CN109374788A - 蛇床子药材的uplc特征图谱构建方法和检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种蛇床子药材的UPLC特征图谱构建方法和检测方法。该特征图谱构建方法包括如下步骤：以欧前胡素对照品、蛇床子素对照品、花椒毒素对照品、佛手柑内酯作为对照品制备对照品溶液；分别取蛇床子药材和标准汤剂样品，加提取溶剂提取，过滤，所得滤液作为供试品溶液和标准汤剂供试品溶液；分别吸取所述对照品溶液、供试品溶液、标准汤剂供试品溶液，注入超高效液相色谱仪，测定；比较所得供试品图谱与标准汤剂供试品图谱，标定水溶性共有峰，获得蛇床子药材的UPLC特征图谱。该特征图谱能用于定性、定量分析蛇床子药材的质量，能够确保采用该药材制备的蛇床子传统汤剂的质量，也适用于检测含蛇床子的其它制剂。

Description

蛇床子药材的UPLC特征图谱构建方法和检测方法

技术领域

本发明涉及中药材质量研究，特别是涉及一种蛇床子药材的UPLC特征图谱构建方法和检测方法。

背景技术

蛇床子，是伞形科植物蛇床(Gnidium monnieri(L.)Cuss.)的果实。《神农本草经》将其列为上品，以蛇床果实入药。蛇床子为杀虫止痒药，辛、苦，温；有小毒。归肾经。功效能燥湿祛风，杀虫止痒，温肾壮阳。用于阴痒带下，湿疹瘙痒，湿痹腰痛，肾虚阳痿，宫冷不孕。现代药理学研究则认为，蛇床子在抗心律失常、对学习记忆、拮抗激素引起的骨质疏松、抗诱变，抗肿瘤、抗菌、抗炎；抗病毒、抗肝损伤、抗氧化、抗衰老、抗过敏、止痒等方面均具有显著疗效。蛇床子中含有多种的化学成分，包括香豆素类成分、挥发油类成分等。其具有较强的临床应用价值，市场需求广阔，被开发成中药配方颗粒及相关复方制剂广泛用于临床。

中药的临床使用多以传统汤剂为主。中药汤剂的物质基础，是中医理论指导下防治疾病的基础。现行的法定标准仅针对单一成分进行定量控制，量效关系不能全面反映中药成分的整体作用。在现阶段，中药绝大多数有效成分未明确的情况下，中药指纹图谱/特征图谱的建立能大大提高中药质量控制的技术水平及科技含量。

《中国药典》2015年版将蛇床子素作为蛇床子质量评价指标，仅对蛇床子素含量进行控制，并不能全面反映其质量。目前文献研究报道的关于蛇床子指纹图谱多采用的是常规的HPLC法，且均只针对原药材的物质基础，指标成分多以脂溶性成分为研究对象；主要用于中药材真伪、产地、品质差异的定性鉴别，不能全部反映中药汤剂的物质基础特征。

发明内容

基于此，有必要提供一种蛇床子药材的UPLC特征图谱构建方法。通过该方法建立的指纹图谱具有6个特征峰，其中包括花椒毒素、佛手柑内酯、欧前胡素和蛇床子素，能够更全面地反映蛇床子药材的特征，同时可以准确反映由该蛇床子药材制成的汤剂的质量，且方法准确可靠、重复性好、操作简便。

一种蛇床子药材的UPLC特征图谱构建方法，包括如下步骤：

参照物溶液的制备：分别取欧前胡素对照品、蛇床子素对照品、花椒毒素对照品、佛手柑内酯对照品，加溶剂溶解，所得溶液作为参照物溶液；

参照药材溶液的制备：取蛇床子对照药材，加溶剂提取，制得参照药材溶液；

供试品溶液的制备：取蛇床子药材，加提取溶剂提取，过滤，所得滤液作为供试品溶液；

标准汤剂供试品溶液的制备：取蛇床子标准汤剂样品，加提取溶剂提取，过滤，所得滤液作为标准汤剂供试品溶液；

超高效液相色谱检测：分别吸取所述参照物溶液、参照药材溶液、供试品溶液、标准汤剂供试品溶液，注入超高效液相色谱仪，测定；比较所得供试品图谱与标准汤剂供试品图谱，标定水溶性共有峰，获得蛇床子药材的UPLC特征图谱。

在其中一些实施例中，供试品溶液的制备中，所述蛇床子药材包含有不同产地的蛇床子药材。本发明的供试品原料来自全国蛇床子产量较大的4个道地或主要产区共23批次样品，样品具有充分的代表性。

在其中一些实施例中，所述超高效液相色谱检测采用的条件包括：

固定相：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；

流动相：以甲醇为流动相A，以水为流动相B；采用梯度洗脱；

所述梯度洗脱的方法包括：

0-15min，流动相A的体积百分数由3％上升至40％，流动相B的体积百分数由97％降低至60％；

15-20min，流动相A的体积百分数由40％上升至45％，流动相B的体积百分数由60％降低至55％；

20-25min，流动相A的体积百分数由45％上升至60％，流动相B的体积百分数由55％降低至40％；

25-30min，流动相A的体积百分数由60％上升至80％，流动相B的体积百分数由40％降低至20％；

30-34min，保持流动相A的体积百分数为80％，流动相B的体积百分数为20％；

34-34.01min，流动相A的体积百分数由80％下降至39％，流动相B的体积百分数由20％上升至61％；

34.01-40min，保持流动相A的体积百分数为39％，流动相B的体积百分数为61％。

在其中一些实施例中，所述供试品溶液的制备和/或所述标准汤剂供试品溶液的制备中，所述提取溶剂为甲醇、体积浓度为50％的甲醇水溶液、体积浓度为80％的甲醇水溶液、体积浓度为50％的乙醇水溶液、乙醇中的一种，用量为每0.3g蛇床子药材加入10-100mL；提取时间为15-45min。

在其中一些实施例中，所述提取的方式为加热至回流提取或超声提取。

在其中一些实施例中，所述提取溶剂为体积浓度为80％的甲醇水溶液或体积浓度为50％的乙醇水溶液。

在其中一些实施例中，所述超高效液相色谱检测的条件还包括：所述流动相的流速为0.2-0.4mL/min；柱温为25-35℃；检测波长为310-325nm；采用的色谱柱为YMC色谱柱。

本发明还提供一种蛇床子药材的检测方法，包括如下步骤：

参照物溶液的制备：取欧前胡素对照品、蛇床子素对照品，加溶剂溶解，所得溶液作为参照物溶液；

参照药材溶液的制备：取蛇床子对照药材，加溶剂提取，制得参照药材溶液；

待测样品溶液的制备：取待测蛇床子药材，加提取溶剂提取，过滤，所得滤液作为待测样品溶液；

检测：分别吸取所述参照物溶液、参照药材溶液和待测样品溶液，注入超高效液相色谱仪，测定，获得所述待测蛇床子药材的UPLC图谱；比较所述待测蛇床子药材的UPLC图谱与所述构建方法获得的蛇床子药材的UPLC特征图谱。

在其中一些实施例中，所述超高效液相色谱检测采用的条件包括：

固定相：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；

流动相：以甲醇为流动相A，以水为流动相B；采用梯度洗脱；

所述梯度洗脱的方法包括：

0-15min，流动相A的体积百分数由3％上升至40％，流动相B的体积百分数由97％降低至60％；

15-20min，流动相A的体积百分数由40％上升至45％，流动相B的体积百分数由60％降低至55％；

20-25min，流动相A的体积百分数由45％上升至60％，流动相B的体积百分数由55％降低至40％；

25-30min，流动相A的体积百分数由60％上升至80％，流动相B的体积百分数由40％降低至20％；

30-34min，保持流动相A的体积百分数为80％，流动相B的体积百分数为20％；

34-34.01min，流动相A的体积百分数由80％下降至39％，流动相B的体积百分数由20％上升至61％；

34.01-40min，保持流动相A的体积百分数为39％，流动相B的体积百分数为61％。

在其中一些实施例中，所述待测样品溶液的制备中，所述提取溶剂为甲醇、体积浓度为50％的甲醇水溶液、体积浓度为80％的甲醇水溶液、体积浓度为50％的乙醇水溶液、乙醇中的一种，用量为每0.3g蛇床子药材加入10-100mL；提取时间为15-45min。

在其中一些实施例中，所述提取的方式为加热回流提取或超声提取。

在其中一些实施例中，所述提取溶剂为体积浓度为80％的甲醇水溶液或体积浓度为50％的乙醇水溶液。

在其中一些实施例中，所述超高效液相色谱检测的条件还包括：所述流动相的流速为0.2-0.4mL/min；柱温为25-35℃；检测波长为310-325nm；采用的色谱柱为YMC色谱柱。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明在构建蛇床子药材UPLC特征图谱的过程中：对其汤剂与药材共有的水溶性成分特征成分进行研究，并作为特征图谱特征峰确定的依据，能够很好的表征药材原料到汤剂的物质传递，不仅能够很好的把控药材质量，而还能够确保汤剂的质量；

(2)本发明通过采用超高效液相色谱(UPLC)法，并对色谱条件进行合理控制，以甲醇为流动相A，以水为流动相B进行梯度洗脱，构建的特征图谱具有7个特征峰，其中包括4个水溶性好的特征成分，分别为花椒毒素、佛手柑内酯、欧前胡素和蛇床子素成分，信息丰富，特征性强，同时其重现性好，准确可靠，可以快速、全面实现对蛇床子药材多个特征成分的质量监控，既提升了蛇床子药材的质量控制水平，又提升和稳定蛇床子药材的内在质量，为蛇床子相关的制剂工艺生产过程提供重要的多指标参数依据。

附图说明

图1为洗脱梯度条件1条件下的UPLC色谱图；

图2为洗脱梯度条件2条件下的UPLC色谱图；

图3为洗脱梯度条件3条件下的UPLC色谱图；

图4为洗脱梯度条件4条件下的UPLC色谱图；

图5为20批蛇床子药材的UPLC色谱图；

图6为蛇床子药材的特征图谱，其中，峰1：花椒毒素；峰5：佛手柑内酯；峰6：欧前胡素；峰7(S)：蛇床子素；

图7为23批蛇床子药材的重叠UPLC色谱图，其中，峰1：花椒毒素；峰5：佛手柑内酯；峰6：欧前胡素；峰7(S)：蛇床子素；

图8为蛇床子药材的对照特征图谱，其中，峰1：花椒毒素；峰5：佛手柑内酯；峰6：欧前胡素；峰7(S)：蛇床子素；

图9为蛇床子标准汤剂的UPLC色谱图与蛇床子药材的对照特征图谱的对照图；

图10为待测蛇床子药材的UPLC色谱图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明的蛇床子药材的UPLC特征图谱构建方法和检测方法作进一步详细的说明。

实施例1

本实施例为蛇床子药材的UPLC特征图谱构建方法。

蛇床子的主要成分为香豆素类化合物，包括蛇床子素、佛手柑内酯、花椒毒素、欧前胡素等。为保持蛇床子药材与临床汤剂质量标准的一致性，全面控制蛇床子药材质量，建立蛇床子药材特征图谱，并对建立的分析方法进行验证。

1、仪器、试剂与试药

仪器：Waters超高效液相色谱仪(沃特世公司，Waters H-class)，TUV检测器(沃特世公司)；Empower工作站；万分之一天平(梅特勒-托利多公司，ME204E)；百万分之一天平(梅特勒-托利多公司，XP26)；超纯水机(默克公司，Milli-Q Direct 8/16system)；超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司，KQ5500DE)；YMC C18色谱柱(100mm×2.1mm，1.9μm)。

试剂：乙醇(天津市永大化学试剂有限公司)为分析级、甲醇(广东光华科技股份有限公司)为分析级，乙腈(默克股份有限公司)为色谱级、水为超纯水(默克股份有限公司，Mili-Q Direct)。

试药：欧前胡素(中国食品药品检定研究院，含量：99.6％，批号：110826-201616)，蛇床子素(中国食品药品检定研究院，含量：99.5％，批号：110822-201710)，花椒毒素(成都普菲德生物技术有限公司，含量：98％，批号：17111503)，佛手柑内酯(成都普菲德生物技术有限公司，含量：98％，批号：17120501)。23批蛇床子药材信息见表1。

药材来源：本研究共收集了共23批蛇床子原药材，其中来自江苏省8批，山东9批，河南3批，湖北3批。

表1 23批蛇床子药材信息表

备注：蛇床子素含量是按中国药典(2015年版)蛇床子项下含量测定方法测定。

2、参照物溶液和参照药材溶液的制备

(1)参照物溶液的制备

取欧前胡素对照品适量，精密称定，置于20mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，即得每1mL含欧前胡素0.1003mg的储备液；取蛇床子素对照品适量，精密称定，置于20mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得每1mL含蛇床子素0.0863mg的储备液；取佛手柑内酯对照品适量，精密称定，置于20mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得每1mL含佛手柑内酯0.1034mg的储备液；取花椒毒素对照品适量，精密称定，置于20mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，即得每1mL含花椒毒素0.1150mg的储备液。

精密量取欧前胡素储备液5mL于5mL量瓶中，制成每1mL含欧前胡素20.0594μg的混合溶液，摇匀，即得。

精密量取蛇床子素储备液1mL于5mL量瓶中，加甲醇制成每1mL含蛇床子素34.5333μg的混合溶液，摇匀，即得。

精密量取佛手柑内酯储备液1mL于20mL量瓶中，加甲醇制成每1mL含佛手柑内酯5.1695μg的溶液，摇匀，即得。

精密量取花椒毒素储备液2mL于20mL量瓶中，加甲醇制成每1mL含花椒毒素11.4950μg的溶液，摇匀，即得。

(2)参照药材溶液的制备

取蛇床子对照药材0.2g，加水20mL，浸泡30分钟，煮沸后保持微沸30分钟，放冷，滤过，取续滤液，作为参照药材溶液。

3、色谱条件的确定

(1)梯度条件的确定

称取蛇床子药材粉末(过三号筛)(G1712157)约0.3g，精密称定，精密加入甲醇10mL，超声处理(功率300W，频率50kHZ)30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

①梯度条件1

Waters HSS T3C18(2.1×100mm，1.8μm)色谱柱；进样量：1μL；柱温：30℃；以甲醇为流动相A，水为流动相B，按表2中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.3mL，检测波长为310nm。结果如图1。

表2梯度洗脱表

由图1可知，特征峰的峰型较差(如标识部分)。

②梯度条件2

Waters HSS T3C18(2.1×100mm，1.8μm)色谱柱；进样量：1μL；柱温：30℃；以甲醇为流动相A，水为流动相B，按表3中的规定进行梯度洗脱，流速为每分钟0.3mL，检测波长为310nm。结果如图2所示。

表3梯度洗脱表

由图2可知，较梯度条件1而言，峰型有改善，但图中标识部分峰型仍需进一步优化。

③梯度条件3

Waters HSS T3 C18(2.1×100mm，1.8μm)色谱柱；进样量：1μL；柱温：30℃；以甲醇为流动相A，水为流动相B，按下表4中的规定进行梯度洗脱，流速为每分钟0.3mL，检测波长为310nm。结果如图3所示。

表4梯度洗脱表

由图3可知，部分峰型有改善，图中标识部分峰型需进一步优化。

④梯度条件4

尝试改变流速及色谱柱进行优化，流速为每分钟0.20mL，色谱柱为YMC TriartC18((2.1×100mm，1.9μm)其他条件同梯度条件3，按下表5中的规定进行梯度洗脱，检测波长为310nm，结果如图4所示。

表5梯度洗脱表

由图4可知，该梯度条件下，各色谱峰峰型较好。

(2)最佳吸收波长的确定

在梯度条件4基础上，全波长扫描，考察蛇床子药材不同色谱波长的峰情况，选择最优波长。

考察可知，310nm和245nm较优，而310nm峰信息量最全，各色谱峰响应较好，245nm后端基线较飘，故选择310nm作为蛇床子标准汤剂特征图谱检测波长。

(3)最佳色谱柱的确定

在色谱条件4基础上，检测波长为310nm，分别考察AgilentSB C18(2.1×100mm，1.8μm)，YMC Triart C18(2.1×100mm，1.9μm)，Waters HSS T3(2.1×100mm，1.8μm)，对色谱峰的分离效果。其它色谱条件同梯度条件4。

考察可知，YMC色谱柱峰响应及峰型效果最优，故选择YMC色谱柱作为蛇床子药材特征图谱色谱柱。

(4)最佳流动相确定

①水相考察

在梯度条件4基础上，检测波长为310nm，色谱柱为YMC Triart C18(2.1×100mm，1.9μm)，分别考察水、体积浓度0.1％磷酸水溶液、体积浓度0.1％乙酸水溶液对色谱峰的影响。

考察可知，不加酸获得的蛇床子药材特征图谱峰形以及分离效果较佳，故选择水作为蛇床子药材特征图谱水相。

②有机相考察

在梯度条件4基础上，检测波长为310nm，对有机相进行考察。分别考察甲醇-水和乙腈-水对色谱峰的影响。

考察可知，甲醇水分离效果胜于乙腈-水，故选择甲醇-水作为流动相。

(5)最佳柱温确定

在梯度条件4基础上，检测波长为310nm，甲醇-水作为流动相，分别考察30℃、35℃、40℃对特征图谱的影响，选择最优柱温。

考察可知，当柱温为30℃时，各色谱峰分离效果较好，故选择30℃。

(6)最佳流速确定

在梯度条件4基础上，检测波长为310nm，甲醇-水作为流动相，柱温为30℃，分别考察0.20mL/min、0.25mL/min、0.30mL/min特征图谱的影响，选择最优流速。

考察可知，当流速为0.20和0.25mL/min时，各色谱峰峰型及分离效果较好，为节省溶剂，故选择0.20mL/min。

(7)色谱条件的确定

以YMC C18(100mm×2.1mm，1.9μm)为色谱柱，进样量：对照品溶液及供试品溶液各1μL；以甲醇为流动相A，以水溶液为流动相B，按表4-34中规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.20mL；柱温为30℃；检测波长为310nm。理论板数按蛇床子素峰计算应不低于6000。

4、供试品溶液制备方法考察

对蛇床子药材供试品溶液制备方法的料液比、提取溶剂、提取方式、提取时间进行考察，确定供试品溶液制备方法。

(1)料液比考察

本次实验研究主要考察了料液比为0.3:10、0.3:20、0.3:50、0.3:100g/m这4种料液比对蛇床子药材特征图谱的影响。

取蛇床子药材粉末(过三号筛)(G1712157)约0.3g，平行4组，每组2份，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入10mL、20mL、50mL、100mL的甲醇，称定重量，超声处理(功率300W，频率50kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。按“3”项下色谱条件，进样，测定，计算总特征峰面积/称样量，计算总特征峰面积/取样量×体积。结果见表6。

表6不同料液比考察结果表

由表可知，料液比为0.3:10、0.3:20、0.3:50、0.3:100时“总特征峰面积/取样量×体积”相差不大，结果表明，四种料液比提取能力相当，蛇床子药材提取完全。另，料液比为0.3:20时色谱图中各色谱峰响应较好，考虑到色谱峰的响应，选择0.3:20。

(2)提取溶剂考察

本次实验研究主要考察了甲醇、体积浓度50％甲醇水溶液(50％甲醇)、体积浓度80％甲醇水溶液(80％甲醇)、体积浓度50％乙醇水溶液(稀乙醇)、乙醇，5种提取溶剂对蛇床子药材特征图谱的影响。

取蛇床子药材粉末(过三号筛)(G1712157)约0.3g，平行5份，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入甲醇、50％甲醇、80％甲醇、稀乙醇、乙醇20mL，称定重量，超声处理(功率300W，频率50KHz)30分钟，放冷，再称定重量，分别用甲醇、50％甲醇、80％甲醇、稀乙醇、乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。按“3”项下色谱条件，进样，测定，结果见表7。

表7不同提取溶剂考察结果

结果表明，采用上述提取溶剂，色谱峰的数量相差不大，但以80％甲醇、稀乙醇“总特征峰面积/取样量”最大，表明80％甲醇、稀乙醇提取能力相当，综合考虑溶剂提取能力、溶液稳定性及溶剂效应，80％甲醇是较为合适的溶剂。

(3)提取方式考察

本次实验研究主要考察了超声与回流提取两种处理方式对蛇床子药材特征图谱的影响。

取蛇床子药材粉末(过三号筛)(G1712157)约0.3g，平行2份，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80％甲醇20mL，称定重量，分别超声处理(功率300W，频率50KHz)30分钟，加热回流30分钟。放冷，再称定重量，用80％甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，即得。按“2.2.3.6.2”项下色谱条件，进样，测定，结果见表8。

表8不同提取方式考察结果

结果表明，采用超声处理和加热回流两种提取方式的色谱图相差不大，考虑操作的简便性，采用超声处理提取方式。

(4)提取时间考察

本次实验研究主要考察超声处理(功率300W，频率50KHz)15分钟、30分钟、45分钟对蛇床子药材特征图谱的影响。

取蛇床子药材粉末(过三号筛)(G1712157)约0.3g，平行3份，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80％甲醇20mL，称定重量，分别超声处理(功率300W，频率50KHz)15、30、45分钟，放冷，再称定重量，用80％甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，即得。按“3”项下色谱条件，进样，测定，结果见表9。

表9不同提取时间考察结果

结果显示，不同提取时间对色谱图影响不大，为了保证提取完全，故选择超声30分钟。

(5)供试品溶液制备方法的确定

取蛇床子药材粉末约0.3g(过三号筛)(G1712157)，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入80％甲醇20mL，称定重量，超声处理(功率300W，频率50KHz)30分钟，放冷，再称定重量，用80％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

5、共有峰的确认

取20批蛇床子药材，按“2”项下的参照物溶液和参照药材溶液的制备、“3”项下色谱条件与“4”项下确定的供试品溶液制备方法，对20批蛇床子药材特征图谱进行测定并进行共有峰匹配，实验结果如图5和6所示：

实验结果显示：20批蛇床子药材特征图谱的共有峰有：峰1(花椒毒素)、峰2、峰3、峰4、峰5(佛手柑内酯)、峰6(欧前胡素)、峰7(蛇床子素)。

6、稳定性考察

取蛇床子药材粉末(过三号筛)(G1712157)，按“4”项下确定的方法制备成供试品溶液。按“3”项下的色谱条件，于室温下放置，在0小时、2小时、4小时、6小时、8小时、12小时进样测定，以蛇床子素峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间RSD和相对峰面RSD，结果见表10、表11。

表10稳定性考察结果(相对保留时间)

表11稳定性考察结果(相对峰面积)

实验结果：供试品溶液在12小时内7个色谱峰相对保留时间的RSD<3％，相对峰面积的RSD<3％，表明该特征方法下供试品溶液在12小时内稳定。

7、耐用性考察

(1)不同色谱柱考察

取蛇床子药材粉末(过三号筛)(G1712157)，按“4”项下确定的方法制备成供试品溶液，按“3”项下的色谱条件，比较YMC C18(100mm×2.1mm，1.9μm，编号：BH-079)、YMC C18(100mm×2.1mm，1.9μm，编号：BH-072)、YMC C18(100mm×2.1mm，1.9μm，编号：BH-114)色谱柱分离色谱图，以蛇床子素峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间RSD和相对峰面积RSD，结果见表12、表13。

表12不同色谱柱考察结果(相对保留时间)

表13不同色谱柱考察结果(相对峰面积)

实验结果：采用同类型不同型号色谱柱，相对保留时间RSD在0.00％～1.15％范围内，相对峰面积RSD在0.00％～2.47％范围内，表明该分析方法对同类型不同型号色谱柱耐用性较好。

(2)不同柱温考察

取蛇床子药材粉末(过三号筛)(G1712157)，按“4”项下确定的方法制备成供试品溶液，按“3”项下的色谱条件，分别比较柱温为28℃、30℃、32℃时的色谱图，以蛇床子素峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间RSD和相对峰面积RSD，结果见表14、表15。

表14不同柱温考察结果(相对保留时间)

表15不同柱温考察结果(相对峰面积)

实验结果：采用不同柱温时，相对保留时间RSD在0.06％～4.36％范围内，相对峰面积RSD在1.23％～3.09％范围内，表明该分析方法不同柱温耐用性较好。柱温小的变动能满足系统适用性要求。

(3)不同流速考察

取蛇床子药材粉末(过三号筛)(G1712157)，按“4”项下确定的方法制备成供试品溶液，按“3”项下的色谱条件，分别比较流速0.28mL/min、0.30ml/min、0.32ml/min时的色谱图，以蛇床子素峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间RSD和相对峰面积RSD，结果见表16、表17。

表16不同流速考察结果(相对保留时间)

表17不同流速考察结果(相对峰面积)

实验结果：采用不同流速考察时，实验结果显示不同流速时峰1相对保留时间RSD＝6.51％，说明流速的微小变动对峰1相对保留时间有影响，可固定流速以满足系统适用性要求。

(4)不同色谱仪考察

取蛇床子药材粉末(过三号筛)(G1712157)，按“4”项下确定的方法制备成供试品溶液，按“3项下的色谱条件，分别比较Waters PDA、Waters TUV、赛默飞、安捷伦UPLC不同色谱仪蛇床子色谱图，以蛇床子素峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间RSD和相对峰面积RSD，结果见表18、表19。

表18不同色谱仪考察结果(相对保留时间)

表19不同色谱仪考察结果(相对峰面积)

实验结果：采用不同色谱仪时，相对保留时间RSD在0.13％～3.79％范围内，峰1与峰2相对峰面积RSD分别为10.13％、15.38％。峰1与峰2相对峰面积较小，不同色谱仪对峰1与峰2相对峰面积影响较大，Waters与安捷伦仪器数据较接近，赛默飞差异较大。

综上所述，在蛇床子药材特征图谱方法的耐用性考察中发现，相对保留时间较为稳定，流速对相对峰面积的影响较大，可固定流速，即可满足系统适应性要求。

8、蛇床子药材特征图谱的确定

对23批蛇床子药材特征图谱进行分析，以蛇床子素相对应的色谱峰7为参照峰S，计算峰1～峰6的相对保留时间以及相对峰面积，实验结果如表20、21和图7所示：

表20 23批蛇床子药材特征图谱(相对保留时间)

表21 23批蛇床子药材特征图谱(相对峰面积)

将23批蛇床子药材特征图谱通过匹配，使用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》生成对照图谱，建立蛇床子药材对照特征图谱，如图8所示。

结果分析与讨论：

结果显示，23批蛇床子药材特征图谱具有7个共有峰。

以峰7蛇床子素为参照峰，23批蛇床子药材特征图谱的其他6个特征峰相对保留时间RSD值在0.80％～1.40％，均小于3.0％，符合蛇床子药材特征图谱的标准要求；23批蛇床子药材特征图谱的6个特征峰相对峰面积的RSD在10.44％～81.23％，结果表明不同产地蛇床子药材的特征峰对应成分存在一定差异，峰1相对峰面积范围为0.014～0.084，峰2相对峰面积范围为0.003～0.029，峰3相对峰面积范围为0.003～0.035，峰4相对峰面积范围为0.036～0.084，峰5相对峰面积范围为0.039～0.082，峰6相对峰面积范围为0.191～0.314。

为严格控制蛇床子配方颗粒的质量，为蛇床子标准汤剂和配方颗粒的制备提供质优且稳定的原料药材，对蛇床子药材特征图谱的特征峰相对峰面积设定限量标准，是非常必要的。因此，根据23批次不同产地蛇床子药材的峰1、峰2、峰3、峰4、峰5、峰6的相对峰面积波动范围，考虑23批次不同产地样品的代表性，取各特征峰相对峰面积的最低、最高值，规定6个特征峰的相对峰面积范围，即：以蛇床子素参照物相应的峰7为S峰，各特征峰与S峰的相对峰面积，峰1相对峰面积范围为0.014～0.084，峰2相对峰面积范围为0.003～0.029，峰3相对峰面积范围为0.003～0.035，峰4相对峰面积范围为0.036～0.084，峰5相对峰面积范围为0.039～0.082，峰6相对峰面积范围为0.191～0.314。

构建获得的蛇床子药材特征图谱标准为：特征图谱中应有7个特征峰，峰6与参照物峰保留时间一致，其他峰与蛇床子素参照物相应的峰7为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应该在规定值的±10％之内，规定值为：0.59(峰1)、0.66(峰2)、0.76(峰3)、0.78(峰4)、0.80(峰5)；计算各特征峰与S峰的相对峰面积，其相对峰面积应该在规定值之内，规定值为：0.014～0.084(峰1)、0.003～0.029(峰2)、0.003～0.035(峰3)、0.036～0.084(峰4)、0.039～0.082(峰5)、0.191～0.314(峰6)。

9、蛇床子药材、标准汤剂特征图谱共有峰的确定

蛇床子标准汤剂的制备方法：

取蛇床子药材，拣选除杂，得蛇床子饮片；取蛇床子药材100g，加水煎煮两次，第一次煎煮加8倍量水，浸泡30分钟，武火(500W)煮沸后文火(200W)保持微沸30分钟，用350目筛趁热过滤，滤液迅速冷水冷却；第二次加6倍量水，武火加热煮沸后文火保持微沸25分钟，煎液用350目筛网趁热过滤，滤液迅速用冷水冷却，合并两次煎液；采用旋转蒸发仪减压低温浓缩(温度：65℃；真空度：-0.10MPa)至120mL的浸膏；在磁力搅拌下，分装至棕色西林瓶中，真空冷冻干燥机中冻干，取出，密封，即得。

样品测定：取23批蛇床子药材的标准汤剂，按“3”项下色谱条件与“4”项下确定的供试品制备方法，获得23批次蛇床子标准汤剂UPLC特征图谱，并进行共有峰标识，建立蛇床子标准汤剂UPLC特征图谱。

实验结果：对比蛇床子标准汤剂UPLC特征图谱以及蛇床子的对照特征图谱(图9)，7个特征峰均能从蛇床子药材稳定转移到蛇床子标准汤剂中，即蛇床子药材特征图谱与标准汤剂特征图谱中的7个特征峰相对应。

实施例2

本实施例为一种蛇床子药材的检测方法，步骤如下：

1、色谱条件

以YMC C18(100mm×2.1mm，1.9μm)为色谱柱，进样量：对照品溶液及供试品溶液各1μL；以甲醇为流动相A，以水溶液为流动相B，按下表(表5)中规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.20mL；柱温为30℃；检测波长为310nm。理论板数按蛇床子素峰计算应不低于6000。

表5

2、样品溶液的制备：取待测蛇床子药材粉末(过三号筛)约0.3g(批号：G1712163)，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入80％甲醇20mL，称定重量，超声处理(功率300W，频率50KHz)30分钟，放冷，再称定重量，用80％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

3、参照物溶液和参照药材溶液的制备

取欧前胡素对照品、蛇床子素对照品适量，加甲醇制成每1mL含欧前胡素20μg、蛇床子素35μg的混合溶液，作为参照物溶液。

取蛇床子对照药材0.2g，加水20mL，浸泡30分钟，煮沸后保持微沸30分钟，放冷，滤过，取续滤液，作为参照药材溶液。

4、测定：精密吸取样品溶液、参照物溶液和参照药材溶液，注入超高效液相色谱仪，按照1的色谱条件进行测定，即得待测蛇床子药材的UPLC图谱，见表22和图10。

表22待测蛇床子药材特征图谱的相对保留时间和相对峰面积

将该待测蛇床子药材特征图谱(图10)与蛇床子药材对照特征图谱(图8)进行比较：该待测蛇床子药材能检出7个特征峰，并与对照特征图谱中的7个特征峰相对应。数据结果显示(表22)，该待测蛇床子药材具有相同的7个特征峰，且其相对峰面积和相对保留时间均在标准规定的范围内，由此说明，该批次蛇床子药材质量合格，且质量较稳定，满足临床汤剂的使用要求。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种蛇床子药材的UPLC特征图谱构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

参照物溶液的制备：分别取欧前胡素对照品、蛇床子素对照品、花椒毒素对照品、佛手柑内酯对照品，加溶剂溶解，所得溶液作为参照物溶液；

参照药材溶液的制备：取蛇床子对照药材，加溶剂提取，制得参照药材溶液；

供试品溶液的制备：取蛇床子药材，加提取溶剂提取，过滤，所得滤液作为供试品溶液；

标准汤剂供试品溶液的制备：取蛇床子标准汤剂样品，加提取溶剂提取，过滤，所得滤液作为标准汤剂供试品溶液；

超高效液相色谱检测：分别吸取所述参照物溶液、参照药材溶液、供试品溶液、标准汤剂供试品溶液，注入超高效液相色谱仪，测定；比较所得供试品图谱与标准汤剂供试品图谱，标定水溶性共有峰，获得蛇床子药材的UPLC特征图谱。

2.根据权利要求1所述的蛇床子药材的UPLC特征图谱构建方法，其特征在于，所述超高效液相色谱检测采用的条件包括：

固定相：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；

流动相：以甲醇为流动相A，以水为流动相B；采用梯度洗脱；

所述梯度洗脱的方法包括：

0-15min，流动相A的体积百分数由3％上升至40％，流动相B的体积百分数由97％降低至60％；

15-20min，流动相A的体积百分数由40％上升至45％，流动相B的体积百分数由60％降低至55％；

20-25min，流动相A的体积百分数由45％上升至60％，流动相B的体积百分数由55％降低至40％；

25-30min，流动相A的体积百分数由60％上升至80％，流动相B的体积百分数由40％降低至20％；

30-34min，保持流动相A的体积百分数为80％，流动相B的体积百分数为20％；

34-34.01min，流动相A的体积百分数由80％下降至39％，流动相B的体积百分数由20％上升至61％；

34.01-40min，保持流动相A的体积百分数为39％，流动相B的体积百分数为61％。

3.根据权利要求1所述的蛇床子药材的UPLC特征图谱构建方法，其特征在于，所述供试品溶液的制备和/或所述标准汤剂供试品溶液的制备中，所述提取溶剂为甲醇、体积浓度为50％的甲醇水溶液、体积浓度为80％的甲醇水溶液、体积浓度为50％的乙醇水溶液、乙醇中的一种，用量为每0.3g蛇床子药材加入10-100mL；提取时间为15-45min；及/或，所述提取的方式为加热至回流提取或超声提取。

4.根据权利要求3所述的蛇床子药材的UPLC特征图谱构建方法，其特征在于，所述提取溶剂为体积浓度为80％的甲醇水溶液或体积浓度为50％的乙醇水溶液。

5.根据权利要求1-4任一项所述的蛇床子药材的UPLC特征图谱构建方法，其特征在于，所述超高效液相色谱检测的条件还包括：所述流动相的流速为0.2-0.4mL/min；柱温为25-35℃；检测波长为310-325nm；采用的色谱柱为YMC色谱柱。

6.一种蛇床子药材的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

参照物溶液的制备：取欧前胡素对照品、蛇床子素对照品，加溶剂溶解，所得溶液作为参照物溶液；

参照药材溶液的制备：取蛇床子对照药材，加溶剂提取，制得参照药材溶液；

待测样品溶液的制备：取待测蛇床子药材，加提取溶剂提取，过滤，所得滤液作为待测样品溶液；

检测：分别吸取所述参照物溶液、参照药材溶液和待测样品溶液，注入超高效液相色谱仪，测定，获得所述待测蛇床子药材的UPLC图谱；比较所述待测蛇床子药材的UPLC图谱与权利要求1-5任一项所述构建方法获得的蛇床子药材的UPLC特征图谱。

7.根据权利要求6所述的蛇床子药材的检测方法，其特征在于，所述超高效液相色谱检测采用的条件包括：

固定相：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；

流动相：以甲醇为流动相A，以水为流动相B；采用梯度洗脱；

所述梯度洗脱的方法包括：

0-15min，流动相A的体积百分数由3％上升至40％，流动相B的体积百分数由97％降低至60％；

15-20min，流动相A的体积百分数由40％上升至45％，流动相B的体积百分数由60％降低至55％；

20-25min，流动相A的体积百分数由45％上升至60％，流动相B的体积百分数由55％降低至40％；

25-30min，流动相A的体积百分数由60％上升至80％，流动相B的体积百分数由40％降低至20％；

30-34min，保持流动相A的体积百分数为80％，流动相B的体积百分数为20％；

34-34.01min，流动相A的体积百分数由80％下降至39％，流动相B的体积百分数由20％上升至61％；

34.01-40min，保持流动相A的体积百分数为39％，流动相B的体积百分数为61％。

8.根据权利要求6所述的蛇床子药材的检测方法，其特征在于，所述待测样品溶液的制备中，所述提取溶剂为甲醇、体积浓度为50％的甲醇水溶液、体积浓度为80％的甲醇水溶液、体积浓度为50％的乙醇水溶液、乙醇中的一种，用量为每0.3g蛇床子药材加入10-100mL；提取时间为15-45min；及/或，所述提取的方式为加热至回流提取或超声提取。

9.根据权利要求8所述的蛇床子药材的检测方法，其特征在于，所述提取溶剂为体积浓度为80％的甲醇水溶液或体积浓度为50％的乙醇水溶液。

10.根据权利要求6-9任一项所述的蛇床子药材的检测方法，其特征在于，所述超高效液相色谱检测的条件还包括：所述流动相的流速为0.2-0.4mL/min；柱温为25-35℃；检测波长为310-325nm；采用的色谱柱为YMC色谱柱。