CN103267818B - 知母药材hplc-elsd指纹图谱的建立方法 - Google Patents
知母药材hplc-elsd指纹图谱的建立方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103267818B CN103267818B CN201310177411.3A CN201310177411A CN103267818B CN 103267818 B CN103267818 B CN 103267818B CN 201310177411 A CN201310177411 A CN 201310177411A CN 103267818 B CN103267818 B CN 103267818B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- elsd
- rhizoma anemarrhenae
- hplc
- preparation
- establishing method
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 31
- 238000001474 liquid chromatography-evaporative light scattering detection Methods 0.000 title abstract 2
- 238000000105 evaporative light scattering detection Methods 0.000 claims abstract description 38
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 31
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 28
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 claims abstract description 25
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 claims abstract description 25
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 20
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims abstract description 10
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract 6
- AEDDIBAIWPIIBD-ZJKJAXBQSA-N mangiferin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1C1=C(O)C=C(OC=2C(=CC(O)=C(O)C=2)C2=O)C2=C1O AEDDIBAIWPIIBD-ZJKJAXBQSA-N 0.000 claims description 34
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 claims description 24
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 19
- YWQSXCGKJDUYTL-UHFFFAOYSA-N Mangiferin Natural products CC(CCC=C(C)C)C1CC(C)C2C3CCC4C(C)(C)CCCC45CC35CCC12C YWQSXCGKJDUYTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- 229940043357 mangiferin Drugs 0.000 claims description 17
- VUWOVGXVRYBSGI-IRXABLMPSA-N 1,3,6-trihydroxy-2-[(2s,3r,4r,5s,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]-7-[(2s,3r,4r,5s,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyxanthen-9-one Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CC(C(C2=C(O)C([C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)=C(O)C=C2O2)=O)=C2C=C1O VUWOVGXVRYBSGI-IRXABLMPSA-N 0.000 claims description 15
- VUWOVGXVRYBSGI-UHFFFAOYSA-N 7-O-beta-D-Glucopyranoside-Mangiferin Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1=CC(C(C2=C(O)C(C3C(C(O)C(O)C(CO)O3)O)=C(O)C=C2O2)=O)=C2C=C1O VUWOVGXVRYBSGI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- WAYBWHJDPRHBMW-GUZANKGOSA-N neomangiferin Natural products OC[C@@H]1O[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O)c2cc3C(=O)c4c(O)c([C@@H]5O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]5O)c(O)cc4Oc3cc2O WAYBWHJDPRHBMW-GUZANKGOSA-N 0.000 claims description 15
- 239000013558 reference substance Substances 0.000 claims description 13
- 229930193981 timosaponin Natural products 0.000 claims description 13
- PQLVXDKIJBQVDF-UHFFFAOYSA-N acetic acid;hydrate Chemical compound O.CC(O)=O PQLVXDKIJBQVDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 3
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 claims description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 12
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 abstract description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 abstract 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 abstract 1
- 235000017709 saponins Nutrition 0.000 abstract 1
- 150000007964 xanthones Chemical class 0.000 abstract 1
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N Benzene Chemical compound C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- SORUXVRKWOHYEO-FRUGGTEYSA-N Timosaponin b ii Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1C[C@H]2CC[C@H]3[C@@H]4C[C@@H]5OC([C@H]([C@@H]5[C@@]4(C)CC[C@@H]3[C@@]2(C)CC1)C)(O)CC[C@H](C)CO[C@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O SORUXVRKWOHYEO-FRUGGTEYSA-N 0.000 description 19
- SORUXVRKWOHYEO-UHFFFAOYSA-N timosaponin B-II Natural products O1C(CO)C(O)C(O)C(O)C1OCC(C)CCC(C(C1C2(C)CCC3C4(C)CC5)C)(O)OC1CC2C3CCC4CC5OC1OC(CO)C(O)C(O)C1OC1OC(CO)C(O)C(O)C1O SORUXVRKWOHYEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 17
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 15
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 11
- 238000011160 research Methods 0.000 description 10
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 9
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 9
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 5
- 150000005856 steroid saponins Chemical class 0.000 description 5
- -1 HHG-001 Chemical compound 0.000 description 4
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 4
- 239000012925 reference material Substances 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000605445 Anemarrhena asphodeloides Species 0.000 description 3
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 3
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 3
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000612118 Samolus valerandi Species 0.000 description 2
- GMBQZIIUCVWOCD-WWASVFFGSA-N Sarsapogenine Chemical compound O([C@@H]1[C@@H]([C@]2(CC[C@@H]3[C@@]4(C)CC[C@H](O)C[C@H]4CC[C@H]3[C@@H]2C1)C)[C@@H]1C)[C@]11CC[C@H](C)CO1 GMBQZIIUCVWOCD-WWASVFFGSA-N 0.000 description 2
- 206010039966 Senile dementia Diseases 0.000 description 2
- MMTWXUQMLQGAPC-YXOKLLKRSA-N Timosaponin A-III Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1C[C@H]2CC[C@H]3[C@@H]4C[C@H]5[C@@H]([C@]4(CC[C@@H]3[C@@]2(C)CC1)C)[C@@H]([C@]1(OC[C@@H](C)CC1)O5)C)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O MMTWXUQMLQGAPC-YXOKLLKRSA-N 0.000 description 2
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 2
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 2
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000002398 materia medica Substances 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000005220 pharmaceutical analysis Methods 0.000 description 2
- 229930002600 steroidal saponin Natural products 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- MMTWXUQMLQGAPC-XWIAVXRASA-N timosaponin A-III Natural products C[C@@H]1CC[C@@]2(OC1)O[C@@H]3C[C@H]4[C@H]5CC[C@@H]6C[C@H](CC[C@]6(C)[C@H]5CC[C@]4(C)[C@@H]3[C@@H]2C)O[C@@H]7O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]7O[C@@H]8O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]8O MMTWXUQMLQGAPC-XWIAVXRASA-N 0.000 description 2
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000605447 Anemarrhena Species 0.000 description 1
- ZNTKLBZCLHHWHW-UHFFFAOYSA-N C1CC2(C)C3CCC4(C)C5C(C)C(CCC(C)C)(O)OC5C(O)C4C3CCC2CC1OC1OC(CO)C(O)C(O)C1OC1OC(CO)C(O)C(O)C1O Chemical compound C1CC2(C)C3CCC4(C)C5C(C)C(CCC(C)C)(O)OC5C(O)C4C3CCC2CC1OC1OC(CO)C(O)C(O)C1OC1OC(CO)C(O)C(O)C1O ZNTKLBZCLHHWHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010010774 Constipation Diseases 0.000 description 1
- 208000001431 Psychomotor Agitation Diseases 0.000 description 1
- 206010038743 Restlessness Diseases 0.000 description 1
- RTMWIZOXNKJHRE-UHFFFAOYSA-N Tigogenin Natural products CC1COC2CC(C)(OC12)C3CCC4C5CCC6CC(O)CCC6(C)C5CCC34C RTMWIZOXNKJHRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229930191283 anemarrhena Natural products 0.000 description 1
- LLTYVAJZUYVMKF-PDVBFRKPSA-N anemarrhenasaponin I Natural products CCCC[C@]1(O)O[C@@H]2[C@H](O)[C@H]3[C@@H]4CC[C@@H]5C[C@H](CC[C@]5(C)[C@H]4CC[C@]3(C)[C@H]2[C@@H]1C)O[C@@H]6O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]6O[C@@H]7O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]7O LLTYVAJZUYVMKF-PDVBFRKPSA-N 0.000 description 1
- 230000000879 anti-atherosclerotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000001754 anti-pyretic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002785 anti-thrombosis Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 239000002221 antipyretic Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000000889 atomisation Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 241000411851 herbal medicine Species 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002218 hypoglycaemic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000007074 memory dysfunction Effects 0.000 description 1
- 230000005311 nuclear magnetism Effects 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- ROHLIYKWVMBBFX-UHFFFAOYSA-N pseudoprototimosaponin AIII Natural products O1C(CO)C(O)C(O)C(O)C1OCC(C)CCC(O1)=C(C)C(C2(CCC3C4(C)CC5)C)C1CC2C3CCC4CC5OC1OC(CO)C(O)C(O)C1OC1OC(CO)C(O)C(O)C1O ROHLIYKWVMBBFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013094 purity test Methods 0.000 description 1
- 238000012797 qualification Methods 0.000 description 1
- 238000004451 qualitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001303 quality assessment method Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000005464 sample preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000013112 stability test Methods 0.000 description 1
- 230000035922 thirst Effects 0.000 description 1
- WPFIDMYJLPJFJI-REWKZSFCSA-N timosaponin BIII Natural products C[C@H](CCC1=C(C)[C@H]2[C@H](C[C@@H]3[C@@H]4CC[C@@H]5C[C@H](CC[C@]5(C)[C@H]4CC[C@]23C)O[C@@H]6O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]6O[C@@H]7O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]7O)O1)[C@@H]8O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]8O WPFIDMYJLPJFJI-REWKZSFCSA-N 0.000 description 1
- 229940126680 traditional chinese medicines Drugs 0.000 description 1
- 208000001072 type 2 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 238000003809 water extraction Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Steroid Compounds (AREA)
- Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
Abstract
本发明涉及知母药材HPLC-ELSD指纹图谱的建立方法及其标准指纹图谱，所述建立方法包含色谱条件、供试品溶液的制备、对照品溶液的制备，其中色谱条件为：Thermo C8色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：乙腈-0.2%醋酸水溶液梯度洗脱；柱温:20℃；流速:1mL·min-1；ELSD检测器雾化器流速：2.6L·min-1；漂移管温度：100℃；进样量：20ul。本发明的优点是方法稳定、重现性好、精密度高，能同时反映知母药材中主要的化学成分皂苷类和双苯吡酮类成分的特征，并能从色谱的整体特征上把握知母药材的质量，可将其作为知母药材质量控制的方法之一。
Description
技术领域
本发明涉及知母药材指纹图谱的建立方法及其标准指纹图谱，具体涉及知母药材HPLC-ELSD指纹图谱的建立方法及其标准指纹图谱。
背景技术
知母为常用的中药材，来源于百合科植物知母（Anemarrhena asphodeloides Bunge.）的干燥根茎，属于清热药，具有清热泻火，润肠滑燥、止渴除烦等功效。在我国主要分布于河北、山西、内蒙古、辽宁、黑龙江、吉林等省区，在河南、山东和安徽省也有分布。
数10年来，国内外学者已对知母的化学成分进行了广泛深入的研究，发现知母药材中含有甾体皂苷、双苯吡酮类、木脂素类、多糖类、有机酸类及微量元素类成分，其主要成分为甾体皂苷类和双苯吡酮类成分。其中双苯吡酮类中有芒果苷（Mangiferin）和新芒果苷（Neomangiferin），芒果苷也称知母宁，是知母药材中主要的抗炎、抗病毒和抗氧化成分。芒果苷和新芒果苷还有降血糖和改善Ⅱ型糖尿病症状的作用。
现代药理研究发现知母药材中的甾体皂苷都有着重要的药用价值，其中知母皂苷BⅡ（timosaponin BⅡ）和知母皂苷AⅢ（timosaponin AⅢ）具有抗血栓、抗动脉粥样硬化、改善记忆功能障碍和治疗老年性痴呆等作用，在抗癌方面也表现出显著的活性。知母皂苷C（timosaponin C）是知母中含量较高的呋甾皂苷之一，其水解脱糖后可转化生成菝葜皂苷元，具有改善老年痴呆症状和抗氧化、抗辐射的作用。
2010版《中国药典》对知母药材的质量控制仅限于芒果苷和知母皂苷BⅡ的含量测定，不能较全面地反映知母药材的内在质量和反映中医用药所体现的整体疗效，而且2010版《中国药典》中分别采用两种不同的检测器来测定这两种化学成分，测定方法较繁琐。
因此，建立能反映甾体皂苷类和双苯吡酮类这两类成分的知母药材指纹图谱，尤其是可体现芒果苷（Mangiferin）、新芒果苷（Neomangiferin）、知母皂苷BⅡ（timosaponin BⅡ）、知母皂苷AⅢ（timosaponin AⅢ）、知母皂苷C（timosaponin C）等五种成分，以控制和综合分析知母药材的质量已经迫在眉睫。
利用色谱指纹图谱获取全面的中药化学成分特征信息已广泛地应用于中药的质量控制之中，中药色谱指纹图谱是对中药整体性的化学特征的表达和反映。目前，美国食品药品管理局（FDA）、英国草药典、德国药用植物学会、印度草药典、加拿大药用植物学会均接受和收载指纹图谱的质量控制方法，目前指纹图谱已成为国际公认的控制中成药、天然药物质量的最有效的方法。
而关于知母药材的指纹图谱的分析方法，目前的研究报道如下：
曾志等（曾志,张艳萍,杨冬晖等.高效液相色谱指纹图谱在中药知母上的应用.中成药.2005,27(10):1120-1124.）公开了7个产地的知母提取物的高效液相色谱方法，其色谱条件为：色谱柱为HypersilODS C18柱（5μm,150mm×4.6mm），流动相为水和甲醇，检测波长270nm,流速为1.0mL·min-1。确定5个共有峰为10个样品所共有。该图谱的5个共有峰没有用对照品进行指认和鉴定，各峰的分离还有待改进。
蔡玉荣等（蔡玉荣,王世勇,刘乡乡等.知母HPLC指纹图谱研究及相似度评价.湖南中医杂志.2005,21(4)：79-80.）公开了HPLC法知母水提液正丁醇萃取物的指纹图谱,不同产地的14个样品用相似度软件评价其相似性。其色谱条件为：Agilent1100Series系列高效液相色谱仪;色谱柱为Hydrosphere C18柱（5μm,250mm×4.6mm），流动相为乙腈 和0.01%磷酸梯度洗脱，流速1ml·min-1;检测波长236nm;柱温:30℃。其指纹图谱主要有5个特征峰，没有对特征峰进行指认。
以上方法选用HPLC紫外检测器，没有反映知母药材中皂苷类成分的信息，究其原因是：所含的皂苷类成分为甾体皂苷类，没有紫外吸收，用传统的紫外检测器对其进行定性定量分析不适用，而ELSD检测器可以弥补这方面的不足。
张志斐等（张志斐,肖蓉,袁志芳等.河北道地药材知母HPLC-ELSD指纹图谱研究.药物分析杂志.2006,26(11):1569-1573.）公开了河北19个不同来源的知母样品的HPLC-ELSD指纹图谱研究方法，其色谱条件为：DiamonsilTM C18(200mm×4.6mm，5μm)色谱柱，乙腈（A）-水（B）为流动相，梯度洗脱（0-20min，23%A；25min，31%A；35min，33%A；55min，48%A；60min，48%A；65min，23%A）；ELSD检测器，流速1.0mL/min，柱温30℃。建立了知母HPLC-ELSD指纹图谱共有模式，确定6个共有峰，该指纹图谱只指认了知母皂苷AⅢ成分，没有反映双苯吡酮类成分的信息。
韩丽萍等（韩丽萍,陈行愉,徐爱娟.知母甾体总皂苷的HPLC-ELSD指纹图谱研究,时珍国医国药.2012,23(1):21-23）公开了知母甾体总皂苷的HPLC-ELSD指纹图谱研究，其色谱条件为，Agilent HC-C18(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱，甲醇（A）-水（B）为流动相，梯度洗脱；ELSD检测器，流速1.0ml·min-1，漂移管温度40℃。该图谱标定了15个共有峰，但是确定的有些共有峰的峰高和峰面积太小，与基线几乎重合，分离度还有待改进，并且该指纹图谱只指认了知母皂苷BⅡ成分。
可维等（可维，马春辉，张如隽等，不同来源知母药材HPLC-ELSD指纹图谱的研究，《药物分析杂志》，2008，28（1）：100-103）公开了知母药材的HPLC-ELSD的指纹图谱研究，其中其色谱条件为：DiamonsilTM C18(200mm×4.6mm，5μm)色谱柱，乙腈（A）-0.5%甲 酸水溶液（B）为流动相，梯度洗脱（0-10min，5%A→20%A；10-15min，20%A→23%A，15-25min，23%A，25-50min，23%A→100%A；50-60min100%A），流速0.8mL/min；柱温25℃。ELSD检测器：漂移管温度110℃，雾化气体流速2.6L/min。最终的指纹图谱结果指认了知母皂苷BⅡ、知母皂苷BⅢ、anemarrhenasaponin Ⅰa、schidigera-saponinF2和知母皂苷AⅢ5个色谱峰，确定了8个共有峰，其指纹图谱体现了皂苷类成分的特征，没有反映出知母中另一重要化学成分双苯吡酮类成分的信息。
综上所述的知母指纹图谱的色谱峰分离度还有待改进，样品内各组分应尽可能得到分离。此外,对色谱峰尽可能多地进行鉴定或指认以及在色谱图上明确反映出已知的药效成分，才能作为评价色谱结果的重要考察因素。
发明内容
本发明的目的是解决目前知母药材质量评价和成分分析中不能较全面综合反映和控制知母药材整体质量的问题，从而提供一种知母药材的HPLC-ELSD指纹图谱分析方法，包含色谱条件、供试品溶液的制备、对照品溶液的制备。
本发明提供的知母药材HPLC-ELSD指纹图谱的建立方法，该方法包括供试品溶液的制备、对照品溶液的制备、色谱条件和检测。
优选地，所述色谱条件为：色谱条件：Thermo C8色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：乙腈（A）-0.2%醋酸水(B)溶液梯度洗脱；柱温:20℃；流速:1mL·min-1；ELSD检测器，雾化器气体（纯空气）流速：2.6L·min-1；漂移管温度：100℃；进样量：20ul。
所述流动相按照梯度洗脱梯度为：
| 时间（分钟） | 流动相A(%) | 流动相B(%) |
| 0 | 5 | 95 |
| 5 | 7 | 93 |
| 5.01 | 15 | 85 |
| 15 | 15 | 85 |
| 15.01 | 22 | 78 |
| 36 | 22 | 78 |
| 36.01 | 35 | 65 |
| 43 | 35 | 65 |
| 43.01 | 40 | 60 |
| 51 | 50 | 50 |
| 51.01 | 100 | 0 |
| 60 | 100 | 0 |
具体的，所述建立方法包括以下步骤：
1）供试品溶液的制备：取过四号筛的知母药材粉末约1.0克，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入浓度为50%的乙醇25ml，称定重量；以功率为400W，频率为40kHz超声30min；放冷，再称定重量，用50%乙醇补足减失的重量，摇匀；滤过，取续滤液，0.45um针头微孔过滤器过滤，作为供试品溶液；
2）对照品溶液的制备：分别称取知母皂苷BⅡ、知母皂苷AⅢ、芒果苷、新芒果苷、知母皂苷C适量，加50%乙醇配制成每ml溶液中分别含有知母皂苷BⅡ、知母皂苷AⅢ、芒果苷、新芒果苷、知母皂苷C为0.267mg、0.115mg、0.098mg、0.195mg、0.142mg的混合对照品溶液，摇匀，备用；
3）色谱条件：Thermo C8色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：乙腈（A）-0.2%醋酸水(B)溶液梯度洗脱；柱温:20℃；流速:1mL·min-1；ELSD检测器，雾化器气体（纯空气）流速：2.6L·min-1；漂移管温度：100℃；进样量：20ul；
上述方法中：所述流动相按照梯度洗脱梯度为：
| 时间（分钟） | 流动相A(%) | 流动相B(%) |
| 0 | 5 | 95 |
| 5 | 7 | 93 |
| 5.01 | 15 | 85 |
| 15 | 15 | 85 |
| 15.01 | 22 | 78 |
| 36 | 22 | 78 |
| 36.01 | 35 | 65 |
| 43 | 35 | 65 |
| 43.01 | 40 | 60 |
| 51 | 50 | 50 |
| 51.01 | 100 | 0 |
| 60 | 100 | 0 |
本发明还提供了上述方法建立的知母药材HPLC-ELSD指纹图谱。
所述指纹图谱中有12个共有峰，保留时间分别为：1号峰（4.248min），2号峰（9.82min），3号峰（11.446min），4号峰（19.416min），5号峰（22.212min），6号峰（25.069min），7号峰（32.463min），8号峰（33.855min），9号峰（41.884min），10号峰（47.597min），11号峰（50.726min），12号峰（54.153min）。其中2为新芒果苷；3为芒果苷；7为知母皂苷BⅡ；8为知母皂苷C；12为知母皂苷AⅢ。
所述的12个共有峰中，以知母皂苷BⅡ为内参比峰，峰面积占总峰面积5%的峰相对保留时间的标准偏差RSD小于3%，相对峰面积标准偏差RSD均小于3%。
与现有技术相比，本发明提供的知母药材HPLC-ELSD指纹图谱的建立方法及其标准指纹图谱具有以下优点：
（1）本发明筛选出合适的知母药材化学成分提取方法和HPLC-ELSD色谱条件，对ELSD检测器的各项参数进行了选择，最终确定了最优的参数条件，采用梯度洗脱方法在60min内获得了较好分离效果的特征图谱，确定12个主要特征峰作为共有峰，建立了能够使多数化学成分色谱分离的知母药材HPLC-ELSD指纹图谱方法。
（2）在分析过程中，首次对芒果苷、新芒果苷、知母皂苷BⅡ、知母皂苷AⅢ、知母皂苷C同时进行了指认，克服了在以往的研究报道中知母HPLC指纹图谱中无法反映皂苷类成分的信息的不足以及知母药材HPLC-ELSD指纹图谱中双苯吡酮类成分没有分离和鉴定的缺陷。
（3）该指纹图谱特征性较强，主要共有峰达到了较好的基线分离。
（4）供试品的制备简便，方便易行，色谱条件容易实现。
（5）经方法学考察，建立的知母药材HPLC-ELSD指纹图谱方法符合指纹图谱的要求，该方法的稳定性和重现性都比较好。
（6）建立的知母药材HPLC-ELSD指纹图谱更具专属性和代表性，该指纹图谱共有模式图基本能够综合反映知母药材药材整体性的化学成分特征。
（7）适用于知母药材真伪、产地和品质的鉴别和质量控制。
附图说明
图1：知母药材HPLC-ELSD指纹图谱，纵坐标为响应值（单位为毫伏（简写为mV）），横坐标为时间（单位为分钟（简写为min）），其中：2为新芒果苷；3为芒果苷；7为知母皂苷BⅡ；8为知母皂苷C；12为知母皂苷AⅢ。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1：知母药材HPLC-ELSD指纹图谱分析方法的建立
1、仪器、试药与实验材料
安捷伦1100液相色谱仪，配有二元高压溶剂系统、自动进样恒温箱样品管理器、柱温箱、ALLTECH2000ES蒸发光散射检测器；台式系列数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。十万分之一电子分析天平（德国Sartorius CP225D）。
知母皂苷BⅡ标准对照品（上海融禾生物科技公司提供，批号：120926含量>98%），知母皂苷AⅢ标准对照品（上海融禾生物科技公司提供，批号：121022含量>98%），芒果苷标准对照品（上海融禾生物科技公司提供，批号：110910含量>98%），新芒果苷标准对照品（上海融禾生物科技公司提供，批号：110920含量>98%）；知 母皂苷C为北京中医药大学中药学院中药资源系实验室分离制备，经红外、质谱及核磁鉴定和纯度检查，其含量>98%。乙腈（色谱纯，美国fisher公司），其它试剂均为分析醇，娃哈哈纯净水。
知母药材经中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所王文全教授鉴定为百合科植物知母Anemarrhena asphodeloide Bunge.的根茎。
2、供试品溶液的制备
取知母药材粉末（过四号筛）约1.0克，精密称定。置具塞锥形瓶中，精密加入50％乙醇25ml，称定重量。超声30min（功率400W，频率40kHz）。放冷，再称定重量，用50％乙醇补足减失的重量，摇匀。滤过，取续滤液，0.45um针头微孔过滤器过滤，作为供试品溶液。
3、对照品溶液的制备
分别称取知母皂苷BⅡ、知母皂苷AⅢ、芒果苷、新芒果苷适量，加50%乙醇配制成混合对照品溶液，摇匀，备用。
4、色谱条件
Thermo C8色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：乙腈（A）-0.2%醋酸水(B)溶液梯度洗脱，见表1；柱温：20℃；流速：1mL·min-1；ELSD检测器雾化器（空气）流速：2.6L·min-1；漂移管温度:100℃；进样量：20ul。
表1：流动相洗脱梯度
| 时间（分钟） | 流动相A(%) | 流动相B(%) |
| 0 | 5 | 95 |
| 5 | 7 | 93 |
| 5.01 | 15 | 85 |
| 15 | 15 | 85 |
| 15.01 | 22 | 78 |
| 36 | 22 | 78 |
| 36.01 | 35 | 65 |
| 43 | 35 | 65 |
| 43.01 | 40 | 60 |
| 51 | 50 | 50 |
| 51.01 | 100 | 0 |
| 60 | 100 | 0 |
5、精密度试验
取同一份供试品（河北易县），按照供试品的制备方法和色谱条件连续进样6次，按照2供试品的制备方法和3色谱条件进行检测，以知母皂苷BⅡ峰为内参比峰，计算占总峰面积5%以上峰的相对保留时间和峰面积，结果显示相对保留时间和峰面积的RSD均小于3%，符合指纹图谱技术要求。通过“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”2010版软件计算6次之间的相似度，色谱指纹图谱与其所得对照指纹图谱的相似度为0.999-1.000。
结果表明：仪器精密度良好。
6、稳定性试验
取同一份供试品（河北易县）溶液，分别在0h，2h，4h，8h，12h，24h共6个时间点，按照供试品的制备方法和色谱条件进行检测，以知母皂苷BⅡ峰为内参比峰，计算占总峰面积5%以上峰的相对保留时间和峰面积，结果表明，占总峰面积5%以上峰的相对峰面积和保留时间的RSD均小于3%；通过“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”2010版软件计算相似度，色谱指纹图谱与其所得对照指纹图谱的相似度在0.999～1.000。
结果表明：知母药材在24小时内稳定。
7、重复性试验
取同一供试品（河北易县）6份，按照3.3.2供试品的制备方法和3.3.3项下色谱条件进行检测，以知母皂苷BⅡ峰为内参比峰，计算占总峰面积5%以上峰的相对保留时间和峰面积。
结果表明，占总峰面积5%以上峰的相对峰面积和保留时间的RSD均小于3%。通过“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”2010版软件计算6份供试品溶液的相似度，色谱指纹图谱与其所得对照指纹图谱的相似度为1.000。
8、知母药材指纹图谱的建立
根据上述液相色谱条件，分别精密吸取对照品溶液及供试品溶液（河北易县）各20ul，注入液相色谱仪，记录60min内的色谱峰，色谱图见图1。
图1结果显示：同时以对照品的图谱进行比对，确认了2号峰为新芒果苷，3号峰为芒果苷，7号峰为知母皂苷BⅡ，8号峰为知母皂苷C，12号峰为知母皂苷AⅢ。
按上述确定的供试品制备方法进行样品分析，将15个不同批次的知母药材供试品的HPLC-ELSD色谱图，通过“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”2010版软件，将峰面积较大、分离度较好的色谱峰进行标定，确定12个主要特征峰作为共有峰，保留时间分别为1号（4.248min），2号（9.82min），3号（11.446min），4号（19.416min），5号（22.212min），6号（25.069min），7号（32.463min），8号（41.884min），9号（47.597min），10号（50.726min），11号（53.302min），12号（54.153min）。
根据15个不同批次的知母药材供试品的HPLC-ELSD色谱图，对照指纹图谱生成法，通过“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”2010版软件，计算各药材样品的HPLC-ELSD图谱与生成对照指纹图谱之间的相似度，结果见表2。
表2：15批知母药材药材HPLC-ELSD指纹图谱相似度
由表2知母药材HPLC-ELSD指纹图谱相似度可知：15个不同批次的知母药材HPLC-ELSD指纹图谱的相似度>0.97以上。
实验结果表明：知母药材整体性的化学成分特征相似。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (1)
1.知母药材HPLC-ELSD指纹图谱的建立方法，包含色谱条件、供试品溶液的制备、对照品溶液的制备，其特征在于，该方法包括以下步骤：
供试品溶液的制备：取过四号筛的知母药材粉末约1.0克，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入浓度为50％的乙醇25ml，称定重量；以功率为400W，频率为40kHz超声30min；放冷，再称定重量，用50％乙醇补足减失的重量，摇匀；滤过，取续滤液，0.45um针头微孔过滤器过滤，作为供试品溶液；
对照品溶液的制备：分别称取知母皂苷BⅡ、知母皂苷AⅢ、芒果苷、新芒果苷、知母皂苷C适量，加50％乙醇配制成每ml溶液中分别含有知母皂苷BⅡ、知母皂苷AⅢ、芒果苷、新芒果苷、知母皂苷C为0.267mg、0.115mg、0.098mg、0.195mg、0.142mg的混合对照品溶液，摇匀，备用；
色谱条件为：Thermo C8色谱柱4.6mm×250mm，5μm；流动相：乙腈-0.2％醋酸水溶液梯度洗脱；柱温:20℃；流速:1mL·min-1；ELSD检测器雾化器流速：2.6L·min-1；漂移管温度：100℃；进样量：20μL；流动相按照梯度洗脱梯度变化为：
测定：分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液注入液相色谱仪，测定所有供试品。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310177411.3A CN103267818B (zh) | 2013-05-14 | 2013-05-14 | 知母药材hplc-elsd指纹图谱的建立方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310177411.3A CN103267818B (zh) | 2013-05-14 | 2013-05-14 | 知母药材hplc-elsd指纹图谱的建立方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103267818A CN103267818A (zh) | 2013-08-28 |
| CN103267818B true CN103267818B (zh) | 2014-10-22 |
Family
ID=49011457
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201310177411.3A Expired - Fee Related CN103267818B (zh) | 2013-05-14 | 2013-05-14 | 知母药材hplc-elsd指纹图谱的建立方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103267818B (zh) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105974014A (zh) * | 2016-05-04 | 2016-09-28 | 广州市香雪制药股份有限公司 | 知母的一测多评检测方法 |
| CN107643343B (zh) * | 2016-12-30 | 2020-06-16 | 天津同仁堂集团股份有限公司 | 一种玉女煎标准汤的hplc指纹图谱测定方法 |
| CN109187820B (zh) * | 2018-11-09 | 2021-07-23 | 湖南国华制药有限公司 | 一种复方菝葜颗粒uplc指纹图谱的建立方法 |
| CN109917044A (zh) * | 2019-04-10 | 2019-06-21 | 成都中医药大学 | 桂枝芍药知母汤的检测方法 |
| CN111289678A (zh) * | 2020-03-31 | 2020-06-16 | 成都市食品药品检验研究院 | 一种基于uplc-qqq-ms/ms法的知母质量检测方法 |
| CN114965747B (zh) * | 2022-04-28 | 2023-10-03 | 广东一方制药有限公司 | 石膏-知母药对中药配方颗粒指纹图谱的构建方法及指标成分含量的检测方法 |
| CN118376710A (zh) * | 2024-04-19 | 2024-07-23 | 贵州富华药业有限责任公司 | 一种包含淫羊藿的中药复方hplc-elsd指纹图谱构建方法及其应用 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2285394A4 (en) * | 2008-04-11 | 2012-03-07 | Bionovo Inc | ESTROGENIC EXTRACTS OF ANEMARRHENA ASPHODELOIDES BGE FROM THE LILIACEAE FAMILY AND ITS USES |
| CN102749407B (zh) * | 2011-04-19 | 2016-09-28 | 河北以岭医药研究院有限公司 | 一种中药组合物中知母皂苷bⅱ的含量测定方法 |
-
2013
- 2013-05-14 CN CN201310177411.3A patent/CN103267818B/zh not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103267818A (zh) | 2013-08-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103267818B (zh) | 知母药材hplc-elsd指纹图谱的建立方法 | |
| CN101991661A (zh) | 含白芍、人参、丹参、青蒿、甘草、川芎和当归中至少两种的中成药的检测方法 | |
| CN103969352B (zh) | 一种大黄药材的指纹图谱的鉴别方法 | |
| CN106353417A (zh) | 一种云南重楼或其多芽品系中多种甾体皂苷的uplc检测方法 | |
| CN107843657A (zh) | 通窍鼻炎片的质量检测方法 | |
| CN101966223A (zh) | 一种复方扶芳藤制剂的指纹图谱检测方法 | |
| CN110441413B (zh) | 千柏鼻炎片hplc指纹图谱的构建方法和检测方法 | |
| CN109187810B (zh) | 一种治疗类风湿性关节炎中药组合物的检测方法 | |
| CN102879516B (zh) | 补阳还五汤的鉴别和含量测定方法 | |
| CN101791366A (zh) | 一种对不同产地穿龙薯蓣及同属药材进行质量检测的方法 | |
| CN109856270A (zh) | 一种用高效液相色谱法同时测定华盖散配方颗粒中7个指标成分的方法 | |
| CN104614450A (zh) | 一种消渴清制剂的指纹图谱检测方法 | |
| CN109632995A (zh) | 一种酸枣仁黄酮类成分uplc指纹图谱的建立方法及应用 | |
| CN108872417A (zh) | 一种指纹图谱的构建方法及hplc指纹图谱 | |
| CN107807190A (zh) | 一种测定雪胆中3种活性成分的hplc方法 | |
| CN105004833A (zh) | 一种治疗急性痛风性关节炎、痛风的中药制剂的检测方法 | |
| CN108152431A (zh) | 一种红景天破壁饮片hplc指纹图谱的构建方法及质量检测方法 | |
| CN103969356B (zh) | 一种丹参药材的指纹图谱的鉴别方法 | |
| CN107422047A (zh) | 独龙重楼的鉴别方法 | |
| CN103969355A (zh) | 一种黄芪药材的指纹图谱的鉴别方法 | |
| CN108693289B (zh) | 一种人字果药材中木兰花碱的含量测定方法 | |
| CN106872616A (zh) | 区分大理重楼和云南重楼的方法 | |
| CN103293261A (zh) | 白及药材的含量测定方法 | |
| CN101354381A (zh) | 一种枇杷叶药材的质量评价方法 | |
| CN108362800A (zh) | Hplc指纹图谱的构建方法及hplc指纹图谱 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: GUIYANG COLLEGE OF TRADITIONAL CHINESE MEDICINE Free format text: FORMER OWNER: ZHONG KE Effective date: 20150119 |
|
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: ADDRESS; FROM: 550001 GUIYANG, GUIZHOU PROVINCE TO: 550025 GUIYANG, GUIZHOU PROVINCE |
|
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20150119 Address after: 550025 South Tsing Cheng Road, University Town, Guiyang, Guizhou Patentee after: Guiyang College of Traditional Chinese Medicine Address before: Gong Xiang Tong Hui building Yunyan District 550001 Guizhou province Guiyang city Wenchang Road No. 33 Hua 5-1 room Patentee before: Zhong Ke |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20141022 Termination date: 20170514 |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |