CN113834881B - 一种裸花紫珠鉴别方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及药物分析技术领域，具体为一种裸花紫珠鉴别方法。本发明通过LC‑MS对紫珠属植物进行代谢组分析，结合数理统计分析，从紫珠属植物的所有代谢物中广泛筛选，得到能够用于区分裸花紫珠与其他紫珠属植物的关键指标成分，结合聚类分析，实现更精准的区分裸花紫珠与其他紫珠属植物。
Description
技术领域
本发明涉及中药药物分析技术领域，具体为一种裸花紫珠快速鉴别方法。
背景技术
裸花紫珠(Callicarpa nudiflora Hook.etArn)，是一种常用的海南传统民族药材，具有抗菌止血、消炎解毒、散瘀消肿、祛风祛湿功效，用于跌打肿痛、风湿肿痛、肺结核咳血、胃肠出血等症。
近年来，随着裸花紫珠系列产品的临床疗效获得医生和患者的认可和广泛使用，国内外对裸花紫珠的研究热度也越来越高，裸花紫珠因具有治疗效果好、副作用小等优点，裸花紫珠制剂市场占有额也逐年增长，在利益的驱使下，现今市场上裸花紫珠基源应用混乱，同物异名、同名异物现象也较为严重。
在CN110568113A专利申请公开了一种裸花紫珠活性特征的指纹图谱及其快速鉴别方法，以相似度评价和主成分分析评价来快速鉴别裸花紫珠，其主要通过采用二极管阵列检测器和QTOF-MS/MS对裸花紫珠活性特征指纹图谱在线快速成分分析和鉴定苯丙烯酸类衍生物与黄酮类成分峰；以相似度评价和主成分分析评价快速鉴别裸花紫珠与其它紫珠属药材。该申请文件中提供了裸花紫珠与云南杜虹花、广东紫珠、大叶紫珠、小叶紫珠、批把叶紫珠的鉴别，所选取的区别成分为苯丙烯酸类衍生物与黄酮类成分，共19个共有峰。
由于紫珠属的植物种类较多，需要一种更精准的鉴别方法，来实现对裸花紫珠原药材的质控研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种裸花紫珠鉴别方法，包括：建立紫珠属植物的化合物数据库，用LC-MS检测及代谢组学分析(如QI软件)提取紫珠属植物的成分的色谱、质谱信息；结合化学计量学方法对已测定的色谱、质谱信息进行统计学分析，筛选出指标成分，用于快速鉴别裸花紫珠。
进一步地，所述的一种裸花紫珠鉴别方法，包括下列内容：建立紫珠属植物的化合物数据库，用LC-MS检测及代谢组学分析(如QI软件)提取紫珠属植物的成分的色谱、质谱数据信息；结合化学计量学方法对已测定的色谱、质谱数据信息进行统计学分析，筛选出指标成分，将待测样品的色谱、质谱数据信息导入到分析软件(如Ezinfo软件)中进行PCA统计分析，通过样品聚类情况鉴别样品是否为裸花紫珠。
进一步的，所述的一种裸花紫珠鉴别方法，所述LC-MS检测步骤，包含紫珠属植物供试品溶液的制备，确定LC-MS(如UPLC-MS)分析条件，将制备的紫珠属植物样品进样，测定。
进一步的，所述的一种裸花紫珠鉴别方法，其所述LC-MS检测步骤，其中紫珠属植物供试品溶液的制备方法：取紫珠属植物样品，烘干并粉碎后，加入10-30倍的50-90％的醇类溶剂超声提取20-40min，超声1-3次，10000-15000r离心10-20min，取上清液，过0.22μm滤膜，备用，分别取等量不同种的紫珠属植物样品溶液混合均匀后作为混合样品；其中，醇类溶剂的浓度优选为50-80％或60-90％或70-80％，醇类溶剂为甲醇或乙醇，超声时间优选为为25-35分钟。
进一步的，所述的一种裸花紫珠鉴别方法，其所述LC-MS检测步骤，液相色谱条件和质谱分析条件为：(1)液相色谱条件为：色谱柱：HSS T3超高效液相色谱柱，柱温：40℃，流动相A：0.1％甲酸乙腈；流动相B：0.1％甲酸水，梯度洗脱程序：(0～0.1)min,6％A；(0.1～1.7)min,6％→10％A；(1.7～7.2)min,10％→18％A；(7.2～8.1)min,18％→21％A；(8.1～10.1)min,21％→23％A；(10.1～15.2)min,23％→28％A；(15.2～16.2)min,28％→34％A；(16.2～24.2)min，34％→39％A；(24.2～35.2)min,39％→46％A；(35.2～37.5)min,46％→55％A；(37.5～40.5)min,55％→80％A；(40.5～42.0)min,80％→98％A；(42.0～46.0)min,98％A，流速0.5mL/min；(2)质谱分析条件为：高分辨质谱系统：仪器：沃特世Zevo-G2-SQ TOF，离子化模式：电喷雾正、负离子，毛细管电压：2.5KV(-)；0.5(+)，锥孔电压：40V，除溶剂气体：900L/h，离子源温度：100℃，除溶剂温度：450℃，采集范围：50～1500Da，碰撞气体：氩气，碰撞能量：低能量扫描：6EV，高能量扫描：正离子35-50eV，负离子45-70eV。
更进一步地，所述一种裸花紫珠鉴别方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)建立紫珠属植物的化合物数据库；
(2)对照品溶液的制备：分别称取原儿茶酸，连翘脂苷E，山栀子苷甲酯，莫诺苷，原儿茶醛，刺五加苷B，咖啡酸，阿魏酸，胡黄连苷Ⅲ，连翘脂苷B，连翘脂苷A，木犀草苷，毛蕊花糖苷，金石蚕苷，异毛蕊花糖苷，异鼠李素-3-O-葡萄糖苷，槲皮素，木犀草素，芹菜素，异鼠李素等中的多个对照品适量，制备成适宜浓度的对照品溶液；
(3)供试品溶液的制备：分别将紫珠属植物样品烘干并粉碎，20倍70％的乙醇超声提取30min，超声2次，12000r离心15min，取上清液，过0.22μm滤膜，备用，分别取等量不同种的紫珠属植物样品溶液混合均匀后作为混合样品；
(4)LC-MS检测：
色谱条件：色谱柱：HSS T3超高效液相色谱柱，柱温：40℃，流动相A：0.1％甲酸乙腈；流动相B：0.1％甲酸水，梯度洗脱程序：(0～0.1)min,6％A；(0.1～1.7)min,6％→10％A；(1.7～7.2)min,10％→18％A；(7.2～8.1)min,18％→21％A；(8.1～10.1)min,21％→23％A；
(10.1～15.2)min,23％→28％A；(15.2～16.2)min,28％→34％A；(16.2～24.2)min，34％→39％A；(24.2～35.2)min,39％→46％A；(35.2～37.5)min,46％→55％A；(37.5～40.5)min,55％→80％A；(40.5～42.0)min,80％→98％A；(42.0～46.0)min,98％A，流速0.5mL/min；
高分辨质谱系统：仪器：沃特世Zevo-G2-S Q TOF，离子化模式：电喷雾正、负离子，毛细管电压：2.5KV(-)；0.5(+)，锥孔电压：40V，除溶剂气体：900L/h，离子源温度：100℃，除溶剂温度：450℃，采集范围：50至1500Da质荷比，碰撞气体：氩气，碰撞能量：低能量扫描：6EV，高能量扫描：正离子35-50eV，负离子45-70eV；
吸取步骤(2)、(3)所得对照品溶液、供试品溶液0.1～10uL，注入超高效液相色谱仪中，按拟定色谱、质谱条件进行LC-MS测定，记录色谱、质谱数据信息；
(5)指标成分筛选：
将步骤(4)中所得色谱、质谱数据信息导入Progenesis QI软件中进行处理，将得到的所有代谢物的数据集导入到EZinfo软件中，进行PCA、PLS-DA、OPLS-DA的分析，将不同样品之间VIP最高的10-100个化合物作为潜在的指标成分，再结合S-PLOT图，找得到裸花紫珠中对裸花紫珠和其它紫珠之间差异贡献较大的成分5-100个，作为潜在的指标成分，综合分析，并最终筛选出指标成分；
(6)样品测定：
将待测样品，按步骤(2)～(4)测定其色谱、质谱数据信息，经步骤(5)中的代谢组学分析软件(Progenesis QI等)处理后，得到的所有代谢物的数据集和最终筛选出的指标成分信息导入同一分析软件(EZinfo或Simca-p等)中，进行PCA分析，通过样品聚类情况鉴别样品是否为裸花紫珠。
更进一步的，上述步骤(2)优选为：对照品溶液的制备：分别称取对照品原儿茶酸，连翘脂苷E，山栀子苷甲酯，莫诺苷，原儿茶醛，刺五加苷B，咖啡酸，阿魏酸，胡黄连苷Ⅲ，连翘脂苷B，连翘脂苷A，木犀草苷，毛蕊花糖苷，金石蚕苷，异毛蕊花糖苷，异鼠李素-3-O-葡萄糖苷，槲皮素，木犀草素，芹菜素，异鼠李素等各约5mg，加入到10mL容量瓶中，然后加入70％乙醇溶解定容，作为母液备用。将母液逐级2或2.5倍稀释，一直到1ng/μL备用，即分别为500、250、100、50、25、10、5、2、1ng/μL的对照品溶液。
更进一步的，上述步骤(3)优选为：供试品溶液的制备：分别将不同种的紫珠属植物样品(包括裸花紫珠、大叶紫株、广东紫珠、白毛紫珠、杜虹花、短柄紫珠、尖尾枫、长叶紫珠、紫珠等)烘干并粉碎，准确称取各样品0.1g，20倍70％的乙醇超声提取30min，超声2次，12000r离心15min，取上清液，过0.22μm滤膜，备用，分别取不同紫珠的样品溶液各100μL混合均匀后作为混合样品。
本发明所述的筛选出的指标成分包含以下成分：毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、nudifloside，槲皮素-7-O-葡萄糖苷，6″-O-trans-caffeoylcatalpol，木犀草苷、木犀草素-4'-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，linearoside。
进一步的，本发明所述的筛选出的指标成分包含以下成分：毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、nudifloside，槲皮素-7-O-葡萄糖苷，6″-O-trans-caffeoylcatalpol，木犀草苷、木犀草素-4'-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，linearoside，(10α)-16α,17,19-trihydroxykaurane-18-oic acid。
上述筛选出的指标成分的化合物结构图见附图28。
为更好的表明本发明的实质，将本发明中的UPLC-MS分析条件考察如下：
1.仪器设备与材料及样品
Acquity UPLC-I-Class超高效液相串联Xevo-G2-S Q-TOF高分辨质谱仪，Masslynx 4.1质谱工作站和Empower 3软件(Waters公司，美国)；BEH C18超高效液相色谱柱(2.1x100mm,1.7μm)和HSST3超高效液相色谱柱(2.1x100mm,1.8μm)。分析天平(梅特勒-托利多，瑞士)；粉碎机为Retsch MM400球磨机(莱驰公司，德国)；离心机(Eppendorf公司，德国)；KQ-100DE超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；0.22μm注射器式滤器(Pall公司，美国)。
色谱级乙腈、甲醇(Merck公司，德国)；超纯水由Milli-Q纯水系统制备(电阻≥18.2MΩ，Millipore公司，美国)。原儿茶酸，连翘脂苷E，山栀子苷甲酯，莫诺苷，原儿茶醛，刺五加苷B，咖啡酸，阿魏酸，胡黄连苷Ⅲ，连翘脂苷B，连翘脂苷A，木犀草苷，毛蕊花糖苷，金石蚕苷，异毛蕊花糖苷，异鼠李素-3-O-葡萄糖苷，槲皮素，木犀草素，芹菜素，异鼠李素均购自北京融城鑫德科技有限公司提供，纯度≥98％。
采收裸花紫珠、大叶紫珠、广东紫珠、杜虹花、尖尾枫、长叶紫珠、紫珠、白毛紫珠、短柄紫珠等不同品种的紫珠属植物样本(包括不同产地、不同采集时间、不同生长时间等)，样品信息见下表1。
表1收集的不同种紫珠样品信息
注：其中S78-81为紫珠属植物，但不属于是S1-77所示的种，尚未鉴定到具体种。
2.UPLC-MS分析条件
超高效液相系统：仪器：WatersACQUITY I Class UPLC，
液相条件1：色谱柱：HSS T3超高效液相色谱柱，柱温：40℃，流动相：A：乙腈+0.1％甲酸，B：水+0.1％甲酸，梯度洗脱程序：(0～0.5)min,5％→10％A；(0.5～10.2)min,10％→28％A；(10.2～11.2)min,28％→40％A；(11.2～21.0)min,40％→58％A；(21.0～23.5)min,58→90％A；(23.5～24.5)min,90％→98％A；(24.5～27.5)min98％A；(27.5～28)min,98％→5％A；(28～31)min,5％A；流速0.5mL/min。
液相条件2：色谱柱：HSS T3超高效液相色谱柱，柱温：40℃，流动相：A：乙腈+0.1％甲酸，B：水+0.1％甲酸，梯度洗脱程序：(0～0.1)min,6％A；(0.1～1.7)min,6％→10％A；(1.7～7.2)min,10％→18％A；(7.2～8.1)min,18％→21％A；(8.1～10.1)min,21％→23％A；(10.1～15.2)min,23％→28％A；(15.2～16.2)min,28％→34％A；(16.2～24.2)min，34％→39％A；(24.2～35.2)min,39％→46％A；(35.2～37.5)min,46％→55％A；(37.5～40.5)min,55％→80％A；(40.5～42.0)min,80％→98％A；(42.0～46.0)min,98％A。流速0.5mL/min。
高分辨质谱系统：仪器：沃特世Zevo-G2-S Q TOF，离子化模式：电喷雾正、负离子，毛细管电压：2.5KV(-)；0.5(+)，锥孔电压：40V，除溶剂气体：900L/h，离子源温度：100℃，除溶剂温度：450℃，采集范围：50至1500Da质荷比，碰撞气体：氩气，碰撞能量：低能量扫描：6EV，高能量扫描：35-50eV，负离子45-70eV。
3.提取溶剂的选择：
对紫珠或裸花紫珠提取常用溶剂分别为纯水和70％(v/v)的乙醇-水，代谢组分析一般选择70％甲醇-水，药典中紫珠提取多用50％甲醇-水，但裸花紫珠相关含量测定用的是70％甲醇-水。考虑乙醇毒副作用小，我们选取纯水和70％(v/v)的乙醇-水分别对部分样品进行预实验。由图1可以看出，不管是在正负离子模式下，由纯水作为溶剂提取得到的裸花紫珠化学成分通过70％乙醇提取完全可以获得，且70％乙醇作为溶剂提取还可以得到纯水未提取到的化学成分，所以最终确定裸花紫珠样品的提取溶剂为70％乙醇。
4.紫珠UPLC-MS分析条件的优化
4.1供试品溶液的制备：分别将不同中的紫珠属植物样品(裸花紫珠、大叶紫株、广东紫珠、白毛紫珠、杜虹花、短柄紫珠、尖尾枫、长叶紫珠、紫珠)烘干并粉碎，准确称取各样品0.1g，20倍70％的乙醇超声提取30min，超声2次。12000r离心15min，取上清液，过0.22μm滤膜，作为各紫珠样品溶液备用。分别取不同紫珠的样品溶液各100μL混合均匀后作为混合样品作为质控使用。
4.2对照品的制备：根据文献和前期实验的结果，购买了相应的对照品。分别称取对照品原儿茶酸，连翘脂苷E，山栀子苷甲酯，莫诺苷，原儿茶醛，刺五加苷B，咖啡酸，阿魏酸，胡黄连苷Ⅲ，连翘脂苷B，连翘脂苷A，木犀草苷，毛蕊花糖苷，金石蚕苷，异毛蕊花糖苷，异鼠李素-3-O-葡萄糖苷，槲皮素，木犀草素，芹菜素，异鼠李素等各约5mg，加入到10mL容量瓶中，然后加入70％乙醇溶解定容，作为母液备用。将母液逐级2或2.5倍稀释，一直到1ng/μL备用，即分别为500、250、100、50、25、10、5、2、1ng/μL的对照品溶液。
虽然质谱可以将共流出峰进行区分，但如果样品的基础信息不熟悉，共流出的离子有时也很难判断纯度和二级离子的具体归属，所以色谱条件的优化十分重要。通过比较HHS T3色谱柱和BEH C18柱，发现T3色谱柱的分离效果较好，比较甲醇-水和乙腈水系统，发现乙腈-水系统分离效果稍好，且系统压力较小，所以使用乙腈水系统进行进一步优化。为了改善峰形和增加分子离子峰的判别，分别在水和乙腈中添加了0.1％的甲酸。通过研究样品的深入和定量需求的提升，不同阶段的分析条件有几次进一步优化，具体梯度程序见UPLC-MS分析条件中的液相条件。质谱上为了更好的得到分子离子峰和碎片峰，对质谱高低能量扫描的碰撞能量进行了优化，可以得到更多的结构碎片信息。
根据紫珠属中文献报道和UPLC-MS预分析的结果，通过购买对照品(具体结构见图2)，对定性结果进一步确认的同时对裸花紫珠中含量较高的化学成分可以进行定量分析。混合对照品的溶液的UPLC-MS基峰离子流(BPI)色图谱见图3(分析中使用液相条件1)，裸花紫珠混合样品与混合标准品溶液的UPLC-MS图谱见图4。由图3和4可以看出，裸花紫珠中化学成分较为复杂，但该条件基本可以将紫珠中的化合物进行较好的表征，对照品的分离度良好。
通过对色谱分离条件进行了进一步优化即液相条件2，并将样品中含量较高的化合物和对照品进行了比对分析，见图5和图6，对照品得到了完全分离。这样保证化合物的良好分离，从而使在低能量时质谱图中尽量只显示分子离子峰，而且是尽量少的分子离子，这样对判断高能量质谱信息中的碎片离子归属有很大帮助，减少化合物鉴定的难度，增加鉴定的准确度。
本发明的有益效果在于：由于紫珠属的植物种类较多，在申请人项目研究过程中，考察了与裸花紫珠亲缘关系较近的多种紫珠属植物，并从通过检索众多的紫珠属植物的化合物并建立相应的数据库，通过LC-MS检测并结合数理统计分析，从紫珠属植物的所有代谢物中广泛筛选，得到能够用于区分裸花紫珠与其他紫珠属植物的关键指标成分，结合聚类分析，实现更精准的区分裸花紫珠与其他紫珠属植物。本发明技术方案并非人为地选择指定某些共有峰或个别鉴定成分(这种情况会忽略了对大部分的代谢物的分析)作为鉴别比对对象，因此本发明技术方案是一种更精准的鉴别方法，可实现裸花紫珠与其它紫珠属植物的快速精准区分，可快速鉴别裸花紫珠药材。
附图说明
图1裸花紫珠水和70％乙醇提取物正负离子模式图，(a)为负离子模式(红色为70％乙醇提取，蓝色为水提液)，(b)为正离子模式(红色为70％乙醇提取，蓝色为水提液)
图2对照品的结构图：原儿茶酸(1)，原儿茶醛(2)，连翘脂苷E(3)，咖啡酸(4)，阿魏酸(5)，胡黄连苷Ⅲ(6)，连翘脂苷B(7)，连翘脂苷A(8)，槲皮素-7-O-葡萄糖苷(9)，金石蚕苷(10)，毛蕊花糖苷(11)，异毛蕊花糖苷*(12)，异鼠李素-3-O-葡萄糖苷(13)，木犀草苷(14)，木犀草素-4'-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(15)，槲皮素*(16)，木犀草素*(17)，芹菜素*(18)，异鼠李素(19)
图3混合对照品溶液的UPLC-Q-TOF MS的BPI图
1-原儿茶酸，2-连翘脂苷E，3-山栀子苷甲酯，4-莫诺苷，5-原儿茶醛，6-刺五加苷B，7-咖啡酸，8-阿魏酸，9-胡黄连苷Ⅲ，10-连翘脂苷B，11-槲皮素-7-O-葡萄糖苷，12-连翘脂苷A，13-木犀草苷，14-毛蕊花糖苷，15-金石蚕苷，16-异毛蕊花糖苷，17-异鼠李素-3-O-葡萄糖苷，18-槲皮素，19-木犀草素，20-芹菜素，21-异鼠李素
图4裸花紫珠混合样品及混合对照品溶液的UPLC-Q-TOF MS的BPI对比图
图5裸花紫珠、不同紫珠混合液及对照品溶液的UPLC-Q-TOF MS的BPI对比图
图6不同紫珠混合样及对照品溶液的UPLC-Q-TOF MS的BPI对比放大图(2-17min)
图7咖啡酸的正负离子质谱图，a正离子高能量，b正离子低能量，c负离子高能量，d负低子高能量
图8毛蕊花糖苷的正负离子高低能量下的质谱图，a正离子高能量，b正离子低能量，c负离子高能量，d负低子高能量
图9异毛蕊花糖苷的正负离子高低能量下的质谱图，a正离子高能量，b正离子低能量，c负离子高能量，d负低子高能量
图10胡黄连苷III的正负离子高低能量质谱图，a负低子低能量，b负离子高能量，c正离子低能量，d正离子高能量。
图11连翘酯苷E的正负离子质谱图，a正离子高能量，b正离子低能量，c负离子高能量，d负低子低能量
图12异鼠李素-3-O-葡萄糖苷的正负离子质谱图，a正离子高能量，b正离子低能量，c负离子高能量，d负低子低能量
图13木犀草苷的正负离子质谱图，a负离子低能量，b负离子高能量，c正离子低能量，d正低子高能量
图14槲皮素的正负离子质谱图，a正离子高能量，b正离子低能量，c负离子高能量，d负低子低能量。
图15不同种紫珠属植物混合样品UPLC-Q-TOF MS的负离子BPI图谱
图16不同种紫珠属植物混合样品UPLC-Q-TOF MS的3D图谱
图17Unify软件鉴定紫珠化合物的结果
图18不同种紫珠属植物样品UPLC-Q-TOF MS的BPI比较图谱
图19不同种紫珠属植物样品的UPLC-Q-TOF MS的BPI比较的局部放大图谱
图20长叶、大叶、广东、裸花紫珠和紫珠样品UPLC-Q-TOF MS的BPI图谱
图21不同裸花紫珠样品UPLC-Q-TOF MS的BPI图谱
图22不同紫珠样品UPLC-Q-TOF MS的BPI图谱中7～11min主要色谱峰的归属
图23不同种紫珠属植物样品的PCA和PLS-DA得分图
图24不同种紫珠属植物样品的PCA得分图和3D图
图25不同中紫珠属植物样品的PLS-DA得分图和3D图
图26裸花紫珠和其它不同种紫珠属植物的OPLS-DA分析及两者之间主要差异化合物
图27裸花紫珠和其它不同种紫珠属植物的OPLS-DA分析及两者之间主要差异化合物
图28指标成分化合物结构图，其中1、毛蕊花糖苷；2、异毛蕊花糖苷；3、nudifloside；4、槲皮素-7-O-葡萄糖苷；5、6″-O-trans-caffeoylcatalpol；6、木犀草苷；7、木犀草素-4'-O-β-D-吡喃葡萄糖苷；8、linearoside；9、(10α)-16α,17,19-trihydroxykaurane-18-oic acid。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1
一种裸花紫珠鉴别方法：
1、建立紫珠属化合物数据库
通过文献系统查阅综述了紫珠属的化学研究，总结了302个化合物的结构式、分子式、分子量，并将这些信息输入Unify的数据库，以备后期利用LC-MS进行紫珠中化合物的结构鉴定。具体化合物信息见表2。
表2紫珠属中总结的化合物名称和分子式
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2不同种紫珠属植物样品化学成分的UPLC-MS分析鉴定
2.1对照品溶液的制备：分别称取对照品原儿茶酸，连翘脂苷E，山栀子苷甲酯，莫诺苷，原儿茶醛，刺五加苷B，咖啡酸，阿魏酸，胡黄连苷Ⅲ，连翘脂苷B，连翘脂苷A，木犀草苷，毛蕊花糖苷，金石蚕苷，异毛蕊花糖苷，异鼠李素-3-O-葡萄糖苷，槲皮素，木犀草素，芹菜素，异鼠李素各约5mg，加入到10mL容量瓶中，然后加入70％乙醇溶解定容，作为母液备用。将母液逐级2或2.5倍稀释，一直到1ng/μL备用，即分别为500、250、100、50、25、10、5、2、1ng/μL的对照品溶液。
2.2供试品溶液的制备：分别将不同种的紫珠属植物样品即裸花紫珠、大叶紫株、广东紫珠、白毛紫珠、杜虹花、短柄紫珠、尖尾枫、长叶紫珠、紫珠等烘干并粉碎，准确称取各样品0.1g，20倍70％的乙醇超声提取30min，超声2次，12000r离心15min，取上清液，过0.22μm滤膜，备用，分别取不同紫珠的样品溶液各100μL混合均匀后作为混合样品。
2.3 LC-MS检测
色谱条件：色谱柱：HSS T3超高效液相色谱柱，柱温：40℃，流动相A：0.1％甲酸乙腈；流动相B：0.1％甲酸水，梯度洗脱程序：(0～0.1)min,6％A；(0.1～1.7)min,6％→10％A；(1.7～7.2)min,10％→18％A；(7.2～8.1)min,18％→21％A；(8.1～10.1)min,21％→23％A；(10.1～15.2)min,23％→28％A；(15.2～16.2)min,28％→34％A；(16.2～24.2)min，34％→39％A；(24.2～35.2)min,39％→46％A；(35.2～37.5)min,46％→55％A；(37.5～40.5)min,55％→80％A；(40.5～42.0)min,80％→98％A；(42.0～46.0)min,98％A，流速0.5mL/min；
高分辨质谱系统：仪器：沃特世Zevo-G2-S Q TOF，离子化模式：电喷雾正、负离子，毛细管电压：2.5KV(-)；0.5(+)，锥孔电压：40V，除溶剂气体：900L/h，离子源温度：100℃，除溶剂温度：450℃，采集范围：50至1500Da质荷比，碰撞气体：氩气，碰撞能量：低能量扫描：6EV，高能量扫描：正离子35-50eV，负离子45-70eV；
吸取步骤2.1、2.2所得对照品溶液、供试品溶液0.2～0.5uL，注入超高效液相色谱仪中，按拟定色谱、质谱条件进行LC-MS测定，记录色谱、质谱数据信息。
在进样分析后，根据对照品的质谱信息(保留时间、分子离子峰及其碎片离子)分别和紫珠属植物样品中所含化学成分对比分析，确定样品中是否含有这些对照品。
所述对照品可以分为5类化合物，酚酸类(原儿茶酸、原儿茶醛、咖啡酸、阿魏酸)，苯丙素苷类(胡黄连苷Ⅲ、连翘脂苷B、连翘脂苷A、毛蕊花糖苷、金石蚕苷、异毛蕊花糖苷)、苯乙醇苷类(连翘脂苷E)、黄酮苷类(槲皮素-7-O-葡萄糖苷、木犀草苷、异鼠李素-3-O-葡萄糖苷、木犀草素-4'-O-β-D-吡喃葡萄糖苷)和黄酮苷元类(槲皮素、木犀草素、芹菜素、异鼠李素)化合物。
通过分析对照品和样品的色谱图和质谱图，我们发现，样品中22个对照品的含量差异较大，具体指认结果见图3和表3。其中原儿茶酸，连翘脂苷E，原儿茶醛，咖啡酸，阿魏酸，胡黄连苷Ⅲ，连翘脂苷B，木犀草苷，毛蕊花糖苷，异毛蕊花糖苷，槲皮素，木犀草素，芹菜素和异鼠李素这14种化合物在裸花紫珠样品中具有一定的含量；山栀子苷甲酯，莫诺苷，刺五加苷B，金石蚕苷，异鼠李素-3-O-葡萄糖苷、连翘脂苷A和槲皮素-7-O-葡萄糖苷在裸花紫珠的样品中含量极低甚至不含，在提取离子流色谱图中(EIC)中能够大概看到分子量，在UV中基本达不到其最低检测灵敏度，但金石蚕苷在广东紫珠中含量较高。
表3 22个对照品的保留时间，分子量和分子式
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*为对照品，紫珠属植物中含有，**为对照品，但紫珠属植物不含。
为了利用我们总结的化合物库进行已知化合物的结构鉴定，我们将总结的化合物名称、结构式、分子式导入到UNIFY软件中，建立紫珠属植物高分辨质谱数据的处理方法。然后将紫珠属植物Continuum的数据导入到UNIFY软件中作为待处理数据，用编好的处理方法进行数据分析。软件可以自动进行峰提取、峰合并、峰鉴定的处理，然后将得到的峰的高分辨数据和库中化合物的理论分子量进行自动匹配，数据偏差较小的(10PPM)以内，可以认为为已鉴定化合物，匹配不上的化合物作为未鉴定化合物。UNIFY处理的数据色谱图见图15和16，UNIFY鉴定的结果见图17。
在负离子中，已鉴定的化合物有2284个(有重复的结果)，通过人工进一步查看数据，除去同一个化合物可能的同分异构体，删除含量太低二级碎片不清楚的化合物，以及化合物分子式判断错误的情况，确定鉴定的已知化合物；为未鉴定的化合物，通过人工鉴定，即通过精确分子量、特征碎片离子、保留时间、CLogP值、已有化合物结构特点、对照品的质谱裂解和色谱保留行为，并结合Chemspider等数据库，鉴定未鉴定的化合物，得到未鉴定的化合物结构，其中有已知化合物和可能的新化合物。最终确定了171个化合物的可能结构，见表4
表4紫珠属中鉴定化合物的UPLC-MS数据(171个)
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3.指标成分筛选，通过液质数据处理多元统计分析
3.1不同种紫珠属植物指纹图谱分析
为了整体分析裸花紫珠与其它紫珠之间的差异，对收集得到的不同种紫珠属植物样品进行提取制备，提取液进行液质分析，得到了不同紫珠的UPLC-MS的指纹表征图谱。分别进行不同种紫珠之间色谱图之间的比较，直观的研究不同种紫珠之间的异同。不同紫珠的UPLC-MS对比叠加比较见图18-22。
从图18可知，不同紫珠之间的差异较大，尤其是尖尾枫、短柄紫珠、杜虹花和其它紫珠差异较大。将前16min的色谱图放大比较(图19)，更清晰的发现尖尾枫、短柄紫珠、杜虹花、白毛紫珠和其它紫珠差异较大。将差异较大的紫珠删除，只是比较长叶紫珠、大叶紫珠、广东紫珠、裸花紫珠和紫珠(图20)，整体上大叶紫珠和裸花紫珠更为相似，不同紫珠之间主要差异在17mi n后的色谱图，不同紫珠之间有很多色谱峰有无的差异，17mi n之前好像更多的是含量高低的差异。
图21显示了不同产地裸花紫珠之间UPLC-MS色谱图的比较：不同产地裸花紫珠之间整体较为一致，差异较小，主要是在保留时间较长的一些化合物有一定的差异，南巴的样品较其他样品明显差异稍大。
根据化合物鉴定的结果，在图22中，指认了不同种紫珠属植物中一些主要色谱峰的结构，可以看到主要差异物的结构。为了进一步明确不同紫珠的差异情况，需要利用QI和EZinfo对不同紫珠的UPLC-MS数据进行了多元统计分析。
不同种紫珠属植物的LC-MS数据导入到Progenesis QI软件中，自动进行峰对齐、峰提取等处理，得到的二维数据集导入到Ezinfo软件中进行统计分析。
图22和23的PCA图上可以看出，不管是正负模式的数据，裸花紫珠均单独聚为一类，可以很好的和其它紫珠进行区分；其它紫珠中，尖尾枫和其它紫珠也可以聚类区分。从PLS-DA的得分图和3D图中可以看到，裸花紫珠可以和其它紫珠进行聚类分离，裸花紫珠内部差异较小。这一结果和直接在UPLC-Q-TOF MS色谱上看的结果基本一致。
3.2裸花紫珠和其它紫珠的差异分析
为了明确裸花紫珠和其它紫珠之间化学成分的具体差异，将裸花紫珠单独分为一组，其它紫珠为一组进行了进一步的OPLS-DA的分析，见图26和27。利用S-PLOT图谱找出对两组差异贡献较大的Markers，对照上面鉴定结果进行比对鉴定，分析其中裸花紫珠中含量明显较高的Markers(表5)进行鉴定，并结合VIP值(表6)可以确定裸花紫珠区分其它紫珠的关键Markers。两次不同样品的分析结果基本一致，即图26和27中的代谢物基本相同。通过最终筛选出的9个指标成分(表5中鉴定了9个主要的差异化合物分别为：毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、nudifloside，槲皮素-7-O-葡萄糖苷，6″-O-trans-caffeoylcatalpol，木犀草苷、木犀草素-4'-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，linearoside，(10α)-16α,17,19-trihydroxykaurane-18-oic acid。)，这9个最终筛选出来的指标成分的化合物结构图见附图28。
这一结果和前面直接图谱得到的结果基本一致。
表5 OPLS-DA分析S-Plot图中裸花紫珠中含量较高区分其它不同种紫珠属植物样品的Markers鉴定
表6 OPLS-DA分析裸花紫珠和其它紫珠样品的VIP最高的前99个化合物
4.待测样品分析：
供试品溶液的制备：分别将待测样品烘干并粉碎，样品烘干并粉碎，准确称取各样品0.1g，20倍70％的乙醇超声提取30min，超声2次，12000r离心15min，取上清液，过0.22μm滤膜，即得；
吸取供试品溶液0.2～0.5uL，注入超高效液相色谱仪中，按2.3项下拟定色谱、质谱条件进行LC-MS测定，记录色谱、质谱数据信息；
将待测样品色谱、质谱数据信息，经3.项下代谢组学分析软件Progenesis QI处理后，得到的所有代谢物的数据集和最终筛选出来的指标成分信息导入同一分析软件EZinfo中，进行PCA分析，通过样品聚类情况鉴别样品是否为裸花紫珠。
Claims (10)
1.一种裸花紫珠鉴别方法，其特征在于包括下列内容：建立紫珠属植物的化合物数据库；用LC-MS检测及代谢组学分析软件提取紫珠属植物的成分的色谱、质谱数据信息；结合化学计量学方法对已测定的色谱、质谱数据信息进行统计学分析，筛选出指标成分，用于快速鉴别裸花紫珠，所述LC-MS检测步骤，包含紫珠属植物供试品溶液的制备，确定UPLC-MS分析条件，将制备的紫珠属植物样品进样，测定；
其中紫珠属植物供试品溶液的制备方法：取紫珠属植物样品，烘干并粉碎后，加入10-30倍的50-90％的醇类溶剂超声提取20-40min，超声1-3次，10000-15000r离心10-20min，取上清液，过0.22μm滤膜，备用，分别取等量不同种的紫珠属植物样品溶液混合均匀后作为混合样品；
液相色谱条件和质谱分析条件为：
(1)液相色谱条件为：色谱柱：HSS T3超高效液相色谱柱，柱温：40℃，流动相A：0.1％甲酸乙腈；流动相B：0.1％甲酸水，梯度洗脱程序：(0～0.1)min，6％A；(0.1～1.7)min，6％→10％A；(1.7～7.2)min，10％→18％A；(7.2～8.1)min，18％→21％A；(8.1～10.1)min，21％→23％A；(10.1～15.2)min，23％→28％A；(15.2～16.2)min，28％→34％A；(16.2～24.2)min，34％→39％A；(24.2～35.2)min，39％→46％A；(35.2～37.5)min，46％→55％A；(37.5～40.5)min，55％→80％A；(40.5～42.0)min，80％→98％A；(42.0～46.0)min，98％A，流速0.5mL/min；
(2)质谱分析条件为：高分辨质谱系统：仪器：沃特世Zevo-G2-S Q TOF，离子化模式：电喷雾正、负离子，毛细管电压：-2.5KV；+0.5KV，锥孔电压：40V，除溶剂气体：900L/h，离子源温度：100℃，除溶剂温度：450℃，采集范围：50～1500Da，碰撞气体：氩气，碰撞能量：低能量扫描：6EV，高能量扫描：正离子35-50eV，负离子45-70eV；
所述指标成分包含以下成分：毛蕊花糖苷，异毛蕊花糖苷，nudifloside，槲皮素-7-O-葡萄糖苷，6″-O-trans-caffeoylcatalpol，木犀草苷，木犀草素-4'-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，linearoside。
2.根据权利要求1所述的一种裸花紫珠鉴别方法，其特征在于包括下列内容：建立紫珠属植物的化合物数据库；用LC-MS检测及代谢组学分析软件提取紫珠属植物的成分的色谱、质谱数据信息；结合化学计量学方法对已测定的色谱、质谱数据信息进行统计学分析，筛选出指标成分；将待测样品的色谱、质谱数据信息导入到分析软件中进行PCA统计分析，通过样品聚类情况鉴别样品是否为裸花紫珠。
3.根据权利要求1或2所述的一种裸花紫珠鉴别方法，其特征在于，所述LC-MS检测步骤，醇类溶剂的浓度为50-80％，醇类溶剂为甲醇或乙醇。
4.根据权利要求1或2所述的一种裸花紫珠鉴别方法，其特征在于，所述LC-MS检测步骤，醇类溶剂的浓度为60-90％，醇类溶剂为甲醇或乙醇。
5.根据权利要求1或2所述的一种裸花紫珠鉴别方法，其特征在于，所述LC-MS检测步骤，醇类溶剂的浓度为70-80％，醇类溶剂为甲醇或乙醇。
6.根据权利要求1所述的一种裸花紫珠鉴别方法，其特征在于，所述指标成分包含以下成分：毛蕊花糖苷，异毛蕊花糖苷，nudifloside，槲皮素-7-O-葡萄糖苷，6″-O-trans-caffeoylcatalpol，木犀草苷，木犀草素-4'-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，linearoside，
(10α)-16α,17,19-trihydroxykaurane-18-oic acid。
7.根据权利要求1或2所述的一种裸花紫珠鉴别方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)建立紫珠属植物的化合物数据库；
(2)对照品溶液的制备：分别称取原儿茶酸，连翘脂苷E，山栀子苷甲酯，莫诺苷，原儿茶醛，刺五加苷B，咖啡酸，阿魏酸，胡黄连苷Ⅲ，连翘脂苷B，连翘脂苷A，木犀草苷，毛蕊花糖苷，金石蚕苷，异毛蕊花糖苷，异鼠李素-3-O-葡萄糖苷，槲皮素，木犀草素，芹菜素，异鼠李素中的多个对照品适量，制备成适宜浓度的对照品溶液；
(3)供试品溶液的制备：分别将紫珠属植物样品烘干并粉碎，20倍70％的乙醇超声提取30min，超声2次，12000r离心15min，取上清液，过0.22μm滤膜，备用，分别取等量不同种的紫珠属植物样品溶液混合均匀后作为混合样品；
(4)LC-MS检测：
色谱条件：色谱柱：HSS T3超高效液相色谱柱，柱温：40℃，流动相A：0.1％甲酸乙腈；流动相B：0.1％甲酸水，梯度洗脱程序：(0～0.1)min，6％A；(0.1～1.7)min，6％→10％A；(1.7～7.2)min，10％→18％A；(7.2～8.1)min，18％→21％A；(8.1～10.1)min，21％→23％A；
(10.1～15.2)min，23％→28％A；(15.2～16.2)min，28％→34％A；(16.2～24.2)min，34％
→39％A；(24.2～35.2)min，39％→46％A；(35.2～37.5)min，46％→55％A；(37.5～40.5)Min，55％→80％A；(40.5～42.0)min，80％→98％A；(42.0～46.0)min，98％A，流速0.5mL/min；
高分辨质谱系统：仪器：沃特世Zevo-G2-S Q TOF，离子化模式：电喷雾正、负离子，毛细管电压：-2.5KV；+0.5KV，锥孔电压：40V，除溶剂气体：900L/h，离子源温度：100℃，除溶剂温度：450℃，采集范围：50至1500Da质荷比，碰撞气体：氩气，碰撞能量：低能量扫描：6EV，高能量扫描：正离子35-50eV，负离子45-70eV；
吸取步骤(2)、(3)所得对照品溶液、供试品溶液0.1～10uL，注入超高效液相色谱仪中，按拟定色谱、质谱条件进行LC-MS测定，记录色谱、质谱数据信息；
(5)指标成分筛选：
将步骤(4)中所得色谱、质谱数据信息导入代谢组学分析软件Progenesis QI软件中进行处理，将得到的所有代谢物的数据集导入到EZinfo软件中，进行PCA、PLS-DA、OPLS-DA的分析，将不同样品之间VIP最高的10-100个化合物作为潜在的指标成分，再结合S-PLOT图，找得到裸花紫珠中对裸花紫珠和其它紫珠之间差异贡献较大的成分5-100个，作为潜在的指标成分，综合分析，并最终筛选出指标成分；
(6)样品测定：
将待测样品，按步骤(2)～(4)测定其色谱、质谱数据信息，经步骤(5)中的代谢组学分析软件处理后，得到的所有代谢物的数据集和最终筛选出的指标成分信息导入同一分析软件中，进行PCA分析，通过样品聚类情况鉴别样品是否为裸花紫珠。
8.根据权利要求7所述的一种裸花紫珠鉴别方法，其特征在于所述步骤(2)对照品溶液的制备：分别称取对照品原儿茶酸，连翘脂苷E，山栀子苷甲酯，莫诺苷，原儿茶醛，刺五加苷B，咖啡酸，阿魏酸，胡黄连苷Ⅲ，连翘脂苷B，连翘脂苷A，木犀草苷，毛蕊花糖苷，金石蚕苷，异毛蕊花糖苷，异鼠李素-3-O-葡萄糖苷，槲皮素，木犀草素，芹菜素，异鼠李素各约5mg，加入到10mL容量瓶中，然后加入70％乙醇溶解定容，作为母液备用，将母液逐级2或2.5倍稀释，一直到1ng/μL备用，即分别为500、250、100、50、25、10、5、2、1ng/μL的对照品溶液。
9.根据权利要求7所述的一种裸花紫珠鉴别方法，其特征在于所述步骤(3)供试品溶液的制备：分别将不同种的紫珠属植物样品即裸花紫珠、大叶紫株、广东紫珠、白毛紫珠、杜虹花、短柄紫珠、尖尾枫、长叶紫珠、紫珠烘干并粉碎，准确称取各样品0.1g，20倍70％的乙醇超声提取30min，超声2次，12000r离心15min，取上清液，过0.22μm滤膜，备用，分别取不同紫珠的样品溶液各100μL混合均匀后作为混合样品。
10.根据权利要求7所述的一种裸花紫珠鉴别方法，其特征在于，所述步骤(5)中最终筛选出来的指标成分包含以下成分：毛蕊花糖苷，异毛蕊花糖苷，nudifloside，槲皮素-7-O-葡萄糖苷，6″-O-trans-caffeoylcatalpol，木犀草苷，木犀草素-4'-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，linearoside，(10α)-16α,17,19-trihydroxykaurane-18-oic acid。
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