CN109444290B - 车前草药材uplc特征图谱的构建方法和检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种车前草药材UPLC特征图谱构建方法和检测方法。该特征图谱构建方法步骤如下：分别以大车前苷和毛蕊花糖苷为对照品制备对照品参照物溶液；以车前草对照药材制备对照药材参照物溶液；分别取车前草药材和标准汤剂样品，加提取溶剂提取，过滤，所得滤液作为供试品溶液和标准汤剂供试品溶液；分别吸取所述参照物溶液、供试品溶液、标准汤剂供试品溶液注入超高效液相色谱仪，测定；比较车前草药材供试品图谱和标准汤剂样品供试品图谱，标定7个水溶性成分的特征峰，获得车前草药材的UPLC特征图谱。该特征图谱能用于定性、定量分析车前草药材的质量，能够确保采用该药材制备的车前草传统汤剂的质量，也适用于检测含车前草的其它制剂。

Description

车前草药材UPLC特征图谱的构建方法和检测方法

技术领域

本发明涉及医药技术领域，特别是涉及一种车前草药材UPLC特征图谱的构建方法和检测方法。

背景技术

车前草为车前科植物车前Plantago asiatica L.或平车前Plantago depressaWilld.的干燥全草。车前草最早见于《诗经·周南·芣苢》，《神农本草经》列为上品。《本草纲目》云：“幽州人谓之牛舌草，蛤蟆喜藏伏于下，故江东称为蛤蟆衣；气味甘、寒、无毒。主治气癃止痛，利水道小便，除湿痹。久服轻身耐老。男子伤中，女子淋沥不欲食，养肺强阴益精，令人有子，明目治赤痛。去风毒，肝中风热，毒风中眼，赤痛障翳，脑痛泪出，压丹石毒，去心胸烦热。养肝，治妇人难产，导小肠热，止暑湿泻痢。”现代研究其主要有效成分有黄酮类、苯乙醇苷类、环烯醚萜类、三萜及甾醇类等，而且具有一定的降血脂和血尿酸、抗癌抗衰老、止咳平喘、缓泻等作用。其具有较强的临床应用价值，市场需求广阔，被开发成中药配方颗粒及相关复方制剂广泛用于临床。

中药的临床使用多以传统汤剂为主。中药汤剂的物质基础，是中医理论指导下防治疾病的基础。现行的法定标准仅针对单一成分进行定量控制，量效关系不能全面反映中药成分的整体作用。在现阶段，中药绝大多数有效成分未明确的情况下，中药指纹图谱/特征图谱的建立能大大提高中药质量控制的技术水平及科技含量。

《中国药典》2015年版将大车前苷作为车前草质量评价指标，仅对大车前苷含量进行控制，并不能全面反映其质量，且目前文献研究报道的关于百部特征图谱的建立，均只针对药材原料，指标成分多以脂溶性成分为研究对象，主要用于中药材真伪、产地、品质差异的定性鉴别，较难全面反映车前草的质量特征，也不能反应传统中药汤剂的物质基础特征。

发明内容

基于此，本发明提供一种车前草药材UPLC特征图谱的构建方法和检测方法。构建的车前草药材的特征图谱具有7个水溶性成分的特征峰，可以快速、全面实现对车前草药材多个特征成分的质量监控，并能反应车前草的传统中药汤剂的物质基础特征。

具体技术方案为：

一种车前草药材UPLC特征图谱的构建方法，包括以下步骤：

参照物溶液的制备：分别以大车前苷和毛蕊花糖苷为对照品，加溶剂溶解，制备对照品参照物溶液；向车前草对照药材中加入提取溶剂，加热回流，得提取液，将所述提取液滤过，取续滤液作为对照药材参照物溶液；

供试品溶液的制备：向车前草药材中加入提取溶剂，加热回流，得提取液I，将所述提取液I滤过，取续滤液作为供试品溶液I；向车前草标准汤剂样品中加入提取溶剂，加热回流，得提取液II，将所述提取液II滤过，取续滤液作为供试品溶液II；

测定：将所述对照品参照物溶液、对照药材参照物溶液、供试品溶液I和供试品溶液II注入超高效液相色谱仪中测定，，标定水溶性共有峰，即得车前草药材UPLC特征图谱。

在其中一个实施例中，所述超高效液相色谱的色谱条件包括：

固定相：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；

流动相：以乙腈为流动相A，以体积分数为0.05％-0.2％的磷酸水溶液为流动相B，梯度洗脱；

所述梯度洗脱具体为：

0-5min，流动相A由体积分数为12％升高到13％，流动相B由体积分数为88％降低到87％；

5min-15min，流动相A由体积分数为13％升高到17％，流动相B由体积分数为87％降低到83％；

15min-20min，保持流动相A体积分数为17％，保持流动相B保持体积分数为83％；

20min-25min，流动相A保持由体积分数为17％升高到88％，流动相B由体积分数为83％降低到12％；

25min-26min，流动相A由体积分数为88％降低到12％，流动相B由体积分数为12％升高到88％；

26min-30min，流动相A保持体积分数为12％，流动相B保持体积分数为88％。

在其中一个实施例中，所述色谱柱为Agilent ZORBAX SBC18。

在其中一个实施例中，所述超高效液相色谱的色谱条件还包括：

柱温20℃-25℃，流速为每分钟0.25mL-0.28mL，检测波长为200nm-220nm。

在其中一个实施例中，所述超高效液相色谱的色谱条件为：Agilent ZORBAXSBC18色谱柱(2.1×100mm，1.8μm)；柱温：30℃；进样量：1μL；检测波长：330nm；以乙腈为流动相A，以0.05％磷酸水为流动相B，流速为每分钟0.3mL。

在其中一个实施例中，所述提取溶剂为体积分数为50％-80％的甲醇水溶液，用量为每1g车前草药材加入50mL-100mL。

在其中一个实施例中，所述加热回流的时间为60min-90min。

本发明还提供车前草药材的检测方法。

具体技术方案为：

一种车前草药材的检测方法，包括以下步骤：

参照物溶液的制备：分别以大车前苷和毛蕊花糖苷为对照品，加溶剂溶解，制备对照品参照物溶液；向车前草对照药材中加入提取溶剂，加热回流，得提取液，将所述提取液滤过，取续滤液作为对照药材参照物溶液；

待测样品溶液的制备：向待测样品中加入提取溶剂，加热回流，得提取液III，将所述提取液III滤过，取续滤液作为待测样品溶液；

测定：将所述对照品参照物溶液、对照药材参照物溶液、待测样品溶液置于超高效液相色谱仪中测定，即可。

在其中一个实施例中，供试品溶液的制备中，所述车前草药材包含有不同产地的车前草药材，本发明的供试品原料来自全国车前草产量较大的4个道地或主要产区，共15批次样品，具有充分的代表性。

在其中一个实施例中，所述超高效液相色谱的色谱条件包括：

固定相：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；

流动相：以乙腈为流动相A，以体积分数为0.05％-0.2％的磷酸水溶液为流动相B，梯度洗脱；

所述梯度洗脱具体为：

0-5min，流动相A由体积分数为12％升高到13％，流动相B由体积分数为88％降低到87％；

5min-15min，流动相A由体积分数为13％升高到17％，流动相B由体积分数为87％降低到83％；

15min-20min，保持流动相A体积分数为17％，保持流动相B保持体积分数为83％；

20min-25min，流动相A保持由体积分数为17％升高到88％，流动相B由体积分数为83％降低到12％；

25min-26min，流动相A由体积分数为88％降低到12％，流动相B由体积分数为12％升高到88％；

26min-30min，流动相A保持体积分数为12％，流动相B保持体积分数为88％。

在其中一个实施例中，所述色谱柱为Agilent ZORBAX SBC18。

在其中一个实施例中，所述超高效液相色谱的色谱条件还包括：柱温25℃-35℃，流速为每分钟0.25mL-0.35mL，检测波长为270nm-360nm。

在其中一个实施例中，所述超高效液相色谱的色谱条件为：Agilent ZORBAXSBC18色谱柱(2.1×100mm，1.8μm)；柱温：30℃；进样量：1μL；检测波长：330nm；以乙腈为流动相A，以0.05％磷酸水为流动相B，流速为每分钟0.3mL。

在其中一个实施例中，所述提取溶剂为体积分数为50％-80％的甲醇水溶液，用量为每1g车前草药材加入50mL-100mL。

在其中一个实施例中，所述加热回流的时间为60min-90min。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明采用超高效液相色谱(UPLC)法构建车前草药材的特征图谱。引入车前草标准汤剂的特征图谱进行研究，针对车前草标准汤剂与车前草药材共有的水溶性成分特征成分进行研究(采用UPLC-MS和相关对照品确认了7个共有特征峰的成分，分别为车前酯苷、车前酯苷异构体、大车前苷、10-乙酰大前车草苷、木犀草苷、车前草苷D和高车前素)，并作为车前草药材特征图谱特征峰确定的依据，能够很好的表征药材原料到汤剂的物质传递，不仅能够很好的把控药材质量，而且也能够确保汤剂的质量；同时，采用了对照品、对照药材双重对照，可以有效克服液相条件指纹图谱固有存在的耐用性偏差问题，比较更加全面。

本发明以含量测定峰(大车前苷)作为参照峰，规定其他6个特征峰的相对保留时间和相对峰面积限量范围，实现多个特征成分的定量化，符合中药的整体作用理念。

本发明采用了UPLC法，与常规HPLC法相比，更加高效、快速、环保；采用本发明构建的特征图谱及方法，重现性好，准确可靠，可以快速、全面实现对车前草药材多个特征成分的质量监控，既提升了车前草药材的质量控制水平，又提升和稳定车前草药材的内在质量，为临床提供符合车前草标准汤剂要求的原料，为车前草相关的制剂工艺生产过程提供重要的多指标参数依据。

附图说明

图1为15批车前草药材特征图谱的叠加图(峰1：车前酯苷；峰2：车前酯苷异构体；峰3：10-乙酰大前车草苷；峰4(S)：大车前苷；峰5：木犀草苷；峰6：车前草苷D；峰7：高车前素)；

图2为15批车前草标准汤剂特征图谱的叠加图；

图3为车前草标准汤剂特征图谱；

图4为车前草药材、车前草标准汤剂对照特征图谱；

图5为专属性考察特征图谱；

图6为车前草药材对照特征图谱；

图7为基原为平车前的车前草药材的特征图谱与基原为车前的车前草药材对照特征图谱的比较图；

图8为三批车前草药材与三批平车前草(车前)药材特征图谱比较图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明的车前草药材UPLC特征图谱的构建方法和检测方法作进一步详细的说明。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式。相反地，提供这些实施方式的目的是使对本发明公开内容理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

实施例1车前草药材UPLC特征图谱的构建

1、仪器与试剂

沃特世液相色谱仪(型号：H-Class；检测器：PDA；厂家：沃特世仪器公司)；AgilentZORBAX SB C18色谱柱(2.1×100mm，1.8μm色谱柱编号：037、035，038)；万分之一天平(ME204E，梅特勒-托利多仪器有限公司)，百万分之一天平(型号：XP26，厂家：梅特勒-托利多仪器有限公司)；电热恒温水浴锅(型号：HWS28型；厂家：上海一恒科技有限公司)；数控超声波清洗器(型号：KQ-500DE；厂家：昆山市超声仪器有限公司)；超纯水系统(型号：Milli-Q-Direc；厂家：默克股份有限公司)。

甲醇、乙醇为分析纯(天津富宇精细化工有限公司)，液相用甲醇、乙腈为色谱纯(默克股份有限公司)，磷酸为色谱纯(天津市科密欧化学试剂有限公司)，水为超纯水(取自实验室Milli-Q超纯水系统，默克股份有限公司)。

2、试药

大车前苷对照品(中国食品药品检定研究院，批号：111914-201604，含量：90.2％)；毛蕊花糖苷对照品(批号：L1230050～CDAA-280780，含量98.8％，ANPEL)。

药材来源：本研究共收集了共15批车前草原药材，如表1所示：其中来自四川3批，安徽2批，江苏6批，江西4批。详细来源：略。

表1

备注：大车前苷含量是按中国药典(2015版)车前草项下含量测定方法测定。

3、参照物溶液、对照药材参照物溶液和标准汤剂的制备

精密称定大车前苷对照品6.289mg，置于20mL量瓶中，加60％(体积分数)甲醇水溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，制得浓度为283.6339μg/mL的对照品母液，取上述母液1mL置10mL容量瓶中，加60％(体积分数)甲醇水定容制成每1mL含大车前苷28.36339μg的对照品参照物溶液。

精密称取毛蕊花糖苷对照品2.216mg，置25mL容量瓶中，加60％(体积分数)甲醇水溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，制得浓度为875.763μg/mL的对照品母液，取上述母液1mL置10mL容量瓶中，加60％(体积分数)甲醇水定容制成每1mL含毛蕊花糖苷87.5763μg的对照品参照物溶液。

取车前草对照药材粉末(过二号筛)1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入60％(体积分数)甲醇水溶液50mL，称定重量，加热回流1小时，取提取液，放冷，再称定重量，用60％(体积分数)甲醇水溶液补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得车前草对照药材参照物溶液。

车前草标准汤剂的制备：取车前草药材，拣选除杂，切成1～3cm的段，得车前草饮片。取车前草饮片100g，加水煎煮两次，第一次加水12倍量，浸泡30分钟，武火煮沸后，改文火保持微沸，继续煎煮20分钟，350目筛网滤过，滤液在冷水浴中迅速冷却，第二次加水10倍量，武火煮沸后，改文火保持微沸，继续煎煮15分钟，350目筛网滤过，滤液在冷水浴中迅速冷却；合并两次滤液，减压浓缩(温度：65℃，转速：70-90转/分钟，真空度：-0.08～-0.1MPa)至150ml的浸膏，分装至西林瓶中，每瓶分装2ml，真空冷冻干燥，取出，轧铝盖即得。

4、色谱条件的确定

(1)供试品溶液的制备：取车前草药材(G1706106)0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入60％(体积分数)甲醇水溶液25mL，称定重量，超声(功率200W，频率40kHz)提取30min，取提取液，放冷，再称定重量，用60％(体积分数)甲醇水溶液补足减失重量，摇匀，滤过，即得。

(2)流动相系统选择

a.通过前期的色谱条件的摸索及参考相关文献，比较乙腈和甲醇有机相系统、水和酸水系统对车前草药材特征图谱的效果，确定最佳的流动相系统。

色谱条件：以Agilent ZORBAX SB C18色谱柱(2.1×100mm，1.8μm)；柱温：30℃；进样量：1μL；检测波长：330nm；以乙腈/甲醇为流动相A，以0.1％(体积分数)磷酸水溶液/水为流动相B，按表2中规定的梯度进行洗脱，流速为0.3mL/min。

表2

比较乙腈-水，乙腈-酸水，甲醇-水，甲醇-酸水四种流动相系统对车前草药材的分离效果，发现乙腈-水和乙腈-酸水系统能将峰信息展现全面，峰型对称；比较乙腈-水和乙腈-酸水两种流动相系统，发现乙腈-酸水的峰信息较多(乙腈水系统7号峰缺失)，峰分离度更优，故选用乙腈-酸水系统作为流动相。

b.根据文献报道，分别对流动相中磷酸、甲酸、冰醋酸进行比较，并进行优选。

色谱条件：色谱柱：Agilent ZORBAX SB C18色谱柱(2.1×100mm，1.8μm)；柱温：30℃；进样量：1μL；检测波长：330nm；以乙腈为流动相A，分别以0.1％(体积分数)磷酸水溶液、0.1％(体积分数)甲酸水溶液、0.1％(体积分数)冰醋酸水溶液为流动相B，取(1)中供试品溶液，按表2中规定的梯度进行洗脱，流速为0.3mL/min。

比较3种不同流动相，发现三种酸的洗脱效果整体相差不大，各色谱峰的分离效果和峰型相当，考虑到采用乙腈-0.1％磷酸水为流动相，色谱柱耐受性好，且色谱图基线平稳，最终确定0.1％磷酸水作为流动相。

c.根据文献报道，分别对流动相中磷酸的酸度(0.05％磷酸水，0.1％磷酸水，0.2％磷酸水)进行比较，并进行优选。

色谱条件：色谱柱：Agilent ZORBAX SBC18色谱柱(2.1×100mm，1.8μm)；柱温：30℃；进样量：1μL；检测波长：330nm；以乙腈为流动相A，分别以0.05％磷酸水，0.1％磷酸水，0.2％磷酸水为流动相B，取(1)中供试品溶液，按表2中规定的梯度进行洗脱，流速为0.3mL/min。

比较3种不同缓冲盐浓度，发现三种浓度酸的洗脱效果整体相差不大，各色谱峰的分离效果和峰型相当，考虑到0.05％磷酸水更保护色谱柱，色谱柱耐受性好，且色谱图基线平稳，最终确定0.05％磷酸水作为流动相缓冲盐。

(3)最佳吸收波长的确定

通过查阅文献可知，车前草药材特征图谱苯乙醇苷类、黄酮类等主要成分最大吸收波长通常在300nm附近，文献中还有选择270nm、360nm作为检测波长，本研究选择270nm，330nm，360nm，以及采用程序波长进行采集，对采集的色谱图进行比较，确定最佳波长。

色谱条件：色谱柱：Agilent ZORBAX SBC18色谱柱(2.1×100mm，1.8μm)；柱温：30℃；进样量：1μL；检测波长：190-400nm；以乙腈为流动相A，以0.05％磷酸水为流动相B，取(1)中供试品溶液，按表2中规定的梯度进样进行洗脱，流速为0.3mL/min。

结果显示，330nm下的色谱峰峰型好，主要峰的吸收强度大、峰高比例协调，因此波长选择330nm。

(4)不同色谱柱考察

分别对YMC Triart C18(2.1×100mm，1.9μm)、Waters BEH C18(2.1×100mm，1.8μm)、Waters HSS T3(2.1×100mm，1.8μm)、Waters CORTECES T3(2.1×100mm，1.8μm)、Agilent ZORBAX SBC18(2.1×100mm，1.8μm)色谱柱进行考察，选取最优色谱柱。

色谱条件：分别以上述5种色谱柱(2.1×100mm，1.8μm)为分析色谱柱；柱温：30℃；进样量：1μL；检测波长为330nm；以乙腈为流动相A，以0.05％磷酸水为流动相B，取(1)中供试品溶液，按表2中规定的梯度进样进行洗脱，流速为0.3mL/min。

通过比较不同色谱柱对车前草药材的分离效果，结果发现上述色谱条件下，Agilent ZORBAX SBC18色谱柱分离度最优，峰数目、峰型均较好，Waters CORTECES T3效果次之，故选用Agilent ZORBAX SBC18作为车前草药材特征图谱的色谱柱。

(5)柱温考察

分别对25℃、30℃、35℃柱温进行考察，选取最优柱温。

色谱条件：以Agilent SB C18(2.1×100mm，1.8μm分析色谱柱；柱温分别设为25℃、30℃、35℃；进样量：1μL；检测波长为330nm；以乙腈为流动相A，以0.05％磷酸水为流动相B，取(1)中供试品溶液，按表2中规定的梯度进样进行洗脱，流速为0.3mL/min。

通过比较不同柱温对车前草药材特征图谱的分离效果，结果发现在25℃、30℃、35℃柱温下各色谱峰均分离良好，峰数目、峰型均较好，考虑一年四季的温度变化及方法的耐用性，选择常用的易达到的30℃作为柱温。

(6)流速考察

分别对流速为0.25mL/min、0.30mL/min、0.35mL/min进行考察，选取最优流速。

色谱条件：以Agilent SB C18(2.1×100mm，1.8μm分析色谱柱；柱温为30℃；进样量：1μL；检测波长为330nm；以乙腈为流动相A，以0.05％磷酸水为流动相B，取(1)中供试品溶液，按表2中规定的梯度进样进行洗脱，流速分别设为0.25mL/min、0.30mL/min、0.35mL/min。

通过比较不同流速对车前草药材特征图谱的分离效果，结果发现，在0.25mL/min、0.30mL/min、0.35mL/min柱温下各色谱峰均分离良好，数目、峰型均较好，0.30mL/min分离度最优，选择0.30mL/min作为流速。

(7)色谱条件的确定

根据上述实验结果，可确定车前草药材优化后的色谱条件为：

Agilent ZORBAX SBC18色谱柱(2.1×100mm，1.8μm)；柱温：30℃；进样量：1μL；检测波长：330nm；以乙腈为流动相A，以0.05％磷酸水为流动相B，按表2中规定的梯度进行洗脱，流速为每分钟0.3mL。

5、供试品溶液的制备

通过单因素分析，分别考察提取溶媒、提取方式、溶剂用量及提取时间对车前草特征图谱的影响，以确定最佳样品前处理方法。

(1)提取溶剂考察

本次实验分别考察了不同提取溶剂对车前草药材特征图谱的影响，选取甲醇、30％(体积浓度)甲醇水、60％(体积浓度)甲醇水、60％(体积浓度)乙醇水、乙醇作为提取溶剂，对不同提取溶剂的供试品溶液进行测定，确定最佳提取溶剂。

取车前草药材粉末(过二号筛)(G1706106)1.0g，平行5份，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇、30％甲醇水、60％甲醇水、60％乙醇水、乙醇50mL，称定重量，超声(功率200W，频率40kHz)30min，取提取液，放冷，再称定重量，用相应的溶剂补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得不同溶剂提取的供试品溶液。

采用4(7)中的色谱条件，分别对上述不同溶剂提取的供试品溶液进行测定，得特征图谱，计算各特征峰的峰面积和峰面积/称样量，如表3所示。

表3

对比甲醇、30％甲醇水、60％甲醇水、60％乙醇水和乙醇5种提取溶剂对车前草药材的提取效果的强弱，发现60％甲醇水的效果最好，乙醇提取的效果最差(4号色谱峰未达到分离、峰响应较低)，故选用60％(体积分数)甲醇水溶液作为提取溶剂。

(2)提取方式考察

本次实验考察不同提取方式对车前草药材特征图谱的影响，选取回流提取与超声提取两种方式。对不同提取方式的供试品溶液进行测定，确定最佳提取方式。

取车前草药材粉末(过二号筛)(G1706106)1.0g，平行2份，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入60％(体积分数)甲醇水50mL，称定重量，分别加热回流、超声处理(功率200W，频率40kHz)30min，取提取液，放冷，再称定重量，用60％(体积分数)甲醇水补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得不同提取方式得到的供试品溶液。

采用4(7)中的色谱条件，分别对上述不同提取方式得到的供试品溶液进行测定，得特征图谱，计算各特征峰的峰面积和峰面积/称样量，如表4所示。

表4

对比了两种提取方式，不同提取方式的色谱图色谱峰数目与色谱峰峰形一致，峰面积加和/称样量大小的顺序为：回流>超声，故选择回流作为提取处理方式。

(3)溶剂用量考察

本次实验考察不同溶剂用量对车前草药材特征图谱的影响，选取15mL、25mL、50mL、100mL。

取车前草药材粉末(过二号筛)(G1706106)1.0g，平行4份，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入60％(体积分数)甲醇水15mL、25mL、50mL、100mL，称定重量，分别加热回流60min，取提取液，放冷，再称定重量，用60％(体积分数)甲醇水补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得不同溶剂用量提取得到的供试品溶液。

采用4(7)中的色谱条件，分别对上述不同溶剂用量提取得到的供试品溶液进行测定，得特征图谱，计算各特征峰的峰面积和峰面积/称样量，如表5所示。

表5

对比了不同溶剂用量对车前草药材特征图谱的影响，其总峰面积大小的顺序为100mL>50mL>25mL>15mL，其中，50mL与100mL的差异不明显，说明50mL时，车前草的成分已经基本提取完全，结合节省溶剂考虑，溶剂用量选用50mL。

(4)提取时间考察

本次实验考察不同提取时间对车前草药材特征图谱的影响，选取回流提取时间分别为：15min、30min、60min、90min。对不同提取时间的供试品溶液进行测定，确定最佳提取时间。

取车前草药材粉末(过二号筛)(G1706106)1.0g，平行4份，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入60％(体积分数)甲醇水50mL，称定重量，分别加热回流15min、30min、60min、90min，取提取液，放冷，再称定重量，用60％(体积分数)甲醇水补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得不同提取时间提取得到的供试品溶液。

采用4(7)中的色谱条件，分别对上述不同时间提取得到的供试品溶液进行测定，得特征图谱，计算各特征峰的峰面积和峰面积/称样量，如表6所示。

表6

通过对比不同回流时间提取的车前草药材特征图谱，可发现随着提取时间的增加，色谱图峰面积加和/称样量的值增大，回流60min与90min峰面积差异不明显，说明加热回流60min已经把车前草的主要成分基本提取完全，为方便实验选取回流时间为60min。

(5)供试品溶液的制备方法确定

通过对不同提取溶剂、不同提取方式、不同提取溶剂用量及提取时间进行考察，确定供试品溶液的制备方法为：取车前草药材粉末(过二号筛)1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入60％(体积分数)甲醇水溶液50mL，称定重量，加热回流1小时，取提取液，放冷，再称定重量，用60％(体积分数)甲醇水溶液补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

6、车前草药材、标准汤剂特征图谱共有峰的确定

取15批车前草药材，按照5(5)中供试品溶液的制备方法，制得15批供试品溶液I，将上述15批供试品溶液I注入液相色谱仪中，采用4(7)中的色谱条件，进样测定，得到15批车前草药材特征图谱。参见图1。

另取15批车前草标准汤剂样品，按照5(5)中供试品溶液的制备方法，制得15批供试品溶液II，将上述15批供试品溶液II注入液相色谱仪中，采用4(7)中的色谱条件，进样测定，得到15批车前草标准汤剂样品特征图谱。参见图2。

实验结果表明，15批车前草药材特征图谱具有7份特征峰，且所述7个特征峰均能从车前草药材稳定转移到车前草标准汤剂中。即车前草药材特征图谱与标准汤剂特征图谱中的7个特征峰相对应，因此，选择此7个特征峰为车前草药材的共有峰，并以峰4(大车前苷)为参照峰进行标准研究，详情参见图3、图4。

7、方法学验证

(1)专属性考察

按5(5)中供试品溶液的制备方法制备车前草药材(G1706106)的供试品溶液，精密吸取车前草药材的供试品溶液，大车前苷对照品溶液和空白溶剂各1μL，注入液相色谱仪，按4(7)中的色谱条件测定，特征图谱如图5所示。

实验结果表明该分析方法能正确检测所指认的特征峰，不受提取溶剂的干扰。

(2)精密度考察

按5(5)中供试品溶液的制备方法制备车前草药材(G1706106)的供试品溶液，精密吸取车前草药材的供试品溶液，按4(7)中的色谱条件重复进样6次，得特征图谱。以大车前苷峰为参照峰，计算相对保留时间及相对峰面积，结果见表7和表8。

表7药材特征图谱精密度考察结果(相对保留时间)

表8药材特征图谱精密度考察结果(相对峰面积)

实验结果显示，各色谱峰相对峰面积与相对保留时间RSD在0.091％～4.55％范围内，表明仪器精密度良好。

(3)稳定性考察

按5(5)中供试品溶液的制备方法制备车前草药材(G1706106)的供试品溶液，精密吸取车前草药材的供试品溶液，按4(7)中的色谱条件，分别在0，2，4，8，10，12，24小时进样，得特征图谱。以大车前苷峰为参照峰，计算相对保留时间及相对峰面积，结果见表9和表10。

表9药材特征图谱精密度考察结果(相对保留时间)

表10药材特征图谱精密度考察结果(相对峰面积)

实验结果显示，在24小时供试品溶液各色谱峰相对峰面积与相对保留时间RSD在0.08％～1.66％范围内，表明供试品溶液在24小时内稳定。

(4)重复性考察

取同一批取车前草粉末(G1706106)0.5g，精密称定，平行6份，按5(5)中供试品溶液的制备方法制备6份车前草药材(G1706106)的供试品溶液，按4(7)中的色谱条件，分别进样1μL，得特征图谱。以大车前苷峰为参照峰，计算相对保留时间及相对峰面积，结果见表11和表12。

表11车前草药材特征图谱重复性考察结果(相对保留时间)

表12车前草药材特征图谱重复性考察结果(相对峰面积)

实验结果显示，重复测定6份样品，各色谱峰相对保留时间RSD在0.09％～0.62％范围内，相对峰面积RSD在0.75％～4.25％范围内，表明该特征图谱分析方法重复性良好。

(5)中间精密度考察

考察方法：改变日期，改变仪器，改变人。取同一批取车前草粉末(G1706106)0.5g，精密称定，平行6份，按5(5)中供试品溶液的制备方法制备6份车前草药材(G1706106)的供试品溶液，按4(7)中的色谱条件，分别进样1μL，得特征图谱。以大车前苷峰为参照峰，计算相对保留时间及相对峰面积，结果见表13和表14。

表13车前草药材特征图谱中间精密度考察结果(相对保留时间)

表14车前草药材特征图谱中间精密度考察结果(相对峰面积)

实验结果显示，不同分析人员在不同日期和不同色谱仪下操作，相对保留时间RSD在0.27％～1.22％范围内，色谱峰相对峰面积RSD在1.24％～3.74％范围内，表明各色谱峰相对保留时间中间精密度较好。

(6)耐用性考察

①不同柱温考察

比较不同柱温，分别是：28℃、30℃、32℃对车前草药材特征图谱耐用性影响。

按5(5)中供试品溶液的制备方法制备车前草药材(G1706106)的供试品溶液，精密吸取车前草药材的供试品溶液，按4(7)中的色谱条件，分别设定柱温为28℃、30℃、32℃，进样测定，得特征图谱，以大车前苷峰为参照峰，计算相对保留时间及相对峰面积，结果见表15和表16。

表15车前草药材特征图谱耐用性柱温考察结果(相对保留时间)

表16车前草药材特征图谱耐用性柱温考察结果(相对峰面积)

实验结果显示，不同柱温时，各色谱峰相对保留时间RSD在0.18％～1.56％范围内，相对峰面积RSD在0.52％～2.34％范围内，说明该方法在柱温变动小时耐用性良好。

②不同流速考察

比较不同流速，分别是0.28mL/min、0.30mL/min、0.32mL/min对车前草药材特征图谱耐用性影响。

按5(5)中供试品溶液的制备方法制备车前草药材(G1706106)的供试品溶液，精密吸取车前草药材的供试品溶液，按4(7)中的色谱条件，分别设定流速为0.28mL/min、0.30mL/min、0.32mL/min，进样测定，得特征图谱，以大车前苷峰为参照峰，计算相对保留时间及相对峰面积，结果见表17和表18。

表17药材特征图谱耐用性流速考察结果(相对保留时间)

表18药材特征图谱耐用性流速考察结果(相对峰面积)

实验结果显示，不同流速时，各色谱峰相对保留时间RSD在0.26％～2.00％范围内，相对峰面积RSD在0.12％～2.18％范围内，表明该分析方法不同流速耐用性较好。

③不同色谱柱考察

比较安捷伦同型号色谱柱的不同批次色谱柱(Agilent SB C18 2.1×100nm，1.8μm，编号：035，037，038)对车前草药材特征图谱耐用性影响。

按5(5)中供试品溶液的制备方法制备车前草药材(G1706106)的供试品溶液，精密吸取车前草药材的供试品溶液，按4(7)中的色谱条件，分别采用编号为035，037，038的色谱柱，进样测定，得特征图谱，以大车前苷峰为参照峰，计算相对保留时间及相对峰面积，结果见表19和表20。

表19车前草药材特征图谱耐用性色谱柱考察结果(相对保留时间)

表20车前草药材特征图谱耐用性色谱柱考察结果(相对峰面积)

实验结果显示，不同色谱柱时，各色谱峰相对保留时间RSD在0.28％～2.00％范围内，相对峰面积RSD在2.26％～9.54％范围内，表明该分析方法不同色谱柱耐用性较好。

8、车前草药材特征图谱的确定

(1)对15批车前草药材特征图谱进行分析，以大车前苷峰为参照峰，计算各峰相对保留时间及相对峰面积，实验结果见图1、表21和表22。

表21 15批车前草药材特征图谱(相对保留时间)

表22 15批车前草药材特征图谱(相对峰面积)

结果显示，15批车前草药材特征图谱具有7个共有峰，与车前草标准汤剂特征图谱共有峰一致。

以峰4大车前苷峰为参照峰，15批车前草药材特征图谱的其余6个特征峰相对保留时间RSD值在0.16％～1.26％，均小于3.0％，符合车前草药材特征图谱的标准要求；15批车前草药材特征图谱的6个特征峰相对峰面积的RSD在46.77％～73.65％，结果表明不同产地车前草药材的各特征峰峰面积存在一定差异，峰1相对峰面积范围为0.0198～0.1291，峰2相对峰面积范围为0.0211～0.1302，峰3相对峰面积范围为0.0116～0.1429，峰5相对峰面积范围为0.0086～0.6867，峰6相对峰面积范围为0.0481～0.2285，峰7相对峰面积范围为0.0075～0.1731。

为严格控制车前草药材的质量，为车前草标准汤剂和相关制剂的制备提供质优且稳定的原料药材，对车前草药材特征图谱的特征峰相对峰面积设定限量标准，是非常必要的。考虑15批次不同产地样品的代表性，取各特征峰相对峰面积修正后的最低、最高值，规定6个特征峰的相对峰面积范围，即：以大车前苷参照物峰相应的峰4为S峰，各特征峰与S峰的相对峰面积，规定各峰相对峰面积范围为：0.0198～0.1291(峰1)、0.0211～0.1302(峰2)、0.0116～0.1429(峰3)，0.0086～0.6867(峰5)、0.0481～0.2285(峰6)、0.0075～0.1731(峰7)。

(2)特征图谱标准的拟定

将15批车前草药材特征图谱使用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》匹配，生成对照图谱，建立车前草药材对照特征图谱，如图6所示。

暂定车前草药材特征图谱标准为：供试品色谱中应呈现7个特征峰，与大车前苷参照物峰相应的峰4为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应该在规定值的±10％之内，规定值为：0.39(峰1)、0.41(峰2)、0.70(峰3)、1.08(峰5)、1.32(峰6)、1.79(峰7)；计算各特征峰与S峰的相对峰面积，其相对峰面积应在规定范围内，规定范围为：0.0198～0.1421(峰1)、0.0211～0.1302(峰2)、0.0116～0.1429(峰3)，0.0086～0.6867(峰5)、0.0481～0.2285(峰6)、0.0075～0.1731(峰7)。

9、特征峰的指认

利用LC-MS技术对车前草特征图谱上的特征峰进行化学指认，确定其化学成分。

(1)仪器与试药

乙腈(色谱纯,德国Merck公司)；水为自制超纯水；甲酸等其它试剂均为分析纯。

车前草样品由广东一方药业提供，详情如表23。

表23样品信息表

(2)实验条件

(2.1)色谱条件：同上述4(7)。

(2.2)质谱条件：氮气作为质谱离子源的雾化和干燥气；电喷雾电离正、负离子模式；喷雾电压：3.0KV；Lens电压：65V；脱溶剂气温度：400℃；鞘气压力：50Arb；辅助气压力：15Arb；质荷比范围：100-1000；数据采集模式：centroid。

(2.3)对照品参照物溶液、对照药材参照物溶液的制备：同3

(2.4)供试品溶液的制备：同上述5(5)。

(2.5)测定法

分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各2μL，注入液相色谱质谱仪。测定，即得。

(3)色谱峰的指认

(3.1)相关色谱峰的明确指认

采用上述色谱和质谱分析条件，分别对供试品溶液、对照药材参照物溶液、对照品溶液进行检测。通过化合物的色谱峰保留行为、精确分子量及与对照品进行比对，共确定了9个化合物。其中，大车前苷与对照品的色谱保留行为及质谱精确分子量信息进行了比对验证。根据对照品溶液与供试品溶液的色谱保留行为，一级和二级质谱图完全一致，车前草样品的UPLC特征图谱中大车前苷色谱峰得到了明确的化学指认。

(3.2)其它相关色谱峰的推测

对比车前草样品供试品溶液和对照药材参照物溶液的质谱信息，推测各色谱峰成分如表24所示。

表24

(4)小结

目前，根据对照品溶液与供试品溶液的色谱保留行为，车前草样品的UPLC特征图谱中大车前苷色谱峰得到了明确的化学指认。

此外，根据需指认的色谱峰的质谱信息，并结合文献调研，推测峰1、2、3、5、6和7(保留时间如表24所示)可能为表24中所列化合物；另外，还推测了峰3前的两个较大的色谱峰，可能为车前酯苷异构体。

实施例2车前草药材的检测方法

本实施例提供一种车前草药材的鉴别应用。

2015年版中国药典规定车前草的基原为车前Plantago asiatica L.或平车前Plantagodepressa Willd.的干燥全草。我国车前草主要有三种基源：

车前Plantago asiatica L.：多年生草本，须根系，叶长4-12cm，宽3-9cm。种子长2mm，宽1mm。商品称“大粒车前子”。野生家种均有，野生为主。

平车前Plantago depressa Willd.：一年生草本，直根系，叶长4-10cm，宽2-4cm。种子长1-1.5mm，宽不足1mm。商品称“小粒车前子”。野生。

大车前Plantag major L.:形态与车前相似，叶边缘波状或有不整齐锯齿，两面有短或长柔毛。种子较小，商品称“小粒车前子”。非药典品，分布于新疆、陕西、浙江、福建、台湾、江西、湖南、广东、广西、湖北、四川、云南、贵州等地。野生。

一种车前草药材的鉴别应用，步骤如下：

(1)色谱条件同上述4(7)。

(2)待测样品溶液的制备

待测样品为平车前药材，取上述平车前药材粉末1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入60％(体积分数)甲醇水溶液50mL，称定重量，加热回流1小时，取提取液，放冷，再称定重量，用60％(体积分数)甲醇水溶液补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得平车前草样品溶液。

(3)测定

精密吸取上述待测样品溶液，注入液相色谱仪中，测定，得到特征图谱，与图6对比，如图7所示。

结果显示，基原为平车前的车前草(平车前)药材与基原为车前的车前草样品的特征图谱差异巨大，主要体现在基原为平车前的车前草不具有峰1，峰2，峰3，峰6，峰7。

目前对不同基原的车前草药材鉴别研究文献较少，本实施例通过研究车前、平车前两个基原的车前草药材特征图谱，发现车前与平车的特征图谱存在明显区别，所建立的车前草药材特征图谱能够区分不同基原的药材。为车前草基原研究提供了基础，增强了车前草相关制剂所用原料的整体质量把控。

实施例3不同基原的车前草药材的鉴别方法

本实施例提供一种不同基原的车前草药材的鉴别方法，步骤如下：

(1)色谱条件同上述4(7)。

(2)待测样品溶液的制备

待测样品为3批(G1707139-1707141)的平车前药材，分别取上述待测样品药材粉末1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入60％(体积分数)甲醇水溶液50mL，称定重量，加热回流1小时，取提取液，放冷，再称定重量，用60％(体积分数)甲醇水溶液补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得3批待测样品溶液。

(3)测定

精密吸取上述待测样品溶液，注入液相色谱仪中，测定，得到特征图谱，与实施例1中3批的车前草药材的特征图谱对比如图8所示。其中，峰面积和保留时间如表25所示。

表25

比较3批待测样品和实施例1中的3批车前草药材特征图谱的大车前苷与毛蕊花糖苷峰面积比值，发现差异显著，其中基原为平车前的车前草(车前)的3批待测药材，其毛蕊花糖苷与大车前苷峰面积比值远高于0.85，基原为车前的车前草(车前)药材其毛蕊花糖苷与大车前苷峰面积比值远低于0.85，通过比较特征峰及毛蕊花糖苷与大车前苷的比值可以有效区分不同基原的车前草样品。

因此，最终确定车前草(车前)药材特征图谱标准为：供试品色谱中应呈现7个特征峰，与大车前苷参照物峰相应的峰4为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应该在规定值的±10％之内，规定值为：0.39(峰1)、0.41(峰2)、0.70(峰3)、1.08(峰5)、1.32(峰6)、1.79(峰7)计算各特征峰与S峰的相对峰面积，其相对峰面积应在规定范围内，规定范围为：0.020～0.338(峰1)，0.021～0.360(峰2)，0.012～0.194(峰3)，0.009～1.122(峰5)，0.048～0.228(峰6)，0.0075～0.476(峰7)。

与另一基原平车前的鉴别标准如下：待测样品色谱中，与毛蕊花糖苷对照品的特征峰的相对保留时间在1.25±10％的范围之内，不得检出色谱峰；如果检出，该色谱峰与峰4的峰面积比值不得高于0.85。

实施例4车前草药材的检测方法

本实施例提供一种车前草药材的检测方法，步骤如下：

(1)色谱条件同实施例1中的4(1)。

(2)参照物溶液的制备同实施例1中的3。

(3)待测样品溶液的制备

取待测样品(批号：CQC01)药材粉末约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入60％(体积分数)甲醇水溶液50mL，称定重量，加热回流1小时，取提取液，放冷，再称定重量，用60％(体积分数)甲醇水溶液补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

(4)测定法

分别精密吸取上述参照物溶液与待测样品溶液各1μl，注入液相色谱仪，测定，得到特征图谱，计算待测样品特征图谱相对保留时间和相对峰面积。

表26供试品特征图谱相对保留时间和相对峰面积

数据结果显示，该样品具有相同的7个特征峰，且其相对峰面积和相对保留时间均在标准规定的范围内，由此说明，该批次车前草药材质量合格，且质量较稳定，满足临床汤剂的使用要求。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种车前草药材UPLC特征图谱的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

参照物溶液的制备：分别以大车前苷和毛蕊花糖苷为对照品，加溶剂溶解，制备对照品参照物溶液；向车前草对照药材中加入提取溶剂，加热回流，得提取液，将所述提取液滤过，取续滤液作为对照药材参照物溶液；

供试品溶液的制备：向车前草药材中加入提取溶剂，加热回流，得提取液I，将所述提取液I滤过，取续滤液作为供试品溶液I；向车前草标准汤剂样品中加入提取溶剂，加热回流，得提取液II，将所述提取液II滤过，取续滤液作为供试品溶液II；

测定：将所述对照品参照物溶液、对照药材参照物溶液、供试品溶液I和供试品溶液II注入超高效液相色谱仪中测定，标定水溶性共有峰，即得车前草药材UPLC特征图谱；

所述超高效液相色谱的色谱条件包括：

固定相：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；

流动相：以乙腈为流动相A，以体积分数为0.05%-0.2%的磷酸水溶液为流动相B，梯度洗脱；

所述梯度洗脱具体为：

0-5min，流动相A由体积分数为12%升高到13%，流动相B由体积分数为88%降低到87%；

5min-15min，流动相A由体积分数为13%升高到17%，流动相B由体积分数为87%降低到83%；

15min-20min，保持流动相A体积分数为17%，保持流动相B保持体积分数为83%；

20min-25min，流动相A保持由体积分数为17%升高到88%，流动相B由体积分数为83%降低到12%；

25min-26min，流动相A由体积分数为88%降低到12%，流动相B由体积分数为12%升高到88%；

26min-30min，流动相A保持体积分数为12%，流动相B保持体积分数为88%；

所述提取溶剂为体积分数为50%-80%的甲醇水溶液。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述超高效液相色谱的色谱条件还包括：

柱温25℃-35℃，流速为每分钟0.25mL-0.35mL，检测波长为270nm-360nm。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述超高效液相色谱的色谱条件还包括：

柱温30℃，流速为每分钟0.3mL，检测波长为330nm。

4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述提取溶剂的用量为每1g车前草药材加入50mL-100mL。

5.根据权利要求1-4任一项所述的构建方法，其特征在于，所述加热回流的时间为60min-90min。

6.一种车前草药材的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

参照物溶液的制备：分别以大车前苷和毛蕊花糖苷为对照品，加溶剂溶解，制备对照品参照物溶液；向车前草对照药材中加入提取溶剂，加热回流，得提取液，将所述提取液滤过，取续滤液作为对照药材参照物溶液；

待测样品溶液的制备：向待测样品中加入提取溶剂，加热回流，得提取液III，将所述提取液III滤过，取续滤液作为待测样品溶液；

测定：将所述对照品参照物溶液、对照药材参照物溶液、待测样品溶液置于超高效液相色谱仪中测定，即可；

所述超高效液相色谱的色谱条件包括：

固定相：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；

流动相：以乙腈为流动相A，以体积分数为0.05%-0.2%的磷酸水溶液为流动相B，梯度洗脱；

所述梯度洗脱具体为：

0-5min，流动相A由体积分数为12%升高到13%，流动相B由体积分数为88%降低到87%；

5min-15min，流动相A由体积分数为13%升高到17%，流动相B由体积分数为87%降低到83%；

15min-20min，保持流动相A体积分数为17%，保持流动相B保持体积分数为83%；

20min-25min，流动相A保持由体积分数为17%升高到88%，流动相B由体积分数为83%降低到12%；

25min-26min，流动相A由体积分数为88%降低到12%，流动相B由体积分数为12%升高到88%；

26min-30min，流动相A保持体积分数为12%，流动相B保持体积分数为88%；

所述提取溶剂为体积分数为50%-80%的甲醇水溶液。

7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述超高效液相色谱的色谱条件还包括：

柱温25℃-35℃，流速为每分钟0.25mL-0.35mL，检测波长为270nm-360nm。

8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述超高效液相色谱的色谱条件还包括：

柱温30℃，流速为每分钟0.3mL，检测波长为330nm。

9.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述提取溶剂的用量为每1g车前草药材加入50mL-100mL。

10.根据权利要求6-9任一项所述的检测方法，其特征在于，所述加热回流的时间为60min-90min。

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