CN109632995A - 一种酸枣仁黄酮类成分uplc指纹图谱的建立方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种酸枣仁黄酮类成分UPLC指纹图谱的建立方法及应用。本发明建立了能快速鉴定酸枣仁真伪的酸枣仁黄酮类成分UPLC指纹图谱，分析未知样品时，只需提取药材黄酮类成分，测定其UPLC指纹图谱，计算未知样品与共有模式的相似度，即可对未知样品进行鉴定、分类和评价。该方法快速、稳定且专属性强，基线平稳，为酸枣仁药材质量控制提供科学的新方法。
Description
技术领域
本发明属于中药鉴别领域，具体涉及一种酸枣仁黄酮类成分UPLC指纹图谱的建立方法及应用。
背景技术
酸枣仁是鼠李科植物酸枣Ziziphus jujuba Mill.var.spinosa(Bunge)Hu exH.F.Chow的干燥成熟种子，主要分布在我国辽宁、河北、河南、山东、山西等省。酸枣仁主要含皂苷类、黄酮类、生物碱、脂肪酸、氨基酸、酸枣多糖及微量元素，具有镇静、催眠、降压降血脂等多种药理作用；因此，中医临床常首选酸枣仁为君药组方治疗虚烦不眠，惊悸多梦，体虚多汗，津伤口渴等症。由于良好的临床疗效及广泛的临床应用，酸枣仁需求量增大、价格上涨，导致出现伪品及掺伪品。
文献报道酸枣仁质量控制研究主要为HPLC-ELSD指纹图谱，也有部分低波长HPLC-UV指纹图谱，虽然分析信息全面，但是检测信号基线漂移严重，容易丢失峰信息且精密度较差。相关研究也报道了酸枣仁药材具有大量的黄酮类成分，目前，尚无对酸枣仁黄酮类成分UPLC指纹图谱的研究报道。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种酸枣仁黄酮类成分UPLC指纹图谱的建立方法，该方法快速、稳定且专属性强，为酸枣仁药材质量控制提供科学的新方法。
本发明是通过以下技术方案实现：
一种酸枣仁黄酮类成分UPLC指纹图谱的建立方法，包括如下步骤：
(a)混合对照品溶液的制备：精密称取斯皮诺素、木兰花碱对照品适量，用甲醇配制成每1ml含斯皮诺素20μg、木兰花碱15μg的混合对照品溶液；
(b)供试品溶液的制备：酸枣仁粉末过筛，取1.0g，精密称定，置锥形瓶中，加50-70％甲醇20-30ml，称定质量，加热回流提取40-60分钟，放冷，再称定质量，用50-70％甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，即得；
(c)色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A、0.05％甲酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱：0～7min，3％～15％A；7～10min，15％～17％A；10～15min，17％A～17％A；15～20min，17％～25％A；20～25min，25％～90％A；柱温：35℃；检测器：PDA；检测波长：254nm；流速：0.4ml/min；进样体积：1μl；
(d)黄酮类成分UPLC指纹图谱的建立：分别精密吸取混合对照品溶液与供试品溶液各1μl，注入高效液相色谱仪，测定，记录色谱图；再将色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价软件》，建立酸枣仁黄酮类成分UPLC指纹图谱的共有模式图并计算相似度，确定具有26个共有峰；
(e)色谱峰的指认：通过UPLC-Q-TOF-MS方法对26个共有峰进行成分的分析与指认，鉴定出6个黄酮类成分共有峰。
进一步优选的，所述(b)中，供试品溶液的制备：酸枣仁粉末过65目筛，取1.0g，精密称定，置锥形瓶中，加70％甲醇20ml，称定质量，加热回流提取60分钟，放冷，再称定质量，用70％甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，即得。
进一步优选的，所述UPLC-Q-TOF-MS方法，质谱条件为：氮气作为质谱离子源的雾化、锥孔气；电喷雾电离正离子模式；毛细管电压：2.0KV；锥孔电压：40V；离子源温度：120℃；脱溶剂气温度：450℃；脱溶剂气流速：800L/hr；扫描时间：0.5s；扫描时间间隔：0.02s；质荷比范围：50～1200；数据采集模式：ESI(+/-)下采集MSE；以甲酸钠溶液为校正质量轴，以亮氨酸脑啡肽为内标校正质量精度，锥孔气体流量：50L/hr。
本发明还提供了所述的一种酸枣仁黄酮类成分UPLC指纹图谱的建立方法在酸枣仁真伪鉴别中的应用。鉴别时，根据酸枣仁黄酮类成分UPLC指纹图谱的建立方法，提取待测酸枣仁样品中的黄酮类成分，测定待测酸枣仁样品的UPLC指纹图谱，计算与酸枣仁黄酮类成分UPLC指纹图谱共有模式的相似度，相似度＞0.98的为正品。
本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：
本发明建立了能快速鉴定酸枣仁真伪的酸枣仁黄酮类成分UPLC指纹图谱，分析未知样品时，只需提取药材黄酮类成分，测定其UPLC指纹图谱，计算未知样品与共有模式的相似度，正品相似度＞0.98，即可对未知样品进行鉴定、分类和评价。该方法快速、稳定且专属性强，基线平稳，为酸枣仁药材质量控制提供科学的新方法。
附图说明
图1 16批不同产地酸枣仁黄酮类UPLC指纹图谱叠加图；
图2酸枣仁黄酮类成分UPLC指纹图谱共有模式图；
图3酸枣仁黄酮类成分提取溶剂考察色谱图；
图4酸枣仁黄酮类成分提取方式考察色谱图；
图5酸枣仁黄酮类成分提取时间考察色谱图；
图6-8为酸枣仁黄酮类成分检测波长考察色谱图(分别为254nm、204nm、335nm)；
图9-11为酸枣仁黄酮类成分不同流动相考察色谱图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明，以下实施例为本发明具体的实施方式，但本发明的实施方式并不受下述实施例的限制。
实施例1：一种酸枣仁黄酮类成分UPLC指纹图谱的建立方法
1、仪器与试药
Waters高效液相色谱仪(美国Waters公司，PDA检测器)，Empower 3.0色谱工作站。Waters ACQUITY UPLCTM I-Class型超高效液相色谱仪；沃特世超高效液相飞行时间高分辨质谱联用系统(Xevo G2-XS Q-TOF MS)，UNIFI 1.8工作站(Waters,Manchester,U.K.)。万分之一分析天平(ME204E，梅特勒-托利多公司)；百万分之一分析天平(XP26，梅特勒-托利多公司)；数控超声波清洗器(KQ-500DE，昆山市超声仪器有限公司)；恒温水浴锅(HWS28，上海一恒科技有限公司)；超纯水系统(Milli-Q Direct，默克股份有限公司)。
斯皮诺素(批号：B221711108，含量：98％，中国食品药品检定研究院)，木兰花碱(批号:150813，含量：≥98％，成都普菲德生物科技有限公司)，乙腈(默克股份有限公司，色谱纯)，甲酸(天津市科密欧化学试剂有限公司，色谱纯)；乙醇、甲醇(天津市富宇精细化工有限公司，分析纯)；水为超纯水。16批酸枣仁购自各地药材市场，由广东一方制药有限公司质量中心鉴定，见表1。
表1 16批酸枣仁药材信息
2方法与结果
2.1液相色谱及质谱条件
液相条件：色谱柱为Waters Cortecs T3(100mm×2.1mm，1.6μm)；以乙腈为流动相A、0.05％甲酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱：0～7min，3％～15％A；7～10min，15％～17％A；10～15min，17％A～17％A；15～20min，17％～25％A；20～25min，25％～90％A；柱温：35℃；检测器：PDA；检测波长：254nm；流速：0.4ml/min；进样体积：1μl。
质谱条件：氮气作为质谱离子源的雾化、锥孔气；电喷雾电离正离子模式；毛细管电压：2.0KV；锥孔电压：40V；离子源温度：120℃；脱溶剂气温度：450℃；脱溶剂气流速：800L/hr；扫描时间：0.5s；扫描时间间隔：0.02s；质荷比范围：50～1200；数据采集模式：ESI(+/-)下采集MSE；以甲酸钠溶液为校正质量轴，以亮氨酸脑啡肽为内标校正质量精度，锥孔气体流量：50L/hr。
2.2混合对照品溶液
精密称取斯皮诺素、木兰花碱对照品适量，用甲醇配制成每1ml含斯皮诺素20μg、木兰花碱15μg的混合对照品溶液。
2.3供试品溶液
酸枣仁粉末，过65目筛，取1.0g，精密称定，置锥形瓶中，加70％甲醇20ml，称定质量，加热回流提取60分钟，放冷，再称定质量，用70％甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，即得。
3、供试品溶液制备方法考察
3.1提取溶剂考察
酸枣仁粉末过65目筛，取1.0g，平行5份，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入甲醇、50％甲醇、70％甲醇、稀乙醇、70％乙醇20ml，称定质量，分别超声处理(功率250W，频率45kHz)60分钟，放冷，再称定质量，分别用相应溶剂补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。按“2.1”项下色谱条件进行检测，实验结果如表2，图3所示：
表2提取溶剂考察结果
实验结果显示70％甲醇的提取效果比稀乙醇、甲醇、70％乙醇、50％甲醇提取的色谱峰数目较多、峰形较好且“特征峰面积/取样量”较大，结合5种溶剂对26个色谱峰分离效果来看，最终选取70％甲醇作为提取溶剂。
3.2提取方式考察
酸枣仁粉末过65目筛，取1.0g，平行2份，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇20ml，称定质量，分别超声处理(功率250W，频率45kHz)60分钟、加热回流60分钟，放冷，再称定质量，用70％甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。按“2.1”项下色谱条件进行检测，实验结果如表3，图4所示：
表3提取方式考察结果
实验结果显示超声与回流提取方式对色谱峰数目、峰型影响不大，但是回流提取方式“总特征峰面积/称样量”较大，因此确定提取方式为加热回流。
3.3提取时间考察
酸枣仁粉末过65目筛，取1.0g，平行3份，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇20ml，称定质量，分别加热回流20分钟、40分钟、60分钟，放冷，再称定质量，用70％甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。按“2.1”项下色谱条件进行检测，实验结果如表4，图5所示：
表4提取时间考察结果
实验结果显示不同加热回流时间对色谱峰数目、峰型影响不大；但是当加热回流时间为60分钟时，“总特征峰面积/取样量”已经达到最大，对各成分的提取率已达到最高。故选择加热回流时间为60分钟。
4、色谱条件的确定
4.1最佳吸收波长的确定
酸枣仁粉末过65目筛，取1.0g，平行2份，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇20ml，称定质量，分别加热回流60分钟，放冷，再称定质量，用70％甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。按“2.1”项下色谱条件进行检测。结合文献研究选取了波长为204nm、335nm、254nm的色谱图进行对比(图6-8)；结果显示204nm的色谱图基线漂移，335nm的峰信息较少，而254nm的色谱图基线平稳且峰信息容量较大，因此考虑选取254nm作为检测波长。
4.2流动相的考察
酸枣仁粉末过65目筛，取1.0g，平行2份，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇20ml，称定质量，分别加热回流60分钟，放冷，再称定质量，用70％甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。按“2.1”项下色谱条件进行检测。结合文献研究选取了乙腈-水、乙腈-0.05％乙酸、乙腈-0.05％甲酸为流动相系统进行对比(图9-11)。结果显示乙腈-水的色谱图部分色谱峰拖尾严重，乙腈-0.05％甲酸的色谱图比乙腈-0.05％乙酸的色谱图分离效果好，因此考虑选取乙腈-0.05％甲酸作为流动相。
5、方法学考察
2.4.1精密度试验
精密吸取2.3项下供试品溶液1μL，连续进样6次，测定指纹图谱。结果表明，各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积基本一致，RSD均＜5％，表明仪器精密度良好。
2.4.2重复性试验
精密吸取2.3项下供试品溶液1μL，重复进样6次，测定指纹图谱。结果表明，各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积基本一致，RSD均＜5％，表明该方法重复性良好。
2.4.3稳定性试验
精密吸取2.3项下供试品溶液1μL，分别在0,2,4,6,8,12h进样，测定指纹图谱。结果表明，各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积基本一致，RSD均＜4％，表明供试品溶液在12h内稳定。
6、黄酮类成分UPLC指纹图谱的建立
分别精密吸取混合对照品溶液与供试品溶液各1μl，注入高效液相色谱仪，测定，记录色谱图，将16批样品的色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价软件》，建立酸枣仁黄酮类成分UPLC指纹图谱的共有模式图并计算相似度，确定具有26个共有峰(图1)，相似度分别为0.988、0.997、0.997、0.997、0.996、0.999、0.992、0.995、0.995、0.997、0.999、0.988、0.998、0.999、0.999、0.999，表明16批药材具有极高的相似性。
7、色谱峰的指认
通过UPLC-Q-TOF-MS方法对26个共有峰进行成分分析与指认，鉴定出6个黄酮类成分共有峰。(结构信息见下表5和图2)，表明本色谱条件能够最大程度地检测到酸枣仁药材的黄酮类成分。
表5黄酮类成分的结构信息
本发明以黄酮类为指标，选取了26个共有峰进行分析，16批次所含成分基本一致，相似度极高，因此本研究建立了能快速鉴定酸枣仁真伪的UPLC指纹图谱。
实施例2：酸枣仁黄酮类成分UPLC指纹图谱在酸枣仁真伪鉴别中的应用
取另外几批酸枣仁待测样品，提取待测酸枣仁样品中的黄酮类成分，用本发明指纹图谱的构建方法测定UPLC指纹图谱，计算与酸枣仁黄酮类成分UPLC指纹图谱共有模式的相似度，相似度＞0.98的为正品。
Claims (6)
1.一种酸枣仁黄酮类成分UPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于，包括如下步骤：
(a)混合对照品溶液的制备：精密称取斯皮诺素、木兰花碱对照品适量，用甲醇配制成每1ml含斯皮诺素20μg、木兰花碱15μg的混合对照品溶液；
(b) 供试品溶液的制备：酸枣仁粉末过筛，取1.0g，精密称定，置锥形瓶中，加50-70%甲醇20-30ml，称定质量，加热回流提取40-60分钟，放冷，再称定质量，用50-70%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，即得；
(c) 色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A、0.05%甲酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱：0~7min，3%~15% A；7~10min，15%~17% A；10~15min，17% A~17% A；15~20min，17%~25% A；20~25min，25%~90% A；柱温：35℃；检测器：PDA；检测波长：254nm；流速：0.4ml/min；进样体积：1µl；
（d）黄酮类成分UPLC指纹图谱的建立：分别精密吸取混合对照品溶液与供试品溶液各1µl，注入高效液相色谱仪，测定，记录色谱图；再将色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价软件》，建立酸枣仁黄酮类成分UPLC指纹图谱的共有模式图并计算相似度，确定具有26个共有峰；
（e）色谱峰的指认：通过UPLC-Q-TOF-MS方法对26个共有峰进行成分分析与指认，鉴定出6个黄酮类成分共有峰。
2.根据权利要求1所述的一种酸枣仁黄酮类成分UPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述（b）中，供试品溶液的制备：酸枣仁粉末过65目筛，取1.0g，精密称定，置锥形瓶中，加70%甲醇20ml，称定质量，加热回流提取60分钟，放冷，再称定质量，用70%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，即得。
3.根据权利要求1所述的一种酸枣仁黄酮类成分UPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述UPLC-Q-TOF-MS方法中，质谱条件为：
氮气作为质谱离子源的雾化、锥孔气；电喷雾电离正离子模式；毛细管电压：2.0 KV；锥孔电压：40 V；离子源温度：120 °C；脱溶剂气温度：450 °C；脱溶剂气流速：800 L/hr；扫描时间：0.5 s；扫描时间间隔：0.02 s；质荷比范围：50~1200；数据采集模式：ESI (+/-)下采集MSE；以甲酸钠溶液为校正质量轴，以亮氨酸脑啡肽为内标校正质量精度，锥孔气体流量：50L/hr。
4.根据权利要求1所述的一种酸枣仁黄酮类成分UPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于，
所述6个黄酮类成分共有峰分别为：isospinosin、斯皮诺素、6ˊˊˊ-p-coumaloylspinosin、6ˊˊˊ-feruloylspinosin、S型6''-O-(3-glc-indole-acetyl)spinosin、R型6''-O-(3-glc-indole-acetyl)spinosin。
5.权利要求1-4任一项所述的一种酸枣仁黄酮类成分UPLC指纹图谱的建立方法在酸枣仁真伪鉴别中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，根据酸枣仁黄酮类成分UPLC指纹图谱的建立方法提取待测酸枣仁样品中的黄酮类成分，测定待测酸枣仁样品的UPLC指纹图谱，计算与酸枣仁黄酮类成分UPLC指纹图谱共有模式的相似度，相似度＞0.98的为正品。
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