CN110568113A - 一种裸花紫珠的活性特征指纹色谱及其快速鉴别方法 - Google Patents

一种裸花紫珠的活性特征指纹色谱及其快速鉴别方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110568113A
CN110568113A CN201910659668.XA CN201910659668A CN110568113A CN 110568113 A CN110568113 A CN 110568113A CN 201910659668 A CN201910659668 A CN 201910659668A CN 110568113 A CN110568113 A CN 110568113A
Authority
CN
China
Prior art keywords
callicarpa nudiflora
fingerprint
callicarpa
peak
nudiflora
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201910659668.XA
Other languages
English (en)
Inventor
杨扬
李小锋
杨义芳
康兴东
邓杰仁
张金良
章弘扬
周朝忠
任昭洁
刘易
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Yaochen Biotechnology Co Ltd
JIANGXI PUZHENG PHARMACEUTICAL CO Ltd
Original Assignee
Shanghai Yaochen Biotechnology Co Ltd
JIANGXI PUZHENG PHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Yaochen Biotechnology Co Ltd, JIANGXI PUZHENG PHARMACEUTICAL CO Ltd filed Critical Shanghai Yaochen Biotechnology Co Ltd
Priority to CN201910659668.XA priority Critical patent/CN110568113A/zh
Publication of CN110568113A publication Critical patent/CN110568113A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/86—Signal analysis
    • G01N30/8675—Evaluation, i.e. decoding of the signal into analytical information
    • G01N30/8686—Fingerprinting, e.g. without prior knowledge of the sample components
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
    • G01N2030/8809—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample

Landscapes

  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Library & Information Science (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)

Abstract

本发明涉及药物分析技术领域，具体为一种裸花紫珠的活性特征指纹色谱及其快速鉴别方法。本发明通过超高效液相方法构建裸花紫珠活性特征指纹图谱，生成由19个共有峰构成的裸花紫珠超高效液相色谱对照特征图谱；并通过采用二极管阵列检测器和QTOF−MS/MS对裸花紫珠活性特征指纹图谱在线快速成分分析和鉴定苯丙烯酸类衍生物与黄酮类成分峰；以相似度评价和主成分分析评价快速鉴别裸花紫珠与其它紫珠属药材。本发明的有益效果在于：本发明能够在药效本质意义上控制质量；提供了裸花紫珠药材质量评价快速新方法；可实现裸花紫珠与其它紫珠属药材的精准区分，可快速鉴别裸花紫珠药材，使得裸花紫珠材质量控制更加全面与科学。

Description

一种裸花紫珠的活性特征指纹色谱及其快速鉴别方法
技术领域
本发明涉及中药药物分析技术领域，具体为一种裸花紫珠的特征指纹色谱及其快速鉴别方法。
背景技术
裸花紫珠是马鞭草科紫珠属的干燥叶和带叶的嫩枝，是一种常用的海南传统民族药材，具有抗菌止血、消炎解毒、散瘀消肿、祛风祛湿功效，用于跌打肿痛、风湿肿痛、肺结核咳血、胃肠出血等症。
裸花紫珠化学成分主要有苯丙素类、黄酮类、三萜类、二萜类、环烯醚萜类、酚酸类及其苷和甾醇等，主要有止血、抗炎等药理作用。已知裸花紫珠中苯丙素类成分的结构均系苯丙烯酸与糖缩合的苷或游离苯丙烯酸咖啡酸与阿魏酸，此外已知裸花紫珠中环烯醚萜类成分的结构其中有半数以上为苯丙烯酸的衍生物。裸花紫珠苯丙烯酸类是主治各种炎症、出血和抗菌活性成分，黄酮类为抗炎和抗菌活性成分，总黄酮对表皮伤口易感染菌具有抑菌作用，能明显抑制二甲苯所致小鼠耳廓肿胀，具有良好的抗炎作用。
近年来，超高效液相色谱(UPLC)、高分离度快速液相色谱(RRLC)、超快速液相色谱(UFLC)和快速分离液相色谱(RSLC)相继推出，人们习惯把上述技术统称为超高效液相色谱(UHPLC)。它是分离科学和技术的巨大进步，液相色谱也由此进入了全新的时代，是复杂体系中药分离分析的重要手段。与传统的采用5.0μm颗粒度的色谱柱填料的HPLC技术相比能获更快的速度和更高的质量完成以往HPLC的工作，节省宝贵的时间和日常溶剂消耗，高分离度可以从容面对复杂组份分离的挑战，高灵敏度检测更加痕量的目标化合物，快速的分离分析大量样品，实现高通量。
中药一般是通过多成分、多途径、多层次和多靶点在人体内发挥作用，这些都给中药的深入研究和质量控制带来很大困难。长期以来，中药存在质量控制水平低、不能进行定性和定量分析以及质量不稳定等问题。由于指纹图谱反映的是整体质量信息，具有整体性和模糊性的特点，与中药的特点比较契合，因此在中药质量评价方面得到了广泛的认可。中药指纹图谱特指中药样本经光谱或色谱等现代分析技术得到的中药组分群的特征图谱和图像，目前已成为国内外公认鉴别中药品种和评价中药质量的最有效手段之一，在寻求综合评价中药质量及其量效关系的过程中，色谱指纹图谱是目前研究最为广泛的方法。值得注意的趋势是色谱指纹图谱的应用，孤立地研究中药材或中成药的所谓“有效”成分或其指纹图谱没有实际意义。随着人们对中药药效物质基础的深入研究，只有基于中药药效物质将标示物质群特征峰的中药指纹图谱与功效结果相对应起来，将中药指纹图谱中化学成分的变化跟中药药效结果联系起来，建立起有实际意义的中药“谱效”关系学，才是药效本质意义上的质量控制，我们把此称之为“活性特征指纹色谱”。
液-质联用技术是将液相色谱的高分离效能与质谱的强大结构鉴定功能相结合，其在中药化学成分分析、中药质量控制、中药药代动力学及代谢组学等研究工作中得到了广泛地应用。液-质联用技术所具备的高分离、高灵敏度、高选择性以及提供丰富结构信息等一系列优点，决定了它将在越来越多地相关领域得到应用。
超高效液相色谱由于其具有分离速度快、灵敏度高、分辨率高等特点，是目前对生物体内复杂体系的高效手段之一。四极杆-飞行时间质谱具有采集数据分辨率高和测定动态范围宽等优势，并且应用全扫描和目标二级质谱等模式可以得到待测物的大量一级二级质谱信息。因此UHPLC与QTOF-MS/MS联用技术是对植物提取物中多种物质的快速定性分析的有力工具。
化学计量学方法是一种强有力的辅助手段,能够对指纹图谱中的有效信息进行提取、处理和解析，发掘化学数据的外在表征与物质内在组成之间的相互关系，进而获取有关中药产地、种类、炮制工艺等方面的信息,用于指导中药的质量控制。
近年来，随着裸花紫珠系列产品的临床疗效获得医生和患者的认可和广泛使用，国内外对裸花紫珠的研究热度也越来越高，裸花紫珠因具有治疗效果好、副作用小等优点，裸花紫珠制剂市场占有额也逐年增长，在利益的驱使下，现今市场上裸花紫珠基源应用混乱，同物异名、同名异物现象也较为严重。本领域亟需一种裸花紫珠药材能够快速精准鉴别和在药效本质意义上的质量控制手段。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为了解决裸花紫珠中药成分极其复杂，仅靠法规性状鉴别和几个指标成分含量测定不足以全面控制裸花紫珠药材质量的技术问题，而提供了一种基于裸花紫珠抗炎、止血和抗菌药效物质构建的裸花紫珠药材的UPLC活性特征指纹色谱的方法及其快速鉴别方法。
本发明提供了一种活性特征裸花紫珠指纹图谱的构建方法，其包含下列步骤：
色谱条件：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱；柱温15～50℃；二极管阵列检测器(DAD)，检测波长320-350nm；流动相B为乙腈或甲醇，流动相A为0.1％～0.5％的甲酸水溶液或0.1％～0.5％的醋酸水溶液；流速0.2～0.5mL/min；梯度洗脱；梯度洗脱程序如下所示：
时间(分钟) 流动相(v/v％) 时间(分钟) 流动相(v/v％)
0～5min 8％～14％B 30～40min 22％～30％B
5～15min 14～18％B 40～45min 30％～50％B
20～30min 18％～22％B 45～55min 45％～60％B
供试品溶液的制备:将裸花紫珠药材粉碎，过30～80目筛，裸花紫珠药材粉末与体积质量比10～100倍量的的甲醇水溶液混合，超声或回流提取15～
90min，提取后，冷却，用微孔滤膜过滤，即可。
检测：精密吸取供试品溶液1～20uL，注入超高效液相色谱仪，测定，记录色谱图，即得裸花紫珠特征图谱。
对照特征图谱生成：构建的10批次以上的裸花紫珠超高效液相色谱特征图谱，采用中药色谱指纹图谱相似度评价软件，生成由19个共有峰构成的裸花紫珠裸花紫珠超高效液相色谱对照特征图谱。
所述的采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件生成裸花紫珠活性特征指纹图谱按常规进行操作。运用中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件，确定裸花紫珠的19个共有峰，保留时间依次为3.4min、5.5min、7.9min、9.8min、10.0min、11.0min、13.3min、15.4min、16.1min、17.9min、19.3min、20.1min、22.8min、23.3min、26.3min、26.9min、30.0min、32.8min、53.3min，这19个共有峰构成了裸花紫珠药材的活性指纹特征，作为裸花紫珠的活性特征指纹图谱。
本发明中，15批裸花紫珠药材(S1-S15)经江西普正制药有限公司吴永忠研究员鉴定为马鞭草科裸花紫珠C.nudiflora的干燥叶；5批紫珠属其它品种药材(S16-S20)经鉴定分别为杜虹花C.formosana、广东紫珠C.kwangtungensis、大叶紫珠C.macrophylla、小叶紫珠C.dichotoma、枇杷叶紫珠C.kochiana，经密封保存于阴凉干燥处(见表1)。
表1裸花紫珠及其它紫珠属药材样品S1～S20的来源
本发明提供UHPLC-DAD/QTOF-MS/MS对裸花紫珠活性特征指纹图谱在线快速鉴定的方法，采用二极管阵列检测器(DAD)检测的紫外可见光谱信息指认苯丙烯酸类衍生物与黄酮类成分峰。苯丙烯酸衍生物紫外可见光谱特征：220nm有小峰吸收和肩峰，260nm左右有最小吸收峰，260-330nm间有一个肩峰，在330nm左右有最大吸收峰。黄酮类化合物的紫外可见光谱特征：通常有2个吸收带，吸收带I位于290-380nm，是分子中C环和B环上的羰基共轭体系的紫外吸收，位于240-280nm的吸收带II是A环与C环上羰基共轭体系的紫外吸收。
本发明提供UHPLC-DAD/QTOF-MS/MS对裸花紫珠活性特征指纹图谱在线快速鉴定的方法，所述的质谱条件，质谱检测分别在正、负离子模式下进行，毛细管电压分别为3500V(正模式)和3000V(负模式)，干燥气温度350℃，干燥气流量10L/min，雾化气压力30psig，毛细管出口电压150V，扫描质量范围50-1500m/z，扫描速率1张谱图/秒。质量校正液离子分别选为121.0509m/z和922.0098m/z(正模式)和112.9856m/z和1033.9881m/z(负模式)。目标二级离子模式(TargetedMS/MS)的碰撞电压值为30eV。本发明进行了UHPLC分离和QTOF-MS/MS鉴定，所得质谱信息通过一级质谱得到的精确质量数和二级质谱的特征碎片，在一级质谱中，这些化合物在正模式下，可生成[M+H]+、[M+Na]+、[M+NH4]+和[M+K]+加合离子；而在负模式下，可生成[M-H]-、[M+Cl]-和[M+COOH]-加合离子。依据加合离子信息，可以准确推断出化合物的精确分子量和分子式。由于天然产物中存在大量同分异构体，仅靠化合物的分子式以及精确分子量难以确定物质结构，因此通过二级质谱将各化合物的分子离子峰进一步碎裂，得到其碎裂信息，在线查阅文献以及将所得二级质谱的碎片信息与质谱数据库网站(http://www.chemspider.com/)对比，进行进一步鉴定化合物的结构。结果显示，裸花紫珠活性特征指纹峰为苯丙烯酸类衍生物与黄酮类这两类活性成分。
本发明还提供了一种活性特征裸花紫珠活性特征指纹图谱，该指纹图谱结合化学计量学手段可快速鉴别裸花紫珠药材的方法，其包含下列步骤：采用如前所述的方法检测裸花紫珠药材粉末，所有裸花紫珠药材的色谱数据导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件，经中位数法进行多点校正，对色谱峰进行自动匹配，生成色谱指纹图谱共有模式作为对照指纹图谱，进行相似度计算。裸花紫珠样品和其它紫珠属样品的相似度相比有显著差异，能够很好的区分裸花紫珠与其它紫珠属药材。还包含下列步骤：以所有药材共有峰的峰面积导入SIMCAP+14.0软件，经Pareto-scaling预处理后进行PCA分析。以共有峰的峰面积为指标，各批药材共有峰的峰面积进行标准化得到原始数据矩阵，再对原始数据矩阵进行因子分析；根据因子负荷矩阵贡献率的大小确定主成分个数，按照此方法共确定主成分，将其作为矢量图映在三维空间。经主成分分析后，裸花紫珠样品聚为一类，且与其它紫珠属样品在PC1轴上明显分开，表明该活性特征指纹图谱方法结合化学计量学手段可精准快速鉴别裸花紫珠药材。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明是基于裸花紫珠药材抗炎、止血和抗菌药效物质基础构建的裸花紫珠活性特征指纹图谱，将标示物质群特征峰的中药指纹图谱与功效结果相对应起来，将中药指纹图谱中化学成分的变化跟中药药效结果联系起来，建立起有实际意义的裸花紫珠中药“谱效”关系学，其得到的裸花紫珠药材活性特征指纹色谱能够在药效本质意义上控制质量；
(2)本发明利用MS/MS和DAD检测器在线指认苯丙烯酸类活性化合物和黄酮类活性化合物，并鉴定了活性特征指纹峰化合物的结构，提供了裸花紫珠药材质量评价快速新方法。
(3)本发明的方法结合化学计量学手段相似度评价和PCA分析，可实现裸花紫珠与其它紫珠属药材的精准区分，可快速鉴别裸花紫珠药材，使得裸花紫珠材质量控制更加全面与科学。
附图说明
图1为实施例1中裸花紫珠药材的UPLC活性特征指纹图谱
图2为实施例2中裸花紫珠药材的19个活性特征指纹峰DAD图谱
图3为实施例3中15批裸花紫珠药材的UPLC指纹图谱及所生成的对照指纹图谱叠加图
图4为实施例4中15批裸花紫珠与5批其它紫珠属样品的PCA分析图
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1
取裸花紫珠样品粉碎，过40目筛，精密称取样品粉末0.5g，1份，置于具塞锥形瓶中，加入80％甲醇水溶液25mL，称重，超声45min，放冷，用80％甲醇补足失重，摇匀，过0.22μm微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液。
采用Waters ACQUITY ARCTM型超高效液相色谱仪；Phenomenex kintex XB-C18色谱柱，其规格为外径2.1mm×柱长150mm，填料直径1.7μm。流动相为(A)0.1％甲酸水溶液和(B)乙腈，梯度洗脱如下所示：
时间(分钟) 流动相(v/v％) 时间(分钟) 流动相(v/v％)
0～5min 8％～14％B 30～40min 22％～30％B
5～15min 14～18％B 40～45min 30％～50％B
20～30min 18％～22％B 45～55min 45％～60％B
流速为0.3ml/min，检测波长332nm，柱温45℃，进样量5μL。裸花紫珠药材的活性特征指纹图谱见图1。如图所示，共获得19个共有指纹峰。
实施例2
取裸花紫珠样品粉碎，过40目筛，精密称取样品粉末0.5g，1份，置于具塞锥形瓶中，加入80％甲醇水溶液25mL，称重，超声45min，放冷，用80％甲醇补足失重，摇匀，过0.22μm微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液。
采用超高效液相色谱Agilent1290超高效液相色谱-6530四极杆-飞行时间质谱仪，配有二元高压梯度泵、可控温自动进样器、可控温柱温箱、二极管阵列检测器和电喷雾离子源；Phenomenex kintex XB-C18色谱柱，其规格为外径2.1mm×柱长150mm，填料直径1.7μm。流动相为(A)0.1％甲酸水溶液和(B)乙腈，梯度洗脱如下所示：
时间(分钟) 流动相(v/v％) 时间(分钟) 流动相(v/v％)
0～5min 8％～14％B 30～40min 22％～30％B
5～15min 14～18％B 40～45min 30％～50％B
20～30min 18％～22％B 45～55min 45％～60％B
流速为0.3ml/min，检测波长332nm，柱温45℃，进样量2μL。采用二极管阵列检测器在线检测，得到紫外可见光谱信息见图2。峰1、2、3、4、5、7、8、10、12、14、16、17的UV信号符合苯丙烯酸衍生物光谱特征：220nm有小峰吸收和肩峰，260nm左右有最小吸收峰，260～330nm间有一个肩峰，在330nm左右有最大吸收峰。峰6、9、11、13、15、18、19的UV信号符合黄酮类化合物，其UV谱有2个吸收带，吸收带I位于337～348nm，是分子中C环和B环上的羰基共轭体系的紫外吸收，位于251～285nm的吸收带II是A环与C环上羰基共轭体系的紫外吸收。
采用电喷雾离子源，四极杆-飞行时间质谱检测器，质谱条件：质谱检测分别在正、负离子模式下进行，毛细管电压分别为3500V(正模式)和3000V(负模式)，干燥气温度350℃，干燥气流量10L/min，雾化气压力30psig，毛细管出口电压150V，扫描质量范围50-1500m/z，扫描速率1张谱图/秒。质量校正液离子分别选为121.0509m/z和922.0098m/z(正模式)和112.9856m/z和1033.9881m/z(负模式)。目标二级离子模式(Targeted MS/MS)的碰撞电压值为30eV。
所得质谱信息通过一级质谱得到的精确质量数和二级质谱的特征碎片，在一级质谱中，这些化合物在正负模式下生成加合离子，依据加合离子信息，可以准确推断出化合物的精确分子量和分子式。通过二级质谱将各化合物的分子离子峰进一步碎裂，得到其碎裂信息，在线查阅文献以及将所得二级质谱的碎片信息与质谱数据库网站(http://www.chemspider.com/)对比，进行进一步鉴定化合物的结构。结果见表2。
表2裸花紫珠药材活性特征指纹峰的UPLC-DAD-Q-TOF-MS鉴定结果
注：λmax为最大吸收波。
实施例3
(1)取S1～S15批裸花紫珠样品粉碎，过40目筛，精密称取样品粉末0.5g，置于具塞锥形瓶中，加入80％甲醇水溶液25mL，称重，超声45min，放冷，用80％甲醇补足失重，摇匀，过0.22μm微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液；
采用Waters ACQUITY ARCTM型超高效液相色谱仪；Phenomenex kintex XB-C18色谱柱，其规格为外径2.1mm×柱长150mm，填料直径1.7μm。流动相为(A)0.1％甲酸水溶液和(B)乙腈，梯度洗脱如下所示：
时间(分钟) 流动相(v/v％) 时间(分钟) 流动相(v/v％)
0～5min 8％～14％B 30～40min 22％～30％B
5～15min 14～18％B 40～45min 30％～50％B
20～30min 18％～22％B 45～55min 45％～60％B
流速为0.3ml/min，检测波长332nm，柱温45℃，进样量2μL，连续进样6次。在此条件下分析供试品溶液，得到各自的UPLC图谱的相关数据。
(2)对照指纹图谱的生成
根据已建立的色谱条件对15批样品进行测定，将结果导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件(国家药典委2012版)进行分析，以S1为参照图谱，经过多点校正，自动匹配，生成对照指纹图谱，结果见图3。
(3)相似度分析
运用中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件(国家药典委2012版)，得到15批样品UPLC指纹图谱叠加图，见图3。通过多点矫正和数据匹配，对照图谱的生成，采用夹角余弦法计算15批样品与对照图谱的整体相似性，结果见表3。
表3裸花紫珠药材样品的相似度评价结果
(4)指纹图谱的确定
确定了19个共有特征峰，其保留时间分别为3.4min、5.5min、7.9min、9.8min、10.0min、11.0min、13.3min、15.4min、16.1min、17.9min、19.3min、20.1min、22.8min、23.3min、26.3min、26.9min、30.0min、32.8min、53.3min，这19个共有UPLC特征峰构成了裸花紫珠药材的活性指纹特征，作为裸花紫珠的活性特征指纹图谱。
实施例4
(1)取S1～S20批裸花紫珠样品粉碎，过40目筛，精密称取样品粉末0.5g，置于具塞锥形瓶中，加入80％甲醇水溶液25mL，称重，超声45min，放冷，用80％甲醇补足失重，摇匀，过0.22μm微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液(S1～S20批供试品溶液)；
采用Waters ACQUITY ARCTM型超高效液相色谱仪；Phenomenex kintex XB-C18色谱柱，其规格为外径2.1mm×柱长150mm，填料直径1.μm。流动相为(A)0.1％甲酸水溶液和(B)乙腈，梯度洗脱如下所示：
时间(分钟) 流动相(v/v％) 时间(分钟) 流动相(v/v％)
0～5min 8％～14％B 30～40min 22％～30％B
5～15min 14～18％B 40～45min 30％～50％B
20～30min 18％～22％B 45～55min 45％～60％B
流速为0.3ml/min，检测波长332nm，柱温45℃，进样量2μL，连续进样6次。在此条件下分析供试品溶液，得到各自的UPLC图谱的相关数据。
(2)相似度分析
将结果导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件(国家药典委2012版)进行分析，各样品与对照指纹图谱的相似度评价结果见表4。
表4裸花紫珠及其它紫珠属药材样品的相似度评价结果
结果显示，1～15号裸花紫珠样品的相似度均大于0.960，而16～20号其它紫珠属样品的相似度均小于0.770，表明所建立的指纹图谱方法能够很好的区分裸花紫珠与其它紫珠属药材。
(3)主成分分析：以所有药材共有峰的峰面积导入SIMCA P+14.0软件(瑞典Umetrics公司)，经Pareto-scaling预处理后进行PCA分析。以共有峰的峰面积为指标，各批药材共有峰的峰面积进行标准化得到原始数据矩阵，再对原始数据矩阵进行因子分析；根据因子负荷矩阵贡献率的大小确定主成分个数，按照此方法共确定主成分，将其作为矢量图映在三维空间。经主成分分析后，各样品的分析结果见图4。15批裸花紫珠样品聚为一类，且与5批其它紫珠属样品在PC1轴上明显分开，表明该活性特征指纹图谱方法结合化学计量学手段可精准快速鉴别裸花紫珠药材。

Claims (4)

1.一种裸花紫珠的活性特征指纹色谱及其快速鉴别方法，其特征在于包含下列内容：(1)提供了一种裸花紫珠活性特征指纹图谱的构建方法；(2)提供了一种UHPLC与DAD/QTOF_MS/MS联用技术对裸花紫珠活性特征指纹图谱在线快速成分定性分析与化合物鉴定的方法；(3)提供的一种裸花紫珠活性特征指纹图谱结合化学计量学手段可快速鉴别裸花紫珠药材的方法。
2.根据权利要求1所述的一种裸花紫珠的活性特征指纹色谱及其快速鉴别方法，其特征在于所述的一种活性特征裸花紫珠指纹图谱的构建方法，包含下列步骤：
色谱条件：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱；柱温40～45℃；二极管阵列检测器，检测波长332nm；流动相B为乙腈，流动相A为0.1％的甲酸水溶液；流速0.3mL/min；梯度洗脱；梯度洗脱程序如下所示：
时间(分钟) 流动相(v/v％) 时间(分钟) 流动相(v/v％) 0～5min 8％～14％B 30～40min 22％～30％B 5～15min 14～18％B 40～45min 30％～50％B 20～30min 18％～22％B 45～55min 45％～60％B
供试品溶液的制备:将裸花紫珠药材粉碎，过40目筛，裸花紫珠药材粉末与体积质量比50倍量的80％的甲醇水溶液混合，超声或回流提取45min，提取后，冷却，用0.22μm微孔滤膜过滤，即可。
检测：精密吸取供试品溶液2～5uL，注入超高效液相色谱仪，测定，记录色谱图，即得裸花紫珠特征图谱。
对照特征图谱：构建的10批次以上的裸花紫珠特征图谱，采用中药色谱指纹图谱相似度评价软件，生成由19个共有峰构成的裸花紫珠超高效液相色谱对照特征图谱，共有峰保留时间依次为3.4min、5.5min、7.9min、9.8min、10.0min、11.0min、13.3min、15.4min、16.1min、17.9min、19.3min、20.1min、22.8min、23.3min、26.3min、26.9min、30.0min、32.8min、53.3min。
3.根据权利要求1所述的一种裸花紫珠的活性特征指纹色谱及其快速鉴别方法，其特征在于所述的一种UHPLC与DAD/QTOF-MS/MS联用技术对裸花紫珠活性特征指纹图谱在线快速成分定性分析与化合物鉴定的方法，其包含下列步骤：
采用二极管阵列检测器检测的紫外可见光谱信息指认苯丙烯酸类衍生物与黄酮类成分峰，苯丙烯酸衍生物光谱特征：220nm有小峰吸收和肩峰，260nm左右有最小吸收峰，260-330nm间有一个肩峰，在330nm左右有最大吸收峰；黄酮类化合物光谱特征：通常有2个吸收带，吸收带I位于290-380nm，吸收带II位于240-280nm。
采用QTOF-MS/MS对裸花紫珠活性特征指纹图谱在线快速鉴定。通过UHPLC分离和QTOF-MS/MS鉴定，所得质谱信息通过一级质谱推断出化合物的精确分子量和分子式；通过二级质谱将各化合物的分子离子峰进一步碎裂，得到其碎裂信息，在线查阅文献以及将所得二级质谱的碎片信息与质谱数据库网站对比，进行进一步鉴定裸花紫珠活性特征指纹峰为苯丙烯酸类衍生物与黄酮类这两类活性成分。
4.根据权利要求1所述的一种裸花紫珠的活性特征指纹色谱及其快速鉴别方法，其特征在于所述的一种裸花紫珠活性特征指纹图谱结合化学计量学手段可快速鉴别裸花紫珠药材的方法，其包含下列步骤：
色谱条件：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱；柱温40～45℃；二极管阵列检测器，检测波长332nm；流动相B为乙腈，流动相A为0.1％的甲酸水溶液；流速0.3mL/min；梯度洗脱；梯度洗脱程序如下所示：
时间(分钟) 流动相(v/v％) 时间(分钟) 流动相(v/v％) 0～5min 8％～14％B 30～40min 22％～30％B 5～15min 14～18％B 40～45min 30％～50％B 20～30min 18％～22％B 45～55min 45％～60％B
供试品溶液的制备:将裸花紫珠药材粉碎，过40目筛，裸花紫珠药材粉末与体积质量比50倍量的80％的甲醇水溶液混合，超声或回流提取45min，提取后，冷却，用0.22μm微孔滤膜过滤，即可。
检测：精密吸取供试品溶液1～20uL，注入超高效液相色谱仪，测定，记录色谱图。
相似度评价：构建的10批次以上的裸花紫珠色谱特征图谱，采用中药色谱指纹图谱相似度评价软件，经中位数法进行多点校正，对色谱峰进行自动匹配，生成对照指纹图谱，进行相似度计算，以相似度鉴别裸花紫珠与其它紫珠属药材。
主成分分析评价：以所有裸花紫珠共有峰的峰面积导入SIMCA P+14.0软件，经Pareto-scaling预处理后进行PCA分析。以共有峰的峰面积为指标，各批药材共有峰的峰面积进行标准化得到原始数据矩阵，再对原始数据矩阵进行因子分析；根据因子负荷矩阵贡献率的大小确定主成分个数，并确定主成分，将其作为矢量图映在三维空间，通过样品聚类情况鉴别裸花紫珠药材。
CN201910659668.XA 2019-07-19 2019-07-19 一种裸花紫珠的活性特征指纹色谱及其快速鉴别方法 Pending CN110568113A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910659668.XA CN110568113A (zh) 2019-07-19 2019-07-19 一种裸花紫珠的活性特征指纹色谱及其快速鉴别方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910659668.XA CN110568113A (zh) 2019-07-19 2019-07-19 一种裸花紫珠的活性特征指纹色谱及其快速鉴别方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110568113A true CN110568113A (zh) 2019-12-13

Family

ID=68773148

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910659668.XA Pending CN110568113A (zh) 2019-07-19 2019-07-19 一种裸花紫珠的活性特征指纹色谱及其快速鉴别方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110568113A (zh)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112268899A (zh) * 2020-10-15 2021-01-26 成都中医药大学 一种快速鉴别贝母类药材的方法
CN113406257A (zh) * 2021-05-13 2021-09-17 江西普正制药股份有限公司 基于谱效相关性的裸花紫珠收敛作用物质评价方法
CN113418996A (zh) * 2021-05-13 2021-09-21 江西普正制药股份有限公司 基于谱效相关性的裸花紫珠抗菌作用物质评价方法
CN113702519A (zh) * 2021-08-13 2021-11-26 江西普正制药股份有限公司 一种具有抗炎作用的裸花紫珠有效成分的评价方法
CN113702557A (zh) * 2021-08-12 2021-11-26 江西普正制药股份有限公司 一种具有止血凝血作用的裸花紫珠有效成分的评价方法
CN113834881A (zh) * 2020-06-24 2021-12-24 海南九芝堂药业有限公司 一种裸花紫珠鉴别方法

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102955010A (zh) * 2012-08-06 2013-03-06 江西普正制药有限公司 一种中药裸花紫珠制剂的质量检测方法
CN104215698A (zh) * 2013-05-31 2014-12-17 九芝堂股份有限公司 裸花紫珠药材、中间体及其制剂的指纹图谱检测方法和标准指纹图谱
CN104597139A (zh) * 2013-10-30 2015-05-06 九芝堂股份有限公司 Hplc同时测定裸花紫珠制剂中三种苯乙醇苷类成分的方法
CN104634885A (zh) * 2013-11-15 2015-05-20 九芝堂股份有限公司 一种裸花紫珠中黄酮类成分的分析鉴定方法
CN104634903A (zh) * 2013-11-11 2015-05-20 海南医学院 裸花紫珠药材中三种有效成分含量的测定方法
CN104977379A (zh) * 2014-04-14 2015-10-14 上海医药工业研究院 广东紫珠多组分同时测定方法及指纹图谱构建方法和应用
CN105987966A (zh) * 2015-02-12 2016-10-05 江苏康缘药业股份有限公司 基于谱效关系的广东紫珠质量控制方法及其模型建立方法
CN108663440A (zh) * 2017-03-31 2018-10-16 海南九芝堂药业有限公司 裸花紫珠药材uplc指纹图谱构建方法及标准指纹图谱

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102955010A (zh) * 2012-08-06 2013-03-06 江西普正制药有限公司 一种中药裸花紫珠制剂的质量检测方法
CN104215698A (zh) * 2013-05-31 2014-12-17 九芝堂股份有限公司 裸花紫珠药材、中间体及其制剂的指纹图谱检测方法和标准指纹图谱
CN104597139A (zh) * 2013-10-30 2015-05-06 九芝堂股份有限公司 Hplc同时测定裸花紫珠制剂中三种苯乙醇苷类成分的方法
CN104634903A (zh) * 2013-11-11 2015-05-20 海南医学院 裸花紫珠药材中三种有效成分含量的测定方法
CN104634885A (zh) * 2013-11-15 2015-05-20 九芝堂股份有限公司 一种裸花紫珠中黄酮类成分的分析鉴定方法
CN104977379A (zh) * 2014-04-14 2015-10-14 上海医药工业研究院 广东紫珠多组分同时测定方法及指纹图谱构建方法和应用
CN105987966A (zh) * 2015-02-12 2016-10-05 江苏康缘药业股份有限公司 基于谱效关系的广东紫珠质量控制方法及其模型建立方法
CN108663440A (zh) * 2017-03-31 2018-10-16 海南九芝堂药业有限公司 裸花紫珠药材uplc指纹图谱构建方法及标准指纹图谱

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
万春鹏 等: "UPLC-QTOF-MS技术分析马家柚果肉成分", 《中国果菜》 *
宋潇 等: "海南黎药－裸花紫珠的UPLC特征指纹图谱及化学模式识别", 《时珍国医国药》 *
董琳 等: "HPLC同时测定裸花紫珠中4种黄酮", 《中国实验方剂学杂志》 *
郭文 等: "广东紫珠干浸膏特征图谱研究", 《江西中医药大学学报》 *

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113834881A (zh) * 2020-06-24 2021-12-24 海南九芝堂药业有限公司 一种裸花紫珠鉴别方法
CN113834881B (zh) * 2020-06-24 2023-10-31 海南九芝堂药业有限公司 一种裸花紫珠鉴别方法
CN112268899A (zh) * 2020-10-15 2021-01-26 成都中医药大学 一种快速鉴别贝母类药材的方法
CN112268899B (zh) * 2020-10-15 2022-11-04 成都中医药大学 一种快速鉴别贝母类药材的方法
CN113406257A (zh) * 2021-05-13 2021-09-17 江西普正制药股份有限公司 基于谱效相关性的裸花紫珠收敛作用物质评价方法
CN113418996A (zh) * 2021-05-13 2021-09-21 江西普正制药股份有限公司 基于谱效相关性的裸花紫珠抗菌作用物质评价方法
CN113702557A (zh) * 2021-08-12 2021-11-26 江西普正制药股份有限公司 一种具有止血凝血作用的裸花紫珠有效成分的评价方法
WO2023015660A1 (zh) * 2021-08-12 2023-02-16 江西普正制药股份有限公司 一种具有止血凝血作用的裸花紫珠有效成分的评价方法
CN113702519A (zh) * 2021-08-13 2021-11-26 江西普正制药股份有限公司 一种具有抗炎作用的裸花紫珠有效成分的评价方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110568113A (zh) 一种裸花紫珠的活性特征指纹色谱及其快速鉴别方法
Han et al. Chemical fingerprinting of Gardenia jasminoides Ellis by HPLC–DAD–ESI-MS combined with chemometrics methods
Zhu et al. Fingerprint analysis of Radix Aconiti using ultra-performance liquid chromatography–electrospray ionization/tandem mass spectrometry (UPLC–ESI/MSn) combined with stoichiometry
Cui‐ping et al. Development of high‐performance liquid chromatographic for quality and authenticity control of Chinese propolis
Guo et al. Chemical comparison of Tripterygium wilfordii and Tripterygium hypoglaucum based on quantitative analysis and chemometrics methods
Su et al. Online identification of the antioxidant constituents of traditional Chinese medicine formula Chaihu-Shu-Gan-San by LC–LTQ-Orbitrap mass spectrometry and microplate spectrophotometer
Zhang et al. Simultaneous determination of 16 phenolic constituents in Spatholobi Caulis by high performance liquid chromatography/electrospray ionization triple quadrupole mass spectrometry
Gouveia et al. Validation of a HPLC-DAD–ESI/MSn method for caffeoylquinic acids separation, quantification and identification in medicinal Helichrysum species from Macaronesia
Li et al. Analysis of nine compounds from Alpinia oxyphylla fruit at different harvest time using UFLC-MS/MS and an extraction method optimized by orthogonal design
Liu et al. Rapid analysis of 27 components of Isodon serra by LC–ESI-MS–MS
Xu et al. Characterisation of polyphenol constituents of Linderae aggregate leaves using HPLC fingerprint analysis and their antioxidant activities
Yu et al. Qualitative and quantitative analysis of phenolic compounds in the leaves of Aquilaria sinensis using liquid chromatography–mass spectrometry
Li et al. A rapid and simple determination of protoberberine alkaloids in Rhizoma Coptidis by 1H NMR and its application for quality control of commercial prescriptions
Kim et al. Chemical fingerprinting of Codonopsis pilosula and simultaneous analysis of its major components by HPLC–UV
Guo et al. Comparison of Artemisiae argyi Folium and Artemisiae lavandulaefoliae Folium by simultaneous determination of multi‐components with single reference standard method and chemometric analysis
Chen et al. Determination of four major saponins in the seeds of Aesculus chinensis Bunge using accelerated solvent extraction followed by high-performance liquid chromatography and electrospray-time of flight mass spectrometry
Li et al. Chromatographic fingerprints analysis and determination of seven components in Danmu preparations by HPLC–DAD/QTOF-MS
Zhou et al. Simultaneous quantitative analysis of 11 flavonoid derivatives with a single marker in persimmon leaf extraction and evaluation of their myocardium protection activity
Chen et al. A new strategy for quality control and qualitative analysis of Yinhuang preparations by HPLC-DAD-MS/MS
Dhalwal et al. Optimization and validation of reverse phase HPLC and HPTLC method for simultaneous quantification of vasicine and vasicinone in Sida Species
Zhai et al. Discrimination of toxic ingredient between raw and processed Pinellia ternata by UPLC/Q-TOF-MS/MS with principal component analysis and T-test
CN112858549A (zh) 一种双黄连口服液定量指纹图谱质量监测方法
Wei et al. Detecting kinsenoside from Anoectochilus roxburghii by HPLC‐ELSD with dual columns of NH2 and AQ‐C18
Lü et al. Quality evaluation of Angelica sinensis by simultaneous determination of ten compounds using LC-PDA
Yang et al. An efficient method for qualitation and quantitation of multi-components of the herbal medicine Qingjin Yiqi Granules

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20191213