，均来自于海南九芝堂药业有限公司，经湖南省中医药研究院中药研究所谢昭明研究员鉴定为正品；毛蕊花糖苷对照品(批号111530-201310)、木犀草苷对照品(批号111720-2014085)、连翘酯苷B对照品(批号111811-201102)均购于中国食品药品检定研究院，供含量测定用，咖啡酸对照品(批号 111720-2014085)购于中国药品生物制品检定所，供含量测定用，异毛蕊花糖苷对照品(纯度均大于98％)购于天津一方科技有限公司，其他试剂为色谱纯或分析纯级试剂。

2.1供试样品溶液的制备

精密称取药材粉末1.0000g，置于具塞容器中，加入体积百分比为70％的甲醇水溶液50mL，称定重量，超声震荡40分钟，放冷，再称定重量，用体积百分比为70％的甲醇水溶液补足损失的重量，过滤，用0.22μm滤膜过滤，滤液作为供试样品溶液。

2.2.对照品溶液的制备

精密称取毛蕊花糖苷对照品约7mg、木犀草苷约2mg、连翘酯苷B约6mg、咖啡酸约4mg、异毛蕊花糖苷约6mg，置100mL量瓶中，加体积百分比为70％的甲醇水溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，用0.22μm滤膜过滤，取续滤液即得。

3.超高效液相色谱分析

色谱分析填料为Waters Acquity UPLC Shield PR18，其中色谱柱尺寸为100mm×2.1mm，填料颗粒度为1.7μm，流动相A为甲醇，流动相B为体积百分比为0.1％甲酸溶液，梯度洗脱的程序为：

流速0.4ml/min；检测波长350nm；柱温40℃。在此条件下精密量取对照品溶液和供试品溶液各1μl，注入液相色谱仪，得到对照品溶液和供试品溶液的超高效液相图谱，见图2、 3。

4.分析图谱

以对照样品溶液的超高效液相色谱图作为对照，从所得到的10批次供试样品溶液的超高效液相色谱图中选择共有特征峰，对裸花紫珠药材建立了UPLC标准指纹图谱(见图2)，并且包含16个共有特征峰，以8号峰毛蕊花糖苷为参照峰，其相对保留时间分别为：峰1：1.865(±5 ％)、峰2：2.125(±5％)、峰3：3.329(±5％)、峰4：4.635(±5％)、峰5：5.681(±5％)、峰6： 5.969(±5％)、峰7：8.986(±5％)、峰8：9.413(±5％)、峰9：10.091(±5％)、峰10：12.766(±5 ％)、峰11：15.179(±5％)、峰12：19.303(±5％)、峰13：20.304(±5％)、峰14：24.032(±5 ％)、峰15：29.460(±5％)和峰16：30.032(±5％)。

这些共有特征峰构成了裸花紫珠药材的指纹特征，可作为裸花紫珠药材的标准指纹图谱，具体参见图1。各共有峰的相对保留时间和相对峰面积计算结果如下表。

表1.各共有峰相对保留时间

表2.各共有峰相对峰面积

表3. 10批裸花紫珠药材及对照品的指纹图谱的相似度

5.对本发明的裸花紫珠药材超高效液相色谱指纹图谱的构建方法的精密度、重现性以及所提取的供试品溶液的稳定性进行检测：

(1)精密度试验

按照上述方法制备一份供试样品溶液，连续进样6次，计算出1～16号共有指纹峰的保留时间的RSD值均小于3％，同时用相似度评价软件计算各色谱指纹图谱的相似度均大于0.99，表明仪器稳定，精密度良好。

表4.精密度试验结果

(2)稳定性试验

取重现性试验中同一份供试品溶液，分别在0、2、4、8、16、24小时进样，计算出1～16 号共有指纹峰的相对保留时间的RSD值均小于3％，同时用相似度评价软件计算各色谱指纹图谱的相似度均大于0.99，表明供试品溶液在24小时内稳定。

表5.稳定性试验结果

(3)重现性试验

取同一批药材，分别精密称取6份，照上述方法制备供试品溶液，分别进样，计算出1～ 16号共有指纹峰的保留时间的RSD值均小于3％，同时用相似度评价软件计算各色谱指纹图谱的相似度均大于0.99，表明方法重现性良好。

表6.重现性试验结果

按照本发明实施例1提供的方法，对裸花紫珠药材UPLC标准指纹图谱与四种紫珠属的植物进行指纹图谱进行比较(见图4)，其中S1为尖尾枫指纹图谱，S2为大叶紫珠指纹图谱， S3为珍珠枫指纹图谱，S4为杜虹花指纹图谱，S5为裸花紫珠特征指纹图谱。

表7.裸花紫珠标准指纹图谱与四种紫珠属指纹图谱的相似度

由附图4和表7可以得到裸花紫珠UPLC特征指纹图谱检测方法能够很好的检测出裸花紫珠药材及其相关制剂与伪品的差别。

Claims

1.一种裸花紫珠药材的超高效液相色谱指纹图谱的构建方法，包括：

所述步骤(2)中超高效液相色谱分析的条件为：

采用C18反相色谱柱，用流动相A为甲醇，流动相B为体积百分比为0.05～0.2％磷酸或体积百分比为0.05～0.2％甲酸水溶液，梯度洗脱，紫外检测波长为320～360nm；梯度洗脱的程序为：

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(1)中制备裸花紫珠药材的供试样品溶液及毛蕊花糖苷对照样品溶液的方法包括用体积百分比为30～70％的甲醇水溶液处理。

3.根据权利要求1～2中任一项权利要求所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)中超高效液相色谱分析的条件中梯度洗脱的程序为：

4.根据权利要求1～2中任一项权利要求所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(2)中超高效液相色谱分析的条件中流动相A为甲醇，流动相B为体积百分比为0.1％甲酸水溶液，梯度洗脱的程序为：

5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(2)中超高效液相色谱分析的条件还包括：所述流动相的流速为0.3～0.7mL/min，柱温为30～45℃。

6.根据权利要求1～2任一项权利要求所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(2)中超高效液相色谱分析的条件中：所述流动相A为甲醇，流动相B为体积百分比为0.1％甲酸水溶液，流速为0.4mL/min，检测波长为350nm，柱温为40℃。

7.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，从步骤(2)在紫外检测波长350nm时得到的供试样品溶液的超高效液相色谱图中选择共有特征峰构建了UPLC标准指纹图谱，包含16个共有特征峰，以8号峰毛蕊花糖苷为参照峰，其相对保留时间分别为：峰1：1.865(±5％)、峰2：2.125(±5％)、峰3：3.329(±5％)、峰4：4.635(±5％)、峰5：5.681(±5％)、峰6：5.969(±5％)、峰7：8.986(±5％)、峰8：9.413(±5％)、峰9：10.091(±5％)、峰10：12.766(±5％)、峰11：15.179(±5％)、峰12：19.303(±5％)、峰13：20.304(±5％)、峰14：24.032(±5％)、峰15：29.460(±5％)和峰16：30.032(±5％)。

8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述16个共有特征峰中，峰3为咖啡酸；峰7为连翘酯苷B；峰8为毛蕊花糖苷；峰10为木犀草苷；峰11为异毛蕊花糖苷。

9.一种裸花紫珠药材的标准指纹图谱，其通过权利要求1～2中任一项权利要求所述的裸花紫珠药材的超高效液相色谱指纹图谱的构建方法获得。

10.根据权利要求9所述的标准指纹图谱，其为超高效液相色谱UPLC的指纹图谱，并且包含16个共有特征峰，以8号峰毛蕊花糖苷为参照峰，其相对保留时间分别为：峰1：1.865(±5％)、峰2：2.125(±5％)、峰3：3.329(±5％)、峰4：4.635(±5％)、峰5：5.681(±5％)、峰6：5.969(±5％)、峰7：8.986(±5％)、峰8：9.413(±5％)、峰9：10.091(±5％)、峰10：12.766(±5％)、峰11：15.179(±5％)、峰12：19.303(±5％)、峰13：20.304(±5％)、峰14：24.032(±5％)、峰15：29.460(±5％)和峰16：30.032(±5％)。

11.权利要求10或11所述的裸花紫珠药材的标准指纹图谱在裸花紫珠药材以及含裸花紫珠药材的制剂的检测中的应用。