CN109187820B - 一种复方菝葜颗粒uplc指纹图谱的建立方法 - Google Patents

一种复方菝葜颗粒uplc指纹图谱的建立方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种复方菝葜颗粒UPLC指纹图谱的建立方法及其指纹图谱与应用，其包括以下步骤：(1)样品的制备：①供试品溶液配制；②混合对照品溶液配制；(2)复方菝葜颗粒提取物UPLC指纹图谱：将供试品溶液和混合对照溶液，各取2μL，分别注入UPLC色谱分析，在设定色谱条件进行测定，记录38min的色谱图，得到指纹图谱。本发明建立了复方菝葜颗粒的UPLC指纹图谱，与HPLC相比UPLC在保证复方菝葜颗粒提取物获得良好的分离的同时大大缩短了其指纹图谱分析时间。本发明的复方菝葜颗粒的指纹图谱成分保留完整，具有18个共有峰，且对其进行了指认和归属分析，各特征峰分离效果较好，能够较全面的反映出产品的质量信息，有利于全面监控产品质量，及鉴别产品的真伪。

Description

一种复方菝葜颗粒UPLC指纹图谱的建立方法
技术领域
本发明属于中药指纹图谱分析技术领域，具体涉及一种复方菝葜颗粒UPLC指纹图谱的建立方法。
背景技术
指纹图谱是指某些复杂物质，比如中药，某种生物体或某种组织或细胞的DNA，蛋白质经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示其化学特征的色谱图或光谱图。中药指纹图谱是一种综合的，可量化的鉴定手段，它是建立在中药化学成分系统研究的基础上，主要用于评价中药材以及中药制剂质量的真实性、优良性和稳定性。中药及其制剂均为多组分复杂体系，因此评价其质量应采用与之相适应的，能提供丰富鉴别信息的检测方法，建立中药指纹图谱将能较为全面地反映中药及其制剂中所含化学成分的种类与数量，进而对药品质量进行整体描述和评价。近年来，指纹图谱技术具有特征性强、专属性高、重现性好等优，已成功应用于评价植物药或中药质量的批次间稳定性。
复方菝葜颗粒(compound rhizomasmilacinus granule，CRSG)是“湖南国华制药有限公司”具有告知只是产权的的独家抗肿瘤制剂，由菝葜、鱼腥草、猫爪草、款冬花、土鳖虫、枸杞子、大枣七味药和鲜鳢鱼组成，为临床癌症辅助治疗的常用药，具有清热解毒、软坚散结、滋阴益气等功效。该方组方精妙、疗效显著，方中菝葜、鱼腥草功善清热解毒、消痈排脓；猫爪草与土鳖虫配伍以软坚散结见长；枸杞子、大枣七味药和鳢鱼能补中益气、滋补生肌；款冬花则润肺下气，止咳化痰。全方合用，攻补兼施，标本同治，祛邪而不伤正，补虚而不滞腻，药性平和而又具有显著抗肿瘤作用。研究表明，CRSG具有抗炎、镇痛、抗氧化、抗肿瘤和增强机体免疫等活性，适宜于改善非小细胞肺癌、子宫颈癌伴有咳嗽、胸痛、带下异常等症状，可供多种癌症辅助治疗运用。现代药理研究表明，复方菝葜颗粒可能通过①提高或调节患者的细胞免疫功能，②上调Bax和P53mRNA基因表达，下调Bcl-2基因表达从而诱导肿瘤细胞凋亡等多途径，多靶点治疗中晚期非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer ，NSCLC）。
目前，关于复方菝葜颗粒质量控制的报道主要为对其君药菝葜中落新妇苷成分的含量测定。而在药效学研究的基础上，对其全方的化学成分分析和指纹图谱的研究报道甚少，难以建立全面有效地复方菝葜颗粒质量控制标准，而且目前指纹图谱主要置于质量控制相关，并未将色谱指纹峰的某些特征组分与治疗功效关联起来。
发明内容
本发明的目的是提供一种复方菝葜颗粒UPLC指纹图谱的建立方法及其指纹图谱与应用，建立全面有效地复方菝葜颗粒质量控制标准并将色谱的指纹峰与治疗功效关联起来。
本发明这种复方菝葜颗粒UPLC指纹图谱的建立方法，包括以下步骤：
（1）样品的制备
①供试品溶液配制：精密称取批复方菝葜颗粒1.0g，加甲醇定容至10 mL，密闭，超声溶解，放冷，甲醇补足失重，摇匀，滤过，取滤液用0.22μm滤膜滤过，得到供试品溶液；
②混合对照品溶液配制：取绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、异槲皮苷、金丝桃苷、落新妇苷、3,4-二咖啡酰奎宁酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸，4,5-二咖啡酰奎宁酸对照品适量，加适量甲醇制成含绿原酸90 μg/mL、新绿原酸102.7 μg/mL、隐绿原酸72.8μg/mL、金丝桃苷101.8μg/mL、落新妇苷133μg/mL、异槲皮苷104.8μg/mL、3,4-二咖啡酰奎宁酸217.8μg/mL、3,5-二咖啡酰奎宁酸93.2μg/mL，4,5-二咖啡酰奎宁酸95.5μg/mL的混合对照溶液；
（2）复方菝葜颗粒提取物UPLC指纹图谱
将步骤1）中的供试品溶液和混合对照溶液，各取2μL，分别注入UPLC色谱分析，按照以下色谱条件进行测定，记录38 min的色谱图，得到指纹图谱；
色谱条件为：色谱柱为EC-C18(3.0mm×50 mm，2.7 μm)；检测波长280 nm；柱温25℃；体积流量0.6 ml/min；进样量2 ul；流动相为A为甲醇，流动相B为0.3%甲酸水；
梯度洗脱：
0~2 min，2%A，98%B； 2~5min，2%~7%A，93%~98 %B；
5~12min，7%~11%A，89%~93% B；12~15min，11%~14%A，86%~89%B；
15~17min，14%~16%A，84%~86% B；17~18min，16%~18%A，82%~84%B；
18~20min，18%~20%A，80%~82% B；20~21min，20%~24%A，76%~80%B；
21~24min，24%~26%A，74%~76%B；24~28min，26%~28%A，72%~74%B；
28~29min，28%A，72%B；29~30min，28%~31%A，69%~72%B；
30~35min，31%~48%A，52%~69%B；35~38min，48%A，52%B。
根据所述的指纹图谱的建立方法得到复方菝葜颗粒的UPLC指纹图谱。
所述的复方菝葜颗粒的指纹图谱共含有18个指纹峰，其相对保留时间分别为：
1号峰： 2.52； 2号峰：2.746；3号峰：3.627；4号峰：4.732；
5号峰：5.826；6号峰：6.439；7号峰：7.943；8号峰：10.033；
9号峰：11.083；10号峰：12.509；11号峰：13.975；12号峰：22.977；
13号峰：25.635；14号峰：26.459；15号峰：27.064；16号峰：27.064；
17号峰：28.881；18号峰31.977。
所述的指纹峰的归属的鉴定方法，包括以下步骤：
1）配制阴性对照溶液：分别称取缺菝葜15g、鱼腥草15g、猫爪草15g、枸杞子15g、大枣（去核）15g、款冬花5g、土鳖虫5g，分别进行煎煮，煎煮过程中第一次加940ml水（煎煮1.5h），第二次加752mL水（煎煮1h），合并煎液，浓缩，利用冷冻干燥仪干燥，得浸膏，接着将浸膏配置成含生药量为2.03mg/ml的溶液，得到6种阴性对照溶液；
2）将步骤1）中的6种阴性对照溶液按照上述的色谱条件，分别进行UPLC色谱分析，得到6种阴性对照溶液的图谱，将指纹图谱与阴性对照溶液的图谱进行比对，即可确定指纹峰的归属。
所述的指纹图谱中的指纹峰2、4、5、7、8、10、12~16号峰来自菝葜，2号峰来自鱼腥草，1、3、9号峰来自猫爪草，5、7、9、13、14、17、18号峰来自款冬花，1和6号峰来自枸杞子，11号峰来自大枣；由于鲜鳢鱼主要由蛋白质和微量元素组成，难以用液相进行测试。
所述指纹峰对应的活性组份的鉴定方法，包括以下步骤：
将供试品溶液和混合对照品溶液，在以下测试条件下，进行UPLC-ESI-MS负离子模式进行化学成分分析，即可鉴定指纹峰对应的活性成分；
测试条件为：电喷雾离子源（ESI）；负离子模式扫描；毛细管电压4000 V；离子源温度350 ℃；雾化器压力276 kPa；干燥器体积流量6 L/min；锥孔65 V；干燥器温度350℃；碎片电压110 V；质量数扫描范围m/z 100~1000；采样频数0.1 s，间隔0.02 s；碰撞能量分别采用15 eV。测量样品前，使用调谐液校准质量轴，以保证质量精准度误差小于1×10-6。
所述的指纹峰2、4、5、8、10、12、13、14、15、16、18的活性物质分别为对应为原儿茶酸、对羟基苯甲酸、新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、落新妇苷、金丝桃苷、异槲皮素、3,4-二咖啡酰奎宁酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸、4,5-二咖啡酰奎宁酸。
本发明的有益效果：1）本发明首次建立了复方菝葜颗粒的UPLC指纹图谱，与HPLC相比UPLC在保证复方菝葜颗粒（CRSG）提取物获得良好的分离的同时大大缩短了其指纹图谱分析时间。2）本发明的复方菝葜颗粒的指纹图谱成分保留完整，具有18个共有峰，且对其进行了指认和归属分析，各特征峰分离效果较好，能够较全面的反映出产品的质量信息，有利于全面监控产品质量，及鉴别产品的真伪。3）本发明中对复方菝葜颗粒的指纹图谱18个峰中的11峰的所对应的活性成分进行了确认，有效的将指纹峰与治疗功效关联起来，可进一步控制好复方菝葜颗粒的生产质量。
附图说明
图1为实施例1中的UPLC图谱；
图2为实施例2中的UPLC图谱；
图3为实施例3中对应的活性组份的化学结构式；
图4为实施例4中复方菝葜颗粒或落新妇苷对细胞增殖抑制的影响效果图。
具体实施方式
原料来源：复方菝葜颗粒（湖南国华制药有限公司，批号S1：20170901、S2：20170902、S3：20171201、S4：20171202、S5：20180301、S6：20180302、S7：20180303、S8：20180401、S9：20180402、S10：20180403）。
绿原酸对照品（批号：MUST-17030620纯度：HPLC≥99.39%）购自成都曼斯特生物科技有限公司；落新妇苷对照品（批号：1DBG-QHTR 纯度：HPLC≥98%）购自中国食品药品检定研究院；新绿原酸对照品（批号：CHB170914纯度：HPLC≥98%）、隐绿原酸对照品（批号：CHB170828 纯度：HPLC≥98%）、金丝桃苷（批号：CHB160904 纯度：HPLC≥98%）、异槲皮苷（批号：CHB160912 纯度：HPLC≥98%）、3，5-二咖啡酰奎宁酸对照品（批号：CHB171013 纯度：HPLC≥98%）、3，4-二咖啡酰奎宁酸对照品（批号：CHB160725 纯度：HPLC≥98%）、4，5-二咖啡酰奎宁酸对照品（批号：CHB160726纯度：HPLC≥98%）均购自成都克洛玛生物科技有限公司。
甲酸和甲醇均为色谱纯（美国TEDIA公司），其余试剂均为分析纯，水（华润怡宝饮料（长沙）有限公司）。经湖南省中医药研究院中药研究所鉴定，菝葜为百合科植物菝葜Smilax china L . 的干燥根茎；鱼腥草为二白草科植物蕺菜HouttuyniacordataThunb.的新鲜全草或干燥地上部分；猫爪草为毛莨科植物小毛莨Ranunculus ternatusThunb. 的干燥块根；枸杞子为茄科植物宁夏枸杞Lyciumbarbarm L.的干燥成熟果实；大枣为鼠李科植物枣Ziziphusjujuba Mill. 的干燥成熟果实；款冬花为菊科植物款冬TussilagofarfaraL. 的干燥花蕾；土鳖虫为鳖蠊科昆虫地鳖Eupolyphagasinensis Walker或冀地鳖SteleophagaPlancyi (Boleny)的雌虫干燥体。
DMEM培养液、RPMI-1640培养液、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶-EDTA、双抗（青霉素、链霉素）均为美国Gibico公司产品，二甲基亚砜（DMSO）噻唑蓝（MTT）。
设备型号：安捷伦1290 Infinity 型高效液相色谱系统（安捷伦科技公司），配四元泵及在线脱气，紫外检测器；十万分之一电子分析天平（梅特勒-托利多公司）；KM-500DB型超声波清洗器（昆山美美超声仪器有限公司）；冷冻干燥机(宁波双嘉仪器有限公司)；S8PAO型体视显微镜（德国 Leica 公司），CO48R-230型三气细胞培养箱（英国 NewBrunswick Galaxy 公司），超净工作台，酶标仪，25cm2培养瓶，96孔板，细胞计数器。
实施例1 指纹图谱的建立
一、样品溶液的配置
）样品溶液的配置：精密分别称取10批复方菝葜颗粒S1~S10各1.0g，分别加甲醇定容至10mL，密闭，超声溶解（250W，40kHz），放冷，甲醇补足失重，摇匀，滤过，取滤液用0.22μm滤膜滤过，得到S1~S10共10批复方菝葜颗粒的样品溶液。
）混合对照品溶液的配置：取绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、异槲皮苷、金丝桃苷、落新妇苷、3，4-二咖啡酰奎宁酸、3，5-二咖啡酰奎宁酸，4，5-二咖啡酰奎宁酸对照品适量，加适量甲醇制成含绿原酸90 μg/mL、新绿原酸102.7 μg/mL、隐绿原酸72.8μg/mL、金丝桃苷101.8μg/mL、落新妇苷133μg/mL、异槲皮苷104.8μg/mL、3，4-二咖啡酰奎宁酸217.8μg/mL、3，5-二咖啡酰奎宁酸93.2μg/mL，4，5-二咖啡酰奎宁酸95.5μg/mL的混合对照溶液。
二、UPLC指纹图谱的建立
）UPLC液相测试条件：
将样品溶液，各取2μL，分别注入UPLC色谱分析，按照以下色谱条件进行测定，记录38 min的色谱图。
色谱条件为：色谱柱为EC-C18(3.0mm×50 mm，2.7 μm)；检测波长280 nm；柱温25℃；体积流量为0.6 ml/min；进样量为2 ul；流动相为A为甲醇，流动相B为0.3%甲酸水；
梯度洗脱：
0~2 min，2%A，98%B；2~5min，2%~7%A，93%~98%B；
5~12min，7%~11%A，89%~93%B；12~15min，11%~14%A，86%~89%B；
15~17min，14%~16%A，84%~86%B；17~18min，16%~18%A，82%~84%B；
18~20min，18%~20%A，80%~82%B；20~21min，20%~24%A，76%~80%B；
21~24min，24%~26%A，74%~76%B；24~28min，26%~28%A，72%~74%B；
28~29min，28%A，72%B；29~30min，28%~31%A，69%~72%B；
30~35min，31%~48%A，52%~69%B；35~38min，48%A，52%B。
指纹图谱的测定
精密吸取对照品溶液与供试品溶液（S1）注入UPLC色谱仪，按照上述的液相测试条件，得到复方菝葜颗粒UPLC指纹图谱,如图1中的R所示。
）仪器精密度试验
取同一供试品溶液（S1），连续进样6次，进行UPLC测试，记录指纹图谱，选择出峰稳定、峰面积较大、响应值最高、分离度良好的8号峰为参照峰，计算得到各共有峰相对保留时间RSD为1.26%；相对峰面积RSD为1.19%，均低于2%，表明仪器精密度良好。
）重现性试验
分别取供试品溶液（S1）6份，进行UPLC测试，记录指纹图谱，以8号峰为参照峰，计算得到各共有峰相对保留时间RSD为1.78%；相对峰面积RSD为1.25%，均低于2%，表明该方法重复性良好。
）稳定性试验
取同一供试品溶液（S1），分别于0、4、8、12、16、24 h进行检测，记录指纹图谱，以8号峰为参照峰，计算得到各共有峰相对保留时间RSD为1.76%；相对峰面积RSD为1.54%，均低于2%，表明供试品溶液在24h 内稳定性良好。
）复方菝葜颗粒指纹图谱的建立
将S1~S10共10批复方菝葜颗粒的样品溶液，按照上述测试条件，进行UPLC测试，并记录其谱图，其结果如图1所示。测得参照指纹图谱和S1~S10的谱图，共有18个色谱峰，且共有峰总面积占总峰面积的90%。使用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A版）”软件建立并自动匹配来自10批CRSG的提取物指纹图谱，采用中位数法自动生成，计算模拟的均值色谱图作为10个指纹的对照色谱图。结果表明，来自不同批次CRSG样品的UPLC-UV色谱图是相似的。根据参照谱图，计算10批样品的整组色谱图与参照谱图之间的相似性（也使用该软件），相似度结果依次为：0.982、0.997、0.996、0.982、0.997、0.996、0.982、0.986、0.996、0.997。由此可知，各批次制剂共有成分出峰时间大致相同，成分较稳定。
指纹图谱18个峰相对保留时间分别为:
1号峰： 2.52； 2号峰：2.746；3号峰：3.627；4号峰：4.732；
5号峰：5.826；6号峰：6.439；7号峰：7.943；8号峰：10.033；
9号峰：11.083；10号峰：12.509；11号峰：13.975；12号峰：22.977；
13号峰：25.635；14号峰：26.459；15号峰：27.064；16号峰：27.064；
17号峰：28.881；18号峰31.977。
实施例2指纹图谱中共有峰归属
配置阴性对照溶液：分别称取缺菝葜15g、鱼腥草15g、猫爪草15g、枸杞子15g、大枣（去核）15g、款冬花5g、土鳖虫5g，分别进行煎煮，煎煮过程中第一次加940ml水（煎煮1.5h），第二次加752mL水（煎煮1h），合并煎液，浓缩，利用冷冻干燥仪干燥，得浸膏，接着将浸膏配置成含生药量为2.03mg/ml的溶液，得到6种阴性对照溶液
将步骤1）中的6种阴性对照溶液按照上述的色谱条件，分别进行UPLC色谱分析，得到6种阴性对照溶液的图谱，如图2所示，将标准指纹图谱与阴性对照溶液的图谱进行比对，可已看出：通过对全方与药材指纹图谱的相关峰进行指认，确认复方菝葜颗粒UPLC指纹图谱的18个特征峰的来源。7种单味药材对复方菝葜颗粒UPLC指纹图谱均有贡献，其中2、4、5、7、8、10、12~16号峰来自菝葜，2号峰来自鱼腥草，1、3、9号峰来自猫爪草，5、7、9、13、14、17、18号峰来自款冬花，1和6号峰来自枸杞子，11号峰来自大枣。其中不同的单味药材有多个共有峰，表明了中药中成分的复杂性。另一方面，菝葜和款冬花拥有多个不同的共有峰，表明了这2味药对于整个复方的化学成分的重要性。因鲜鳢鱼主要由蛋白质和微量元素组成，在紫外检测器中找不到峰或者峰的响应很低，所以在考虑药材和缺味药材实验中未加入鲜鳢鱼。
实施例3共有峰指认
将供试品溶液和混合对照品溶液，在以下测试条件下，进行UPLC-ESI-MS负离子模式进行化学成分分析，即可鉴定指纹峰对应的活性成分；
测试条件为：电喷雾离子源（ESI）；负离子模式扫描；毛细管电压4000 V；离子源温度350 ℃；雾化器压力276 kPa；干燥器体积流量6 L/min；锥孔65 V；干燥器温度350℃；碎片电压110 V；质量数扫描范围m/z 100~1000；采样频数0.1 s，间隔0.02 s；碰撞能量分别采用15 eV。测量样品前，使用调谐液校准质量轴，以保证质量精准度误差小于1×10-6。
将检测到的保留时间（tR）、质谱信息和裂解规律结合对照品及相关文献数据比对进行化学成分确认，结果见表1，所对应的活性物质的化学结构式如图3所示。
Figure 445462DEST_PATH_IMAGE001
根据表1和图3的结果，化合物（﹣）ESI-MS质谱裂解特征分析如下：
酚酸：色谱峰2和4的tR分别为2.746min和4.732min，负离子模式下准分子离子峰分别为m/z153[M-H]-和137[M-H]-，二者主要质谱碎片均为失去CO2的特征碎片离子，前者出现m/z109[M-H-CO2]-，后者为m/z93[M-H-CO2]-，根据元素组成分析，二者分子式分别为C7H6O4和C7H6O3，据报道菝葜和鱼腥草中存在原儿茶酸和羟基苯甲酸，其相对分子质量分别为：153和137，推测色谱峰2和4可能分别为原儿茶酸和对羟基苯甲酸。研究表明，原儿茶酸是一种有效的抗癌剂，可在人乳腺癌、非小细胞肺癌、宫颈癌、肝癌和前列腺癌这五种癌细胞中引起细胞凋亡或延缓其侵袭和转移。
单咖啡酰奎宁酸：色谱峰5、8、10分别为新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸，tR分别为5.826、10.033和12.509min，负离子模式下准分子离子峰均为m/z353[M-H]-，相对分子质量均为354，各元素生成分子式均为C16H18O9，二级主要质谱碎片均存在失去咖啡酰基的特征碎片离子m/z191[M-H-C9H6O3]-，其中色谱峰5和8还存在丢失奎宁酸的特征碎片离子m/z179[M-H-C7H10O5]-，以及进一步丢失CO2的特征碎片离子m/z135[M-H-C7H10O5-CO2]-。色谱峰10还存在m/z173[M-H-C9H6O3-H2O]-的基峰，通过与隐绿原酸标准品的裂解规律对比一致；色谱峰8还检测到m/z161[M-H-C7H10O5-H2O]-碎片离子，同等质谱条件下与绿原酸标准品的碎片信息一致；色谱峰5的m/z179相对峰强度占基峰m/z191的72%，与新绿原酸标准品的特征碎片一致。据报道，绿原酸和新绿原酸在乳腺癌，结肠癌和U937白血病细胞中具有抗氧化和化学预防活性。
黄酮：色谱峰12的tR=22.977min，负离子模式下产生准分子离子峰m/z449[M-H]-，通过丢失鼠李糖产生m/z303[M-H-C6H10O4]-，m/z303进一步丢失H2O分子裂解成m/285[M-H-C6H10O4-H2O]-，或经Diels–Alder （狄尔斯-阿尔德反应）检测到151[M-H-C6H10O4-H2O-C8H6O2]-，对比标准品鉴别该色谱峰为落新妇苷；落新妇苷能增强顺铂对人肺癌A549细胞凋亡的作用。色谱峰13、14的tR分别为25.635、26.459min，准分子离子为m/z463[M-H]-，其二级扫描裂解产生m/z301[M-H-C6H12O5-H2O]-，分子式为C21H20O12，相对分子质量为464，对比标准品鉴别色谱峰13、14分别为：金丝桃苷、异槲皮素。后者在菝葜和款冬花中均可见报道，前者仅在款冬花中出现。金丝桃苷可诱导人非小细胞肺癌细胞、人骨肉瘤细胞、前列腺癌细胞、人胰腺癌的凋亡，抑制其增殖。
双咖啡酰奎宁酸：色谱峰15、16、18分别为3,4-二咖啡酰奎宁酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸、4,5-二咖啡酰奎宁酸，tR分别为27.064、27.736、31.977min，负离子模式下准分子离子峰均为m/z515[M-H]-，各元素生成分子式均为C25H24O12，丢失咖啡酰基的m/z353[M-H-C9H6O3]-碎片离子，以及单咖啡酰奎宁酸的特征碎片离子m/z191[M-H-C9H6O3]-和m/z179[M-H-C7H10O5]-在这三种化合物的二级碎片均有检测到；色谱峰16、18同时还检测到m/z335[M-H-C9H6O3-H2O]-和m/z173[M-H-2 C9H6O3-H2O]-的特征离子碎片，此外色谱峰16还存在m/z[M-H-C9H6O3-C7H10O5-H2O]-，色谱峰16、18分别与3,5-二咖啡酰奎宁酸、4,5-二咖啡酰奎宁酸标准品相对应。据报道款冬花中含有这三种化学成分，双咖啡酰奎宁酸通过发挥细胞凋亡产生细胞毒性作用，能抑制肠癌细胞的增殖，是一类有前途的低毒性癌症治疗成分。
实施例4 复方菝葜颗粒治疗非小细胞肺癌研究
A549和NCI-H1650细胞分别在含有10%胎牛血清（FBS）及1%双抗（100U/mL青霉素与0.1mg/mL链霉素）的DMEM/F12培养基和含有10%FBS及双抗的RPMI 1640培养基，在37℃和5%CO2条件下培养。每2~3天传代1次，取对数生长期的细胞进行实验。
与正常对照组相比，落新妇苷对A549和NCI-H1650人非小细胞肺癌细胞具有显著的抑制作用，且呈浓度依赖性，（P＜0.01），差异具有统计学意义，结果见图4。与正常组相比，CRSG对A549和NCI-H1650人非小细胞肺癌细胞具有显著的抑制作用，且呈浓度依赖性，（P＜0.01），差异具有统计学意义，结果见图4。复方菝葜颗粒或落新妇苷分别干预细胞72h后IC50值见表2。72h内，细胞被浓度不断增加的CRSG处理，通过MTT法测定细胞毒性。
结果显示，落新妇苷对两种人非小细胞肺癌细胞（A549和NCI-H1650）无选择性具有相近的IC50值，分别为：184.61μmol/L、180.46μmol/L。复方菝葜颗粒对NCI-H1650细胞毒性较A549强，IC50值，分别为：70.52 mg/mL 、43.32 mg/mL。根据上诉结果可知，菝葜的落新妇苷可能为CRSG治疗非小细胞癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)的主要贡献成分；其中落新妇苷对两种细胞的细胞毒性无明显差异，而复方菝葜颗粒对NCI-H1650表现出较强抑制，可能是全方中的各成分共同作用的结果。
Figure 525413DEST_PATH_IMAGE002

Claims (6)

1.一种复方菝葜颗粒UPLC指纹图谱的建立方法，包括以下步骤：
（1）样品的制备
①供试品溶液配制：精密称取批复方菝葜颗粒1.0g，加甲醇定容至10 mL，密闭，超声溶解，放冷，甲醇补足失重，摇匀，滤过，取滤液用0.22μm滤膜滤过，得到供试品溶液；
②混合对照品溶液配制：取绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、异槲皮苷、金丝桃苷、落新妇苷、3,4-二咖啡酰奎宁酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸，4,5-二咖啡酰奎宁酸对照品适量，加适量甲醇制成含绿原酸90 μg/mL、新绿原酸102.7 μg/mL、隐绿原酸72.8μg/mL、金丝桃苷101.8μg/mL、落新妇苷133μg/mL、异槲皮苷104.8μg/mL、3,4-二咖啡酰奎宁酸217.8μg/mL、3,5-二咖啡酰奎宁酸93.2μg/mL，4,5-二咖啡酰奎宁酸95.5μg/mL的混合对照溶液；
（2）复方菝葜颗粒提取物UPLC指纹图谱
将步骤1）中的供试品溶液和混合对照溶液，各取2μL，分别注入UPLC色谱分析，按照以下色谱条件进行测定，记录38 min的色谱图，得到指纹图谱；
色谱条件为：色谱柱为EC-C18：3.0mm×50 mm，2.7 μm；检测波长280 nm；柱温25 ℃；体积流量0.6 ml/min；进样量2 ul；流动相为A为甲醇，流动相B为0.3%甲酸水；
梯度洗脱：
0~2 min，2%A，98%B；2~5min，2%~7%A，93%~98 %B；
5~12min，7%~11%A，89%~93% B；12~15min，11%~14%A，86%~89%B；
15~17min，14%~16%A，84%~86% B；17~18min，16%~18%A，82%~84%B；
18~20min，18%~20%A，80%~82% B；20~21min，20%~24%A，76%~80%B；
21~24min，24%~26%A，74%~76%B；24~28min，26%~28%A，72%~74%B；
28~29min，28%A，72%B；29~30min，28%~31%A，69%~72%B；
30~35min，31%~48%A，52%~69% B；35~38min，48%A，52%B。
2.根据权利要求1所述的复方菝葜颗粒UPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述的指纹图谱共含有18个指纹峰，其相对保留时间分别为：
1号峰： 2.52； 2号峰：2.746；3号峰：3.627；4号峰：4.732；
5号峰：5.826；6号峰：6.439；7号峰：7.943；8号峰：10.033；
9号峰：11.083；10号峰：12.509；11号峰：13.975；12号峰：22.977；
13号峰：25.635；14号峰：26.459；15号峰：27.064；16号峰：27.064；
17号峰：28.881；18号峰31.977。
3.根据权利要求2所述的复方菝葜颗粒UPLC指纹图谱的建立方法建立的指纹图谱的指纹峰归属的鉴定方法，包括以下步骤：
1）配制阴性对照溶液：分别称取缺菝葜15g、鱼腥草15g、猫爪草15g、枸杞子15g、大枣去核15g、款冬花5g、土鳖虫5g，分别进行煎煮，煎煮过程中第一次加940ml水，煎煮1.5h，第二次加752mL水，煎煮1h，合并煎液，浓缩，利用冷冻干燥仪干燥，得浸膏，接着将浸膏配置成含生药量为2.03mg/ml的溶液，得到6种阴性对照溶液；
2）将步骤1）中的6种阴性对照溶液按照上述的色谱条件，分别进行UPLC色谱分析，得到6种阴性对照溶液的图谱，将指纹图谱与阴性对照溶液的图谱进行比对，即可确定指纹峰的归属。
4.根据权利要求3所述的鉴定方法，其特征在于，所述的指纹峰2、4、5、7、8、10、12~16来自菝葜，指纹峰2来自鱼腥草，指纹峰1、3、9来自猫爪草，指纹峰5、7、9、13、14、17、18来自款冬花，指纹峰1和6来自枸杞子，指纹峰11来自大枣。
5.根据权利要求2所述的复方菝葜颗粒UPLC指纹图谱的建立方法建立的指纹峰对应的活性组份的鉴定方法，包括以下步骤：
将供试品溶液和混合对照品溶液，在以下测试条件下，进行UPLC-ESI-MS负离子模式进行化学成分分析，即可鉴定指纹峰对应的活性成分；
测试条件为：电喷雾离子源ESI；负离子模式扫描；毛细管电压4000 V；离子源温度350℃；雾化器压力276 kPa；干燥器体积流量6 L/min；锥孔65 V；干燥器温度350℃；碎片电压110 V；质量数扫描范围m/z 100~1000；采样频数0.1 s，间隔0.02 s；碰撞能量分别采用15eV，测量样品前，使用调谐液校准质量轴，以保证质量精准度误差小于1×10-6。
6.根据权利要求5所述的鉴定方法，其特征在于，指纹峰2、4、5、8、10、12、13、14、15、16、18的活性物质分别为对应为原儿茶酸、对羟基苯甲酸、新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、落新妇苷、金丝桃苷、异槲皮素、3,4-二咖啡酰奎宁酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸、4,5-二咖啡酰奎宁酸。
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